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문제 정의
- 있다. 또한 지유에 관한 연구는 그 성분, 항균, 항암에 관한 보고가 있으나 아직 미미한 실정이므로 본 연구는 한약재 중 지유가 가지는 생리활성에 관해 연구함과 동시에 특히 지유의 추출물을 발효하였을 때 나타나는 항균 및 항산화 활성 연구하여 천연보존제 및 항산화 효과 등에 적용 가능성을 검토해 보기 위해 수행하였다.
- 이에 본 연구는 지유 추출물을 S. thermophilus로 발효하여 병원성과 독소생산으로 피부의 염증 유발시키는 피부 생재균이며 식품부패 및 독소생성 식중독과 관련 있는 그람양성 세균 B. cereus, B. subtilis 및 S. aureus 등 3종과 장염 및 식중독과 관련된 그람음성세균 V. parahaemolyticus, E. coli 및 S. typhymurinum에 대한 항세균활성을 확인하였다. S.
- 천연식품보존제 및 항산화제 개발의 기초자료를 확보하고자 S. thermophilus를 이용한 지유 발효물에서 항균 및 항산화 활성을 관찰한 바 다음과 같은 결과를 나타내었다.
가설 설정
- 3) The same letters indicate Duncan's multiple range grouping which do not differ significantly at 5% level. Dilution degree was 10 fold.
제안 방법
- 시료 1mg을 95% 에탄올 1mL에 용해시키고 Folin- Ciocalteau 1mL를 첨가하여 27℃ 수욕 조에서 혼합하였다. 5분 정도 경과 후 10% Na2CO3 용액 1mL를 가하여 혼합하고 실온에서 1시간 동안 반응 후 분광광도계(UV/VIS spectrophotometer, Shimadzu Co., Japan)를 사용하여 725㎚에서 흡광도를 측정하고, 표준물질 tannic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였다.
- S. thermophilus를 이용하여 발효한 후 그람양성 세균인 B. cereus(BC), B. subtilis(BS), S. aureus(SA), 그람음성 세균인 E. coli(EC), S. typhimurium(ST), V. parahaemolyticus (VP) 등 6종의 식품부패균 및 식중독균에 대한 항세균 활성을 조사하였다. 그 결과 BS, EC, ST 및 VP에 대해서는 비발효물과 발효물의 항세균활성이 차이가 없었으나, BC, SA에 대한 항세균활성은 비발효물이 발효물보다 조금 더 있었으나, 전반적으로 지유 추출물의 항세균활성은 그리 높지는 않았다(Table 1).
- 직경 9cm인 petri dish에 20mL 의 배지를 분주한 평판배지 위에 각 균주의 활성화 된 배양액 100µL를 처리한 다음 삼각 유리막대로 배지 위에 골고루 퍼지도록 도말하였다. 동결 건조시킨 다음 보관된 시료의 분말을 살균수로 희석하여 1%, 2%, 5% 및 10% 농도로 조제한 후 0.45㎛인 membrane filter를 통과 시킨 다음 멸균된 paper disc에 흡수시켰다. 이것을 균주가 도말된 plate 표면에 올려놓은 후 V.
- 5mL를 첨가하여 혼합 후 실온에서 15분간 방치시켰다. 반응시킨 시료를 분광광도계를 사용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 Griess 시약 대신 증류수를 0.
- 각 시료의 환원력을 측정하였다. 에탄올에 용해한 100µM의 DPPH 용액 900µL와 시료 용액 100µL를 혼합하여 잘교반한 후 암소에서 30분간 반응시킨 후분광광도계를 사용하여 517㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료 첨가구와 무 첨가구 사이의 흡광도의 차이를 백분율(%)로 나타내었다.
- 45㎛인 membrane filter를 통과 시킨 다음 멸균된 paper disc에 흡수시켰다. 이것을 균주가 도말된 plate 표면에 올려놓은 후 V. parahaemolyticus, E. coli, S. aureus는 37± 1℃, 그리고 B. cereus, B. subtilis, S. typhimurium 는 30±1℃, 48시간 배양시켜 paper disc 주위에 생성된 clear zone(mm)의 직경을 측정하였다.
- 우리나라는 채소류, 곡류, 수산물 등을 이용, 다양한 발효식품을 개발, 섭취해왔다. 이로써 식품의 저장 기간을 늘렸으며, 발효식품속의 미생물에 의해 소화하기 어려운 고분자 영양분을 저분자로 분해하여 소화, 흡수율을 높이고, 새로운 영양성분을 생성해 유용한 성분을 섭취할 수 있게 하였다. 유산균으로 발효시킨 식품들은 장내 정상 세균총의 유지, 부패세균에 의해서 발생된 독성 물질분해, 항암작용, 유당분해, 면역증강작용 및 혈중 콜레스테롤의 저하 등의 기능을 가지고 있으며, 최근 유산균을 이용한 혼합 발효를 통해 콩의 비린 냄새를 완화시키고, 영양적 가치를 높였으며, 두유를 유산균으로 발효함으로서 β-glucosidase, 황산화 활성을 증진시킨다는 보고가 있다36).
- 시킨 후 사용하였다. 직경 9cm인 petri dish에 20mL 의 배지를 분주한 평판배지 위에 각 균주의 활성화 된 배양액 100µL를 처리한 다음 삼각 유리막대로 배지 위에 골고루 퍼지도록 도말하였다. 동결 건조시킨 다음 보관된 시료의 분말을 살균수로 희석하여 1%, 2%, 5% 및 10% 농도로 조제한 후 0.
대상 데이터
- (1) 조효소 조제 : α-Herbzyme 3g에 증류수 100mL를 가하고 50±1℃에서 2시간 침출 한 다음 거즈로 1차 거른 후 여과지로 여과시킨 여액을 조효소액으로 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 지유(Sanguisorba officinalis L.)는 충남 금산 벧엘약업사에서 구입한 후 중부대학교 한방제약과 학과에서 감정하였고, 이용하기 전에 불순물을 제거하고 건조하여 분쇄 후에 4±1℃에서 냉장 보관한 후 추출용 시료로 사용하였다.
- 실험에 사용한 균주는 그람양성균인 Bacillus subtilis KCCM11316, Bacillus cereus KCCM 11204, Staphylococcus aureus KCCM 12256, 그람음성균인 Salmonella typhimurium KCCM 40253, Vibrio parahaemolyticus KCCM 11965, Escherichia coli KCCM 11835로 한국종균협회 한국 미생물 보존센터에서 분양받아 사용하였으며, B. cereus, B. subtilis, E. coli , S. typhimurium는 Nutrient agar, S. aureus는 Trypticasesoy agar 및 V. parahaemolyticus는 3% NaCl이 첨가된 nutrient agar를 배양에 사용하였다.
데이터처리
- 통계처리는 Student's의 t-test과 DMRT(Duncan's Multiple Range Test)에 의해 p<0.05 수준에서 유의성 검정을 하였다.
이론/모형
- SOD 유사활성 측정은 Marklund 와 Marklund의 방법31)에따라 과산화수소로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정하였다. 시료 0.
- 아질산염 소거능은 Kato 등34)의 방법에 따라 측정하였다. 1mM의 NaNO2 용액 1mL에 시료 추출물을 첨가하고 0.
- 전자공여 능은 Blois의 방법32)에 따라 각 추출물의 DPPH (2, 2-diphenyl–1-picrylhydrazyl)에 대한 전자공여 효과로써 각 시료의 환원력을 측정하였다. 에탄올에 용해한 100µM의 DPPH 용액 900µL와 시료 용액 100µL를 혼합하여 잘교반한 후 암소에서 30분간 반응시킨 후분광광도계를 사용하여 517㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법30)을 응용하여 측정하였다. 시료 1mg을 95% 에탄올 1mL에 용해시키고 Folin- Ciocalteau 1mL를 첨가하여 27℃ 수욕 조에서 혼합하였다.
- 총 플라보노이드 함량은 Nieva 등33)의 방법에 의해 측정하였다. 각 시료 100µL를 취하여 10% aluminum nitrate와 1µM potassium acetate를 함유하는 80% ethanol 4.
성능/효과
- 1. 지유 발효물의 B. cereus 와 S. aureus에서 대해 항세균 활성이 있는 것으로 나타났으나 발효유무에 따른 항세균활성에 유의한 차이는 없었다.
- 2. 지유 발효물의 총 폴리페놀 함량은 비발효물 보다 발효물에서 유의하게 증가하였고, 전자공여능과 SOD 유사 활성은 발효 전 후 비슷하였다. 또한 아질산염 소거능은 pH 4.
- S. thermophilus를 이용한 지유 발효물의 SOD 유사활성을 측정한 결과 비발효 및 발효물 모두 약 15% 정도의 유사활성능을 나타내었으며, 비발효물과 발효물 유사활성능의 차이는 없었다(Fig. 2).
- S. thermophilus를 이용한 지유 발효물의 전자공여능을 측정한 결과, 대표적인 항산화제인 vitamin C의 전자공여능과 비교할 때 발효 전 후 모두 90% 이상의 활성을 보여 항산화능이 높은 것으로 나타났으며, 발효 전후의 전자공여능의 변화는 비슷하였다(Fig. 1).
- S. thermophilus를 이용한 지유 발효물의 총 플라보노이드 및 총 폴리페놀 함량을 조사한 결과 총 플라보노이드 함량은 발효에 관계없이 65mg/g 이상의 총 플라보노이드 함량이 있는 것을 관찰할 수 있었으나, 총 폴리페놀 함량에서는 비발효물 보다 발효물에서 약 22mg/g 으로 총 폴리페놀 함량이 유의성 있게 증가하는 결과로 보아 발효처리에 의해 총 페놀성 성분이 고분자 화합물로부터 유리되어 추출이 용이해지고 구조적인 전환이 일어났을 것으로 판단된다. 특이한 것은 본 실험의 결과에서 플라보노이드보다 폴리페놀의 함량이 더 높게 관찰된 점이다.
- S. thermophilus를 이용한 지유 발효물의 총 플라보노이드 및 폴리페놀 함량을 조사한 결과 발효에 관계없이 65 mg/g 이상의 플라보노이드 함량이 있는 것을 관찰할 수 있었으며, 발효물이 비발효물 보다 플라보노이드 함량이 유의성 있게 감소하였고, 총 폴리페놀 함량은 발효물(약 22mg/g)이 비발효물(약 19mg/g)보다 총 폴리페놀 함량이 유의성 있게 증가하였다(Table 3).
- typhymurinum에 대한 항세균활성을 확인하였다. S. thermophilus를 이용한 지유 발효물의 항세균활성을 조사한 결과, 대상균에 따라 다른 결과를 나타내어 B. cereus 와 S. aureus 등 2종에서 항세균 활성이 비교적 높게 나타났으며 발효에 따른 항세균 활성의 유의적 차이는 없었고, 농도별로 비발효물에서는 5%, 발효물에서는 10% 농도에서 항세균활성이 인정되었다. 국내산 야생차는 발효가 많이 진행될수록 녹차에 비하여 항세균활성은 점점 감소하였다는 보고37)와 일치하였다.
- 약간 감소하였지만, 유의한 차이는 없었다. SA에 대해서는 비발효물의 경우 온도가 높아질수록 항세균 활성이 증가하였으나, 발효물에서는 항세균 활성의 차이가 없었다. VP에 대해서는 발효물보다는 비발효물의 항세균 활성이 높았으나, EC와 ST에 대한 비발효물 및 발효물에서 항세균활성이 관찰되지 않았다(Table 2).
- SOD 유사활성을 조사한 결과에서는 발효여부에 관계없이 약 15% 이상의 활성을 나타내었다. 전자공여능과 SOD 유사 활성 모두 발효에 의한 유의적 변화는 없었다.
- SA에 대해서는 비발효물의 경우 온도가 높아질수록 항세균 활성이 증가하였으나, 발효물에서는 항세균 활성의 차이가 없었다. VP에 대해서는 발효물보다는 비발효물의 항세균 활성이 높았으나, EC와 ST에 대한 비발효물 및 발효물에서 항세균활성이 관찰되지 않았다(Table 2).
- parahaemolyticus (VP) 등 6종의 식품부패균 및 식중독균에 대한 항세균 활성을 조사하였다. 그 결과 BS, EC, ST 및 VP에 대해서는 비발효물과 발효물의 항세균활성이 차이가 없었으나, BC, SA에 대한 항세균활성은 비발효물이 발효물보다 조금 더 있었으나, 전반적으로 지유 추출물의 항세균활성은 그리 높지는 않았다(Table 1).
- 2에서 합성산화제인 대조구 (BHT) 보다 높았고, 비발효물 보다 발효물에서 근소한 차이로 아질산염 소거능이 약간 높았다. 또한 pH 4.2에서보다 pH 2.5에서는 70% 이상으로 훨씬 높게 나타났으므로 지유 추출물은 생체 내에서도 효과적일 것으로 예상되었다.
- 지유 발효물의 총 폴리페놀 함량은 비발효물 보다 발효물에서 유의하게 증가하였고, 전자공여능과 SOD 유사 활성은 발효 전 후 비슷하였다. 또한 아질산염 소거능은 pH 4.5에서 보다 pH 2.5에서 높았고, pH 2.5에서는 지유 발효물은 대조구인 BHT보다 발효물에서 70% 이상 유의한 활성을 나타내었다.
- 아질산염 소거능을 조사한 결과 발효여부와 관계없이 pH 2.5 및 4.2에서 합성산화제인 대조구 (BHT) 보다 높았고, 비발효물 보다 발효물에서 근소한 차이로 아질산염 소거능이 약간 높았다. 또한 pH 4.
- 이상의 결과에서, S. thermophilus에 의한 지유 발효물은 총 폴리페놀이 높았고 아질산염 소거능은 대조구인 BHT 보다 높아 항산화 작용이 있음을 확인하였다.
- 전자공여능을 조사한 결과, 대표적인 항산화제인 Vitamin C와 비교할 때 발효여부에 관계없이 90% 이상의 높은 활성을 나타났으며, Rhim41)은 지유의 에탄올 추출물에 대한 DPPH radical 소거 활성을 측정한 결과 1mg/mL 농도에서는 90% 이상의 높은 전자공여능을 나타낸다고 한 보고와 비교하여, 본 연구결과와 유사한 패턴의 결과를 확인할 수 있었다.
- 지유 발효물의 열 안정성을 조사하기 위해 80℃, 100℃ 및 120℃에서 각각 30분간 열처리한 후 생육저해환을 측정한 결과 BC에 대해서는 비발효물의 항세균활성은 열처리 의한 차이가 없었으나, 발효물에서는 온도가 높아질수록 항세균 활성이 약간 감소하였지만, 유의한 차이는 없었다. SA에 대해서는 비발효물의 경우 온도가 높아질수록 항세균 활성이 증가하였으나, 발효물에서는 항세균 활성의 차이가 없었다.
- 지유 발효물의 항산화 효과를 조사하기 위하여 항산화 효과가 뛰어난 것으로 알려져 있는 합성산화제인 BHT와 비교하여 아질산염 소거능을 조사한 결과, pH 2.5에서 비발효물과 발효물에서 아질산염 소거능은 70% 이상으로 대조구인 BHT보다 월등히 높았다. pH 4.
- 지유 추출물을 80℃, 100℃ 및 120℃에서 각각 30분간 열처리한 후 생육저해환을 측정한 결과, 열처리한 후 항세균활성이 거의 변화가 없는 것으로 관찰되어 항세균활성을 나타내는 주요물질이 열에 안정한 것으로 생각된다.
후속연구
- aureus에서 항균활성이 비교적 높게 나타났으나, 발효에 따른 항균활성의 크게 차이를 보이지 않은 결과로, 추후 다른균주을 이용하여 발효에 대한 지속적인 연구가 더 필요한 것으로 판단된다. 또한 총 폴리페놀 함량과 아질산염 활성이 비발효물보다 발효물에서 항산화성이 높은 함량과 활성을 보여 따라서 천연 폴리페놀 항산화제를 많이 포함한 기능성 소재 및 아질산염 소거작용이 우수한 지유 발효물을 아질산염 및 아민이 함유되어 있는 식품과 함께 섭취 및 가공한다면 nitrosamine 의 생성을 효과적으로 억제함과 동시에 높은 산화 방지 효과 및 이용가치가 높을 것으로 판단된다.
- 2mg/g으로 높게 측정되는 것으로 보아 추출방법 또는 조건에 따라 함량 차이가 크게 나는 것을 확인할 수 있어 본 실험결과와의 차이 이유인 것으로 판단된다. 또한 총 폴리페놀과 총 플라보노이드와의 상관관계가 없었으며, 추후 자세한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과를 종합하여 보면, 지유 추출물을 S. thermophilus을 이용하여 발효시킨 경우 항세균활성은 B. cereus 와 S. aureus에서 항균활성이 비교적 높게 나타났으나, 발효에 따른 항균활성의 크게 차이를 보이지 않은 결과로, 추후 다른균주을 이용하여 발효에 대한 지속적인 연구가 더 필요한 것으로 판단된다. 또한 총 폴리페놀 함량과 아질산염 활성이 비발효물보다 발효물에서 항산화성이 높은 함량과 활성을 보여 따라서 천연 폴리페놀 항산화제를 많이 포함한 기능성 소재 및 아질산염 소거작용이 우수한 지유 발효물을 아질산염 및 아민이 함유되어 있는 식품과 함께 섭취 및 가공한다면 nitrosamine 의 생성을 효과적으로 억제함과 동시에 높은 산화 방지 효과 및 이용가치가 높을 것으로 판단된다.
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