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문제 정의
- 11) 두충의 포제에 대한 연구는 박 등12)이 염자법을 이용하여 포제 한 후 geniposide와 geniposidic acid의 함량을 비교하였으며, 이들 성분에 대한 진통, 지질대사, 구속스트레스 부여 흰쥐의 뇌조직 및 혈장 중 catecholamine 함량에 대한 변화에 대하여 보고하였다. 본 연구자들은 결명자의 포제에 따른 주요 성분의 함량 변화13에 이어 두충의 주요 성분인 geniposidic acid, chlorogenic acid, geniposide, pinoresinol diglucoside, liriodendrin 및 genipin 둥 6종 성분에 대하여 시간과 온도에 따라 청초법(淸炒法)으로 포제 한 후 이들 성분의 포제 전후에 대한 함량 변화와 건조감량, 회분 및 산불용성회분 등의 이화학적 데이터를 비교하여 두충의 최적 포제에 대한 자료를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- 그 외의 시약은 HPLC 또는 특급 시약을 구 입하여 사용하였다. 6종의 정량분석은 Shimadzu Prominence LC-20A series(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하였으며 LC-20AT pump, DGU-20A3 online degasser, CTO-20A column oven, SIL-20AC autosampler 및 SPD-M20A photodiode array(PDA) detectore 구성되어 있다. 데이터 수집과 처리는 LC solution software(Version 1.
- Geniposidic acid, chlorogenic acid, geniposide, pinoresinol diglucoside, liriodendrin 및 genipin 등 6종의 표준품에 대하여 무게를 정확하게 측정한 후 메탄올로 녹여 모두 1.0 mg/ mL의 농도로 표준용액을 제조한 후 4oC에 보관하면서 사용전에 희석하여 사용하였다. 검액은 두충 및 포제된 두충 분말 약 500 mg을 정밀하게 달아 70% 에탄올을 넣어 50 mL로 한 후 60분간 초음파추출 하였다.
- 플라스크 및 잔류물은 여액이 100 mL로 될 때까 지 묽은 에탄올로 씻어 주었으며, 여액 50mL를 수욕에서 증발건고하고 105oC에서 4시간 건조하여 데시케이터(실리 카겔)에서 식힌 다음 그 질량을 정밀하게 달고 2를 곱하여 묽은에탄올엑스의 양으로 하였다. 건조감량에서 얻은 값에서 건조물로 환산한 검체량에 대한 엑스함량(%)을 산출하여 묽은에 탄올엑스함량을 계산하였다.
- 이 표준원액과 내부표준원액 적당량을 정확하게 취 하여 아세토니트릴로 μL 당 3, 5, 10, 20 및 40 ng의 벤조 피렌과 각각 50 ng의 내부표준물질이 함유되도록 희석하여 표준액으로 하였다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 Table I의 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하였으며, 각 표준액에서 얻은 내부표준물질 피크면적에 대한 벤조피 렌의 피크면적비 [AS/AIS]를 Y축으로 하고 벤조피렌의 농도를 X축으로 하여 만든 검량곡선을 작성하고, 검액의 내부 표준물질 피크면적에 대한 벤조피렌의 피크면적비 [Asam/ Asamis]를 Y축에 대입하여 벤조피렌의 농도를 구하였다.
- 관능검사 - 두충을 청초법에 따라 가공하였으며 탄화되지 않고 단면의 백색사（白色絲）가 잘 끊어지는 정도를 기준으로 하였다. 본 실험에서는 180oC-15분과 200oC-10분 및 200oC-15분 동안 가열하는 것을 두충의 초법（炒法）에 적절한 포제 시간과 온도로 판단하였다
- 건조감량 - 대한약전의 생약시험법16)에 따라 칭량병을 미리 105oC에서 1시간 건조한 후 그 무게를 정밀하게 달았다. 그 후 무게를 단 칭량병에 시료 약 2g을 넣어 그 층의 높이가 5 mm 이하가 되도록 편 다음 무게를 정밀하게 측정하여 105oC에서 5시간 건조하여 데시케이터(실리카겔)에서 식힌 후 칭량병을 꺼내어 그 무게를 정밀하게 달아 건조감 량(%)을 계산하였다.
- p data-page="1">예로부터 일부 생약에 대하여 효능 증가 또는 독성과 부작용을 약화시키거나 제거하기 위하여 불이나 수증기 또는 술 등을 이용하여 포제(旭製)라는 방법을 사용하여왔다. 두 충은 약재의 조직 안에 있는 약재의 작용과 아무런 관련도 없으며 오히려 약재의 유효성분을 갈라내는데 방해가 되는 고무질을 없애기 위하여 여러가지 방법들로 가공 및 법제 하여 사용되었다.1) 두충(Eucommiae Cortex)은 두충과 (Eucommiaceae)에 속하는 두중(Eucommia ulmoides Oliver)의 수피를 건조하여 사용하며, 예로부터 性味가 甘微辛, 溫 하여 간장과 신장기능을 튼튼하게 해서 근육과 뼈를 튼튼 하게 해주는 보간신강근골(補肝腎强筋骨)과 태아를 편안하 게 해서 안정된 임신을 유지시키는 안태(安胎)의 효능이 있다고 알려져 왔다.
- 두충 포제 - 구입 된 두충 규격 품을 온도(160, 180, 200, 220 및 240oC)와 시간(5, 10 및 15분)별로 포제 하였다. 포 제 전 해당 온도에서 예비가열을 한 후 설정 온도에 도달했 을 때 두충을 넣고 조건대로 조작을 하여 포제하였다.
- 두충 포제 - 두충의 적절한 포제 방법을 설정하고자 시중 유통품인 두충 생품을 구입하여 시간（5, 10 및 15분）과 온 도（160, 180, 200, 220 및 240oC）에 따라 포제를 실시하였다. 생품 두중과 포제된 두중을 Fig.
- 두충의 주요성분인 geniposidic acid, chlorogenic acid, geniposide, pinoresinol diglucoside, liriodendrin 및 genipin(Fig. 1)에 대하여 함량 분석을 위해 Table Ⅱ의 조건에 따라 분석하였다.
- 45 pm 이하의 멤브레인필터 (Woongki Science, Seoul, Korea)로 여과하여 검액으로 하였다. 따로 벤조피렌표준품 및 3-메틸콜란트 렌표준품 적당량을 정밀하게 달아 각각 아세토니트릴에 녹 여 mL당 1 ㎍을 함유하는 표준원액 및 내부표준원액을 만들었다. 이 표준원액과 내부표준원액 적당량을 정확하게 취 하여 아세토니트릴로 μL 당 3, 5, 10, 20 및 40 ng의 벤조 피렌과 각각 50 ng의 내부표준물질이 함유되도록 희석하여 표준액으로 하였다.
- 무게를 단 도가니에 시료 약 2 g을 넣어 무게를 정밀하게 측정하여 550oC에서 5시간 동안 강열하여 탄화물이 남지 않을 때까지 회화하였다. 방냉 한 후 질량을 정밀하게 달고 다시 항량이 될 때까지 회화하고 방냉 한 다음 그 질량을 정밀하게 달아 회분함량(%)을 계산하였다.
- 벤조피렌시험 - 두충과 포제된 두충(220oC-10분, 220oC15분, 240oC-10분 및 240oC-15분)에 대하여 식품의약품안전 처 고시17에 따라 시료 약 5.0 g을 정밀하게 달아 물 100 mL 를 넣어 90분간 초음파 추출하였다. 여기에 헥산 약 100 mL 및 내부표준액 1 mL을 넣어 Homogenizer로 5분간 균질 하게 섞은 다음 30분간 초음파 추출하였다.
- 관능검사 - 두충을 청초법에 따라 가공하였으며 탄화되지 않고 단면의 백색사（白色絲）가 잘 끊어지는 정도를 기준으로 하였다. 본 실험에서는 180oC-15분과 200oC-10분 및 200oC-15분 동안 가열하는 것을 두충의 초법（炒法）에 적절한 포제 시간과 온도로 판단하였다
- 본 연구에서는 대한약전에 수록되어 있는 두충을 시간(5, 10 및 15분)과 온도(160, 180, 200, 220 및 240oC)에 따라 포제 할 경우 두충의 주요 성분 중 항염증과 간장질환 (geniopsidic acid),25) 혈당강화와 항산화(chlorogenic acid),26) 신경보호(geniposide),27) 항고혈압(pinoresinol diglucoside),28) 항염증과 항통증(liriodendrin)29) 및 신경성장(genipin)30) 등의 효과를 가진 6종의 성분에 대하여 포제 전 • 후의 함량 변화를 측정하였다. 함량 분석 결과 genipine 포제 후 검출이 되지 않았으며, geniposidic acid와 geniposide는 EC5 (180oC, 5분), chlorogenic acid와 pinoresinol diglucoside는 EC2(160oC, 5분) 및 liriodendrine EC4(160oC, 15분)에서 포제품 중 최고치인 0.
- 16분에 각각 검출되었다. 설정된 분석법을 이용하여 두충의 6종 성분에 대하여 시간과 온도에 따라 포제 한 후 이들 성분의 변화를 HPLC로 측정하였다（Fig. 4）.
- 따로 벤조피렌표준품 및 3-메틸콜란트 렌표준품 적당량을 정밀하게 달아 각각 아세토니트릴에 녹 여 mL당 1 ㎍을 함유하는 표준원액 및 내부표준원액을 만들었다. 이 표준원액과 내부표준원액 적당량을 정확하게 취 하여 아세토니트릴로 μL 당 3, 5, 10, 20 및 40 ng의 벤조 피렌과 각각 50 ng의 내부표준물질이 함유되도록 희석하여 표준액으로 하였다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 Table I의 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하였으며, 각 표준액에서 얻은 내부표준물질 피크면적에 대한 벤조피 렌의 피크면적비 [AS/AIS]를 Y축으로 하고 벤조피렌의 농도를 X축으로 하여 만든 검량곡선을 작성하고, 검액의 내부 표준물질 피크면적에 대한 벤조피렌의 피크면적비 [Asam/ Asamis]를 Y축에 대입하여 벤조피렌의 농도를 구하였다.
- 또한 Ha 등10)은 두충의 수피와 잎에서 geniposide, geniposidic acid 및 aucubin 등 3종의 성분에 대하여 정량분석을 실시하고 이들 의 골다공증 효능을 검증하였다. 이에 본 저자들은 이러한 선행 연구를 바탕으로 두충에 포함된 geniposidic acid, chlorogenic acid, geniposide, pinoresinol diglucoside, liriodendrin 및 genipin 등 6종의 성분을 대상으로 포제 전 • 후에 대하여 함량의 변화를 비교 분석하였다. 함량분석을 위하여 6종의 성분에 대하여 서로 다른 농도 범위에서 검 량선을 작성한 결과 상관계수(r2)가 0.
- 두충 포제 - 구입 된 두충 규격 품을 온도(160, 180, 200, 220 및 240oC)와 시간(5, 10 및 15분)별로 포제 하였다. 포 제 전 해당 온도에서 예비가열을 한 후 설정 온도에 도달했 을 때 두충을 넣고 조건대로 조작을 하여 포제하였다. 두충의 온도 및 시간에 따른 포제의 조건은 다음과 같다.
- 회분 - 대한약전의 생약시험법16)에 따라 도가니를 미리 550oC에서 1시간 강열하여 데시게이터에서 방냉 한 후 그 무게를 달았다. 무게를 단 도가니에 시료 약 2 g을 넣어 무게를 정밀하게 측정하여 550oC에서 5시간 동안 강열하여 탄화물이 남지 않을 때까지 회화하였다.
- 산불용성회분 - 대한약전의 생약시험법16)에 따라 회분에 묽은 염산 25mL을 가하여 5분간 약한 열에 끓여 불용물을 정량용 여과지로 여과한 후 잔류물을 열탕으로 잘 씻어 여과지와 함께 건조하였다. 회분과 같은 방법으로 550oC에서 5시간 동안 강열하여 데시케이터(실리카겔)에서 방냉 한 후 그 무게를 정밀하게 달아 산불용성회분량(%)으로 하였다.
대상 데이터
- , Ltd.(Kunming, China)에서 순도 98%이상의 표준품을 구입하여 사용하였다. 정량 및 정성분석을 위한 메탄올, 아세토나이트릴 및 물은 J.
- 실험재료 −본 실험에 사용된 두충은 광명당제약(Ulsan, Korea)에서 규격품을 구입하여 동국대학교 한의과대학 이제현 교수(Gyeongju, Korea)와 대전대학교 한의과대학 서영배 교수(Daejeon, Korea) 등의 전문가로부터 기원 동정 후 실험에 사용하였다. 두충 표본(2012-RISEC)은 한국한의학연구원 K-herb연구단에 보관하였다.
- (Kunming, China)에서 순도 98%이상의 표준품을 구입하여 사용하였다. 정량 및 정성분석을 위한 메탄올, 아세토나이트릴 및 물은 J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, 초산은 Junsei(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 그 외의 시약은 HPLC 또는 특급 시약을 구 입하여 사용하였다.
- 합한 헥산층에 물 약 50mL를 넣어 세척하고, 이 헥산층을 무수황산나트륨을 넣은 여과지를 사용하여 탈수 여과한 다음 45oC의 수욕상에서 감압하여 헥산 약 2mL가 될 때까지 농축하였다. 플로리실카트리지는 미리 디클로로 메탄 10 mL 및 헥산 20mL를 순서대로 초당 2~3 방울의 속도로 유출시켜 활성화시킨 후 사용하였다. 활성화된 카트 리지에 위의 추출용액을 넣어 헥산디클로로메탄혼합액(3:1) 20mL를 초당 2~3방울의 속도로 용출시켰다.
- 24, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하였다. 회화로는 Thermolyne 48000 furnace(Barnstead, Dubuque, IA, USA), 건조기는 OF-22G (JeioTech, Daejeon, Korea), 초음파추출기는 Branson 8510E-DTH(Branson Ultrasonic Co., Danbury, CT, USA) 및 포제는 CBR-101A(GeneCafe, Ansan, Korea)를 사용하였다.
이론/모형
- 벤조피렌 - 한약재의 고온건조 및 가공 시 생성될 수 있는 벤조피렌은 1급 발암물질로서 인체에 축적될 경우 폐암, 위암, 피부암, 대장암 및 유방암 등의 각종 암을 유발하고 돌연변이를 일으킨다고 알려져 있다.18) 따라서 두충을 220oC 이상의 고온에서 포제 할 경우 발암물질인 벤조피렌의 생 성여부 및 생성 량을 조사하고자 식품의약품안전처 고시17)에 따라 시험을 실시하였다. 시료 중 생품과 220oC-10분, 220oC-15분, 240oC-10분 및 240oC-15분 동안 포제 한 두충 초 등 총 5종의 시료에 대해서 벤조피렌 시험을 실시한 결과 불검출, 0.
- 관능검사 −청초법(淸炒法)으로 포제를 한 두충에 대하여 적절한 온도와 시간을 설정하기 위하여 위와 같이 포제 한 생약을 본초학 교재14)와 대한약전외한약(생약)규격집15)을 바탕으로 본초학 전문가인 대전대학교 한의과대학 서영배 교수와 동국대학교 한의과대학 이제현 교수에 의해 관능검사를 실시하였다.
- 산불용성회분 - 대한약전의 생약시험법16)에 따라 회분에 묽은 염산 25mL을 가하여 5분간 약한 열에 끓여 불용물을 정량용 여과지로 여과한 후 잔류물을 열탕으로 잘 씻어 여과지와 함께 건조하였다. 회분과 같은 방법으로 550oC에서 5시간 동안 강열하여 데시케이터(실리카겔)에서 방냉 한 후 그 무게를 정밀하게 달아 산불용성회분량(%)으로 하였다.
성능/효과
- 03%로 각각 나타났다（Table VI）. Table VI에서오｝ 같이 함량 분석 결과를 살펴보면 genipine 포제할 경우 검출이 되지 않았으며, 이를 제외한 5가지 성분 모두 포제 온도와 시간이 증가할수록 성분의 함량은 오히려 감소하는 경항을 보였다. 이러한 결과는 Chen 등23）의 결과에서 pinoresinol digucoside가 포제 온도와 시간이 증가하면 성분의 함량은 감소한다는 연구결과와 같은 결과를 보인 반면, 박 등12）과 김 등24）의 연구 결과와는 다른 결과를 보였다.
- 건조감량 −두충 및 두충초의 대한약전에 따른 건조 감량 측정 결과 평균 및 표준편차는 3.42±1.28%(n=3)이었고 각각의 시료에 따라 0.36~5.37%로 나타났다. 이는 두충의 대한약전 기준치인 10.
- 4）. 두충 및 두충초의 geniposidic acid, chlorogenic acid, geniposide, pinoresinol diglucoside, liriodendrin 및 genipin의 함량 분석 결과 0.04-1.31%, 0.010.31%, 0.05-0.66%, 0.01-0.46%, 0.15-0.46% 및 미검출0.03%로 각각 나타났다（Table VI）. Table VI에서오｝ 같이 함량 분석 결과를 살펴보면 genipine 포제할 경우 검출이 되지 않았으며, 이를 제외한 5가지 성분 모두 포제 온도와 시간이 증가할수록 성분의 함량은 오히려 감소하는 경항을 보였다.
- 산불용성 회분 - 두충 및 두충초의 대한약전에 따른 산불 용성회분 측정 결과 평균 및 표준편차는 4.91±0.76%(n=3) 이었고 각각의 시료에 대한 평균값이 3.72~5.94%로 나타났다. 이는 대한약전 기준치인 6.
- 18) 따라서 두충을 220oC 이상의 고온에서 포제 할 경우 발암물질인 벤조피렌의 생 성여부 및 생성 량을 조사하고자 식품의약품안전처 고시17)에 따라 시험을 실시하였다. 시료 중 생품과 220oC-10분, 220oC-15분, 240oC-10분 및 240oC-15분 동안 포제 한 두충 초 등 총 5종의 시료에 대해서 벤조피렌 시험을 실시한 결과 불검출, 0.7, 0.3, 0.3 및 1.4 μg/kg으로 각각 나타났다. 현재 우리나라에서는 생약의 벤조피렌 기준은 지황과 숙지황 을 기준으로 5 μg/kg 이하로 허용하고 있다.
- 94%로 나타났다. 이는 대한약전 기준치인 6.0%이하에 적합하였으며, 두충 및 두충초의 산불용성 회분을 6.0%로 설정하는 것이 타당하다고 사료된다(Table IV).
- 88% 로 나타났다. 이는 대한약전 기준치인 9.0% 이상에 모두 적합하였으며, 두충 및 두충초의 묽은에탄올엑스함량을 9.0% 이상으로 규정하는 것이 타당하다고 사료된다(Table Ⅲ).
- 37%로 나타났다. 이는 두충의 대한약전 기준치인 10.0% 이하에 모두 적합하였으며, 두충 및 두충 초의 건조감량을 10.0% 이하로 규정하는 것이 타당하다고 사료된다(Table Ⅲ).
- 본 연구에서는 대한약전에 수록되어 있는 두충을 시간(5, 10 및 15분)과 온도(160, 180, 200, 220 및 240oC)에 따라 포제 할 경우 두충의 주요 성분 중 항염증과 간장질환 (geniopsidic acid),25) 혈당강화와 항산화(chlorogenic acid),26) 신경보호(geniposide),27) 항고혈압(pinoresinol diglucoside),28) 항염증과 항통증(liriodendrin)29) 및 신경성장(genipin)30) 등의 효과를 가진 6종의 성분에 대하여 포제 전 • 후의 함량 변화를 측정하였다. 함량 분석 결과 genipine 포제 후 검출이 되지 않았으며, geniposidic acid와 geniposide는 EC5 (180oC, 5분), chlorogenic acid와 pinoresinol diglucoside는 EC2(160oC, 5분) 및 liriodendrine EC4(160oC, 15분)에서 포제품 중 최고치인 0.94%, 0.63%, 0.14%, 0.37% 및 0.42%로 각각 검출되었다.
- 이에 본 저자들은 이러한 선행 연구를 바탕으로 두충에 포함된 geniposidic acid, chlorogenic acid, geniposide, pinoresinol diglucoside, liriodendrin 및 genipin 등 6종의 성분을 대상으로 포제 전 • 후에 대하여 함량의 변화를 비교 분석하였다. 함량분석을 위하여 6종의 성분에 대하여 서로 다른 농도 범위에서 검 량선을 작성한 결과 상관계수(r2)가 0.9997이상의 양호한 직선성을 나타내었으며(Table V), 상관계수 값이 1.00에 가까운 직선성을 보여 본 실험에서의 직선성이 매우 좋음을 의미한다. Fig.
- 회분 −두충 및 두충초의 대한약전에 따른 회분 측정 결과 평균 및 표준편차는 6.57±0.68%(n=3)이었고 각각의 시료에 대하여 5.52~7.88%로 나타났다. 이는 대한약전 기준치 8.
후속연구
- 이들은 청초법（淸炒法）이 아닌 염자법（鹽炙法）, 강자법（薑炙法） 및 초탄 법（炒炭法）과 같은 방법으로 포제를 실시한 후 성분의 함량 을 비교하였다. 이와 같이 포제 방법에 따라 주요 성분의 함 량 차이를 보이므로 최적의 포제법 및 방법을 제시하기 위하여 다양한 방법의 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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