Objectives The present study aimed to investigate the change in marker compounds, anti-oxidative and anti-inflammatory effects of salt-water processed Cortex Eucommiae. Methods To evaluate the influence of processing on anti-oxidant effect of Cortex Eucommiae, changes in total phenol, total flavonoi...
Objectives The present study aimed to investigate the change in marker compounds, anti-oxidative and anti-inflammatory effects of salt-water processed Cortex Eucommiae. Methods To evaluate the influence of processing on anti-oxidant effect of Cortex Eucommiae, changes in total phenol, total flavonoid, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) free radical scavenging, and ferric reducing antioxidant power (FRAP) between processed and raw Cortex Eucommiae were assessed. In addition, nitrite assay was conducted to determine the influence of processing on anti-inflammatory effect of Cortex Eucommiae. Cell viability was also examined as to elucidate whether processing affects cytotoxicity of Cortex Eucommiae. Finally, high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis was conducted to monitor changes in pinoresinol diglucoside amount of processed and raw Cortex Eucommiae. Results Salt-water processed Cortex Eucommiae showed higher total phenol and flavonoid amount, compared to raw Cortex Eucommiae. Furthermore, anti-oxidative activity of processed Cortex Eucommiae was improved as discovered in DPPH, ABTS, and FRAP assays. Anti-inflammatory effect of Cortex Eucommiae was also enhanced following salt-water processing, as evidenced in nitrite assay. HPLC analysis found that the amount of pinoresinol diglucoside, widely known as the marker compound of Cortex Eucommiae, increases through salt-water processing. All experiments were performed with non-toxic concentration of Cortex Eucommiae; processing did not affect the cytotoxicity of Cortex Eucommiae up to the currently adopted concentration. Conclusions The present results support that salt-water processing of Cortex Eucommiae is beneficial in terms of marker compound amount, anti-oxidative, and anti-inflammatory activities. Additional investigations are needed to standardize the processing method of Cortex Eucommiae.
Objectives The present study aimed to investigate the change in marker compounds, anti-oxidative and anti-inflammatory effects of salt-water processed Cortex Eucommiae. Methods To evaluate the influence of processing on anti-oxidant effect of Cortex Eucommiae, changes in total phenol, total flavonoid, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) free radical scavenging, and ferric reducing antioxidant power (FRAP) between processed and raw Cortex Eucommiae were assessed. In addition, nitrite assay was conducted to determine the influence of processing on anti-inflammatory effect of Cortex Eucommiae. Cell viability was also examined as to elucidate whether processing affects cytotoxicity of Cortex Eucommiae. Finally, high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis was conducted to monitor changes in pinoresinol diglucoside amount of processed and raw Cortex Eucommiae. Results Salt-water processed Cortex Eucommiae showed higher total phenol and flavonoid amount, compared to raw Cortex Eucommiae. Furthermore, anti-oxidative activity of processed Cortex Eucommiae was improved as discovered in DPPH, ABTS, and FRAP assays. Anti-inflammatory effect of Cortex Eucommiae was also enhanced following salt-water processing, as evidenced in nitrite assay. HPLC analysis found that the amount of pinoresinol diglucoside, widely known as the marker compound of Cortex Eucommiae, increases through salt-water processing. All experiments were performed with non-toxic concentration of Cortex Eucommiae; processing did not affect the cytotoxicity of Cortex Eucommiae up to the currently adopted concentration. Conclusions The present results support that salt-water processing of Cortex Eucommiae is beneficial in terms of marker compound amount, anti-oxidative, and anti-inflammatory activities. Additional investigations are needed to standardize the processing method of Cortex Eucommiae.
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문제 정의
현대적 연구는 위와 같이 전통적 포제법을 지표물질 및 유효성분의 함량변화라는 측면에서 해석하고 있다. 반면, 포제에 따른 두충의 생리활성 변화에 대한 보고는 많지 않은 실정이므로, 이에 본 연구는 두충의 염수초 포제법과 이에 따른 성분함량, 항산화 및항염증 활성 변화를 규명하기 위해 진행되었다.
본 연구에서는 두충의 포제 방법에 따른 총 페놀, 플라보노이드 함량과 DPPH, ABTS 및 FRAP assay를 통한 항산화 활성, NO assay를 통한 항염증 활성 pinoresinol diglucoside 함량을 비교하였다. 이를 통해 염수초 포제에 대한 근거을 제시하고 포제법 규격화에 대한 기초자료로 활용하고자 한다.
제안 방법
0.1% formic acid를 포함한 물 (A)과 0.1% formic acid를 포함한 ACN (B)을 mobile phase로 사용하여, gradient 조건(5% B, 0.01 min → 20% B, 20 min → 20% B, 25 min → 5% B, 30 min)에 따라 분석하였다.
24시간 후 포제 전, 후 두충 추출물을 62.5, 125, 250, 500 μg/mL 농도로 처리하고 40분 후 1 μg/mL의 LPS를 처리하여 37o C, 5% CO2에서 20시간 배양하였다.
96 well plate에 200 μL씩 옮겨 담아 570 nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포 생존률은 LPS 단독 처리군과 비교하였다.
ABTS 라디칼 소거활성을 이용한 시료의 항산화력 측정은 Arnao 등의 방법19) 을 일부 변경하여 측정하였다. 7.
각 추출물 100 μL와 ethanol에 용해시킨 DPPH 500 ppm 100 μL을 혼합한 뒤 37oC에서 30분간 암소에서 반응시킨 후, ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Ascorbic acid를 표준물질로 이용하여 표준곡선을 작성하였고, 건조 시료 중량 당 mg ascorbic acid equivalnent (mg AAE/g)로 나타내었다.
Diclofenac 50 μg/mL과 포제 후 두충 추출물 500 μg/mL에서 유사한 NO 생성 억제률을 확인 하였다(Fig. 3A).
Fe3+을 Fe2+로 환원시키는 포제 전, 후 두충 추출물의 환원력을 평가하기 위해 Bemzie20) , Kim21) 등의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 300 mM acetate buffer (pH 3.
배양 후 각 well에서 상층액 100 μL를 96 well에 옮겨 담고 griess reagent 180 μL를 첨가한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite 생성은 sodium nitrite로 작성한 표준곡선에 대입하여 계산하였고, nitrite 생성에 대한 포제 전, 후 두충 추출물의 억제 효과는 LPS 단독 처리군과 비교하였다.
혼합한 시료는 37oC 에서 1시간 반응시킨 후, ELISA reader로 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin을 표준물질로 이용하여 표준곡선을 작성하였고, 건조 시료 중량 당 mg quercetin equivalent (mg QE/g)로 나타내었다.
세포 독성, 조직 손상 및 염증 뿐만 아니라 세포 내 항상성 유지, 혈압 및 신경전달 기능 조절 등 다양한 기능을 가지는 물질로 알려져 있다38-40) . RAW 264.7 cell에 LPS로 자극하여 생성되는 NO에 대해 포제 전, 후 두충 추출물의 효과를 확인하기 위해 griess reagent와 세포배양액을 반응시켜 NO 생성량을 측정하였다. 그 결과, LPS 단독 처리한 군 대비 62.
희석된 용액 190 μL에 각 추출물 10 μL를 가하여 2시간 동안 암소에서 방치한 다음 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. Trolox를 표준물질로 이용하여 표준곡선을 작성하였고, 건조 시료 중량 당 mg trolox equivalent (mg TE/g)로 나타내었다.
희석된 용액 190 μL에 각 추출물 10 μL를 가하여 2시간 동안 암소에서 방치한 다음 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. Trolox를 표준물질로 이용하여 표준곡선을 작성하였고, 건조 시료 중량 당 mg trolox equivalent (mg TE/g)로 나타내었다.
골다공증 등에 대한 두충의 효과가 과학적으로 규명됨에 따라10) , 향후 근골격계 질환에 대한 응용이 더욱 기대되고 있다. 본 연구에서는 두충의 포제 방법에 따른 총 페놀, 플라보노이드 함량과 DPPH, ABTS 및 FRAP assay를 통한 항산화 활성, NO assay를 통한 항염증 활성 pinoresinol diglucoside 함량을 비교하였다. 이를 통해 염수초 포제에 대한 근거을 제시하고 포제법 규격화에 대한 기초자료로 활용하고자 한다.
포제 전, 후 추출물에 대한 세포독성을 확인하기 위해 nitrite assay 후 각 well에 최종농도 500 μg/mL로 MTT 용액을 첨가하고 37oC, 5% CO2에서 4시간 배양하였다 배양 후 배지를 모두 제거하고 DMSO 1 mL을 첨가하여 formazan을 모두 용해시켰다.
대상 데이터
RAW 264.7 cell은 한국세포주은행 (KCLB, Korea)에서 구입하여 사용하였고, 10% FBS와 1% AA가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 37oC, 5% CO2 조건에서 2∼3일에 한번씩 계대 배양하였다.
본 연구에 사용된 시약 중 항산화시험에 사용된 folin-Ciocalteau reagent, gallic acid, quercetin, 2,2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline 6 sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), potassium persulfate, 2,4,6-tripyridyl s triazine (TPTZ), (±)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2 carboxylic acid (Trolox), iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3ㆍ 6H2O), sodium acetate trihydrate, ascorbic acid는 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)에서 구입하였고, Na2CO3, diethyleneglycol, acetic acid는 Junsei (Tokyo, Japan), NaOH는 Samchun (Pyeongtaek, Korea), HCl는 SK chemicals (Seoul, Korea)에서 각각 구입하였다.
그린명품제약(남양주, 한국)에서 판매하는 두충을 구입하여 본 연구에 사용하였다. 해당 품목은 판매사의 감별 위원회에서 검증 받았다.
Louis, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 본 연구에 사용된 기기 중 Freeze dryer는 FD8512 (Ilshinbiobase, Korea), ELISA reader는 sunrise (Tecan, Austria), HPLC는 LCMS-2020 (Shimadzu, Japan)를 사용하였다.
Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다. 함량시험에 사용된 water, acetonitrile (ACN)은 HPLC grade용으로 JT Baker (Phillipsburg, USA)에서 구입하였고, formic acid는 Junsei (Tokyo, Japan), 두충의 지표물질인 pinoresinol diglucoside는 순도 98.00%로 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 본 연구에 사용된 기기 중 Freeze dryer는 FD8512 (Ilshinbiobase, Korea), ELISA reader는 sunrise (Tecan, Austria), HPLC는 LCMS-2020 (Shimadzu, Japan)를 사용하였다.
실험결과는 3회 반복 측정한 후 평균±표준편차로 나타냈으며, 통계적인 평가는 independent t-test로 검정하 였다.
이론/모형
포제 전, 후 두충 추출물에 함유되어 있는 총 페놀 함량은 도 등의 방법17) 에 따라 측정하였다. 각 추출물 50 μL을 취해 2% Na2CO3용액 1 mL과 혼합한 뒤 50% folin-cioalteau’s phenol reagent 50 μL를 추가하여 암소 에서 1시간동안 반응시킨 후 ELISA reader로 750 nm에서 흡광도를 측정하였다.
포제 전, 후 두충 추출물에 함유되어 있는 총 플라보노이드의 함량은 도 등의 방법17) 에 따라 측정하였다. 각 추출물 100 μL를 diethyleneglycol 1 mL과 혼합하고, 1 N NaOH 100 μL를 첨가하였다.
포제 전, 후 두충 추출물의 라디칼 소거활성은 안정한 라디칼 DPPH를 사용하는 방법으로 측정하였다18). 각 추출물 100 μL와 ethanol에 용해시킨 DPPH 500 ppm 100 μL을 혼합한 뒤 37oC에서 30분간 암소에서 반응시킨 후, ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
RAW 264.7 cell에서 포제 전, 후 두충 추출물의 NO 생성량을 측정한 결과, LPS 무처리군(5.9±0.26 μM)에 비해 LPS 단독 처리한 군(44.3±2.09 μM)에서 NO 생성량이 증가하였다.
RAW 264.7 cell에서 포제 전, 후 두충 추출물의 세포 독성을 확인한 결과, 62.5, 120, 250, 500 μg/mL 모든 농도에서 100% 이상의 세포 생존률을 보여 세포 생장에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다(Fig. 3B).
그 결과, LPS 단독 처리한 군 대비 62.5, 125, 250, 500 μg/mL 농도에서 포제 전 두충 추출물은 7.2, 13.8, 23.3, 39.5%, 포제 후 두충 추출물은 11.5, 20.3, 35.0, 58.2%, 양성대조군으로 사용한 diclofenac 50μg/mL은 50.6% 억제률을 보였다.
2C). 기존 연구들과 같은 맥락에서, 본 연구의 DPPH, ABTS 및 FRAP 실험결과 역시 포제가 항산화 활성에도 영향을 준다는 점을 뒷받침한다.
두충 추출물 62.5, 125, 250, 500 μg/mL 농도에서 포제 전 NO 생성량은 41.1±2.15, 38.2±1.83, 34.0±2.05, 26.8±2.05 μM, 포제 후 39.2±2.33, 35.3±1.46, 28.3±1.85, 18.5±1.04 μM로 LPS 단독 처리군 보다 NO 생성량이 농도 의존적으로 억제되었고, 포제 전보다 포제 후 NO 생성량이 억제되는 것을 확인하였다.
두충의 주요성분인 pinoresinol diglucoside에 대한 포제 전, 후의 함량을 비교한 결과, 포제 전 4.6±0.07 mg/g, 포제 후 8.2±0.14 mg/g으로 포제 후 pinoresinol diglucoside의 함량이 증가하였다(Fig. 4, 5).
본 연구에서는 두충을 염수초법으로 포제하여 total phenol, total flavonoid 함량과 DPPH, ABTS, FRAP assay를 통한 항산화활성, NO assay를 통한 항염증활성 및 두충의 주요성분인 pinoresinol diglucoside의 함량을 비교한 결과, 포제 후 각 활성과 함량이 증가한 것으로 확인되었다. 이상의 결과를 활용하여 두충의 포제법을 연구, 정립시킬 수 있을 것으로 사료된다.
1B). 사초법으로 포제한 권백과 염자로 포제한 진피 모두 포제 후 총 페놀 함량이 증가한 것으로 보고하였고, 청초와 주정 전처리에 따른 오미자물 추출물의 항산화 활성을 비교한 결과, 청초와 주정 전처리를 한 오미자에서 모두 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 증가한 것을 통해 본 실험과 유사한 결과를 확인 할수 있었다27-29). 인체 내의 free radical은 지질, 단백질 등과 결합하여 생체의 노화를 일으키는 물질이며, 특히 DPPH는 짙은 자색을 띄는 radical을 갖는 물질 중에서 비교적 안정한 화합물이다.
포제 전, 후 두충 추출 물의 처리 농도별 세포독성을 측정한 결과, 최고 농도 500 μg/mL까지 100% 이상의 세포생존률을 보여 세포 독성이 없음을 확인하였다(Fig. 3B).
6% 억제률을 보였다. 포제 전, 후 두충 추출물 모두 농도 의존적으로 유의한 차이가 있었고, 포제 전보다 포제 후 두충 추출물에서 NO 생성 억제률이 높은 것을 확인하였다. Diclofenac 50 μg/mL과 포제 후 두충 추출물 500 μg/mL에서 유사한 NO 생성 억제률을 확인 하였다(Fig.
포제 전, 후 두충 추출물에 존재하는 총 페놀 함량을 gallic acid로 측정한 결과, 포제 전 73.9±1.28 mg GAE/g, 포제 후 96.7±1.40 mg GAE/g이었다.
포제 전, 후 두충 추출물에 존재하는 총 플라보노이드 함량을 quercetin로 측정한 결과, 포제 전 59.8±1.67 mg QE/g, 포제 후 90.9±0.96 mg QE/g이었다.
포제 전, 후 두충 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 ascorbic acid로 측정 한 결과, 포제 전 14.6±0.82 mg AAE/g, 포제 후 20.7±0.46 mg AAE/g이었다.
포제 전, 후 두충 추출물의 환원력을 trolox로 측정한 결과, 포제 전 22.4±0.46 mg TE/g, 포제 후 37.0±0.73 mg TE/g이었다.
69 mg TE/g이었다. 포제 전과 비교하여 포제 후 ABTS 라디칼 소거활성이 유의하게 증가하였다(p ＜0.001) (Fig. 2B).
46 mg AAE/g이었다. 포제 전과 비교하여 포제 후 DPPH 라디칼 소거활성이 유의하게 증가하였다(p＜0.001) (Fig. 2A).
96 mg QE/g이었다. 포제 전과 비교하여 포제 후 총 플라보노이드 함량이 유의하게 증가 하였다(p＜0.001) (Fig. 1B).
. 포제에 따른 두충 추출물 중 pinoresinol diglucoside 함량은 포제후 약 1.8배 유의하게 증가하였다(p＜0.001) (Fig. 5). 두충의 지표성분을 geniposide로 설정하여 염두충, 강두충 및 두충초탄의 함량을 비교한 연구에서 포제법에 따라 geniposide의 함량 차이가 있음을 보고하였고, 포제에 따른 두충의 지표성분 함량을 분석한 연구에 따르면 두충은 포제 온도와 시간이 증가함에 따라 pinorecinol diglucoside의 함량이 감소한다고 보고하였다15,44,45).
향균, 항암, 항염증, 항알레르기 등 다양한 생리활성 기능이 인체의 질병 원인이 되는 산화작용을 억제하는 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다25,26) . 포제에 따른 두충 추출물에 함유된 총 플라보노이드 함량을 건조 시료 중량당 quercetin 등량값(mg QE/g)으로 나타낼 때, 포제 후 두충 추출물이 약 1.5배 높은 플라보노이드를 함유하고 있었다(p＜0.001) (Fig. 1B). 사초법으로 포제한 권백과 염자로 포제한 진피 모두 포제 후 총 페놀 함량이 증가한 것으로 보고하였고, 청초와 주정 전처리에 따른 오미자물 추출물의 항산화 활성을 비교한 결과, 청초와 주정 전처리를 한 오미자에서 모두 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 증가한 것을 통해 본 실험과 유사한 결과를 확인 할수 있었다27-29).
DPPH radical은 free radical, ABTS radical은 cation radical이므로 추출물의 특성에 따라 다를 수 있으므로 두 종류의 radical 소거활성을 모두 분석할 필요가 있다33,34). 포제에 따른 두충 추출물의 ABTS radical 소거 활성을 건조 시료 중량 당 trolox 등량값(mg TE/g)으로 나타낼 때, 포제 전과 비교하여 포제 후 두충 추출물이 약 1.5배 높은 ABTS radical 소거활성이 있었다(p ＜0.001) (Fig. 2B). 환원력은 항산화 활성에 관계된 중요한 인자로서 시료 중에 항산화제와 같은 환원력을 가진 성분이 존재하게 되면 ferric tripyridyltriazine (Fe 3+) 복합체를 ferrous tripyridyltriazine (Fe2+) 상태로 환원시키고 이때 발생하는 흡광도를 측정하여 항산화 활성을 평가하는 방법이다.
흡광도 수치가 높을수록 높은 환원력을 나타내는 것을 의미하며, radical의 소거활성을 측정하는 DPPH, ABTS 실험방법과는 다른 메커니즘의 항산화 측정법이다35-37). 포제에 따른 두충 추출물의 FRAP assay를 통한 환원력을 건조 시료 중량 당 trolox 등량값(mg TE/g)으로 나타낼 때, 포제 전과 비교하여 포제 후 두충 추출물이 약 1.7배 높은 환원력이 있었다(p＜0.001) (Fig. 2C). 기존 연구들과 같은 맥락에서, 본 연구의 DPPH, ABTS 및 FRAP 실험결과 역시 포제가 항산화 활성에도 영향을 준다는 점을 뒷받침한다.
후속연구
본 연구 결과를 종합해 볼 때, 염수초로 포제한 두충 추출물은 항산화, 항염증 효능 및 주요성분인 pinoresinol diglucoside 함량이 증가하는 것으로 확인하였고, 향후 약리학적 효능 변화 등 추가 연구를 통해 염수초법에 대한 정당성을 제시할 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 두충을 염수초법으로 포제하여 total phenol, total flavonoid 함량과 DPPH, ABTS, FRAP assay를 통한 항산화활성, NO assay를 통한 항염증활성 및 두충의 주요성분인 pinoresinol diglucoside의 함량을 비교한 결과, 포제 후 각 활성과 함량이 증가한 것으로 확인되었다. 이상의 결과를 활용하여 두충의 포제법을 연구, 정립시킬 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
포제의 가공 종류에는 어떠한 것들이 있는가?
포제란 약재의 질과 치료효능을 높이고, 독성과 부작용을 낮추기 위한 목적으로 가공처리하는 행위를 통틀어 이르는 개념이다1). 구체적으로 택(擇), 거(去), 파(破), 착 (捉), 참(斬), 단(段), 치(冶), 저(咀), 부차(父且) 등 물리적 가공과 온(溫), 번(燔), 소(燒), 자(炙), 오(熬), 픽(煏) 등 불을 이용한 가공, 자(煮), 전(煎), 증(蒸), 쉬(淬), 찬 (爨), 비(沸) 등 물을 이용한 가공이 있으며, 이 과정에서 각종 보료(輔料)가 이용되기도 한다2). 개별 약재의 포제법은 역사적 경험을 통해 용출을 원활하게 하거나, 독성을 낮추고 약리적 효과를 높이는 방향으로 분화, 발전했다고 볼 수 있다.
두충나무란 무엇인가?
두충나무(Eucommia ulmoides Oliver)는 낙엽교목으로, 두충과(Eucommiaceae family)의 유일한 구성원이다. 동아시아에서는 전통적으로 두충나무의 각종 부위를 사용해왔는데, 이 중 두충나무의 수피를 두충(杜仲, Cortex Eucommiae)이라고 부르며 약용 목적으로 사용하였다.
두충이 함유하고 있는 천연 화합물은 주로 무엇인가?
특히, 난소제거백서 (OVX mouse model)를 이용한 실험에서 두충은 난소제거로 인해 유발된 골밀도의 감소와 골조직의 변화를 효과적으로 억제한 것으로 드러났으며10) , 조골세포(osteoblast)의 증식과 분화를 촉진하는 등11,12) 두충의 골보호 효과 또한 지속적으로 규명되고 있다. 두충이 함유하는 천연화합물은 주로 lignan, iridoids, phenolics, terpenoid, flavonoid 계열에 속하며, 이들이 두충의 약리활성을 나타내는 것으로 파악되고, 또 지표물질로 쓰이고 있다13).
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