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문제 정의
- 본 연구의 목적은 발효식품에서 분리된 효모의 특성 연구를 통해, 우리술의 품질 향상을 위한 우수한 효모 종균의 다양성을 확보하고자 하였다. 따라서 효모의 세포외 효소인 β-glucosidase, glucanase, protease, amino acid decarboxylase 등을 조사하였으며, 에탄올 내성, 황화수소 생성능 등 효모의 환경내성을 탐색하였다.
제안 방법
- , St. Louis, USA)의 대한 저항성은 0.67% YNB (yeast nitrogen base), 2% glucose, 2% agar 조성의 한천 배지에 cerulenin (25 μM)과 TFL (1 mM)을 각각 첨가하여 제조 후 효모를 접종하고 30°C에서 48시간 배양 한 다음 집락 생성 여부에 따라 평가하였다[26].
- 본 연구의 목적은 발효식품에서 분리된 효모의 특성 연구를 통해, 우리술의 품질 향상을 위한 우수한 효모 종균의 다양성을 확보하고자 하였다. 따라서 효모의 세포외 효소인 β-glucosidase, glucanase, protease, amino acid decarboxylase 등을 조사하였으며, 에탄올 내성, 황화수소 생성능 등 효모의 환경내성을 탐색하였다. 또한 효모의 경우, 아미노산 생합성 및 지방산 생합성 경로를 통해 고급 알코올류, 향기성 에스테르 계열의 물질을 생산하는데 이 생합성 경로 저해제에 대해 내성을 가지는 균주를 발굴함으로써, 향기가 뛰어난 것으로 예상되는 효모 생물자원 12 균주를 확보하였다.
- 따라서 효모의 세포외 효소인 β-glucosidase, glucanase, protease, amino acid decarboxylase 등을 조사하였으며, 에탄올 내성, 황화수소 생성능 등 효모의 환경내성을 탐색하였다. 또한 효모의 경우, 아미노산 생합성 및 지방산 생합성 경로를 통해 고급 알코올류, 향기성 에스테르 계열의 물질을 생산하는데 이 생합성 경로 저해제에 대해 내성을 가지는 균주를 발굴함으로써, 향기가 뛰어난 것으로 예상되는 효모 생물자원 12 균주를 확보하였다.
- 0018% tartaric acid) 한천 배지[16]에 100 μl 도말하여 30°C에서 48시간 배양하였다. 배양된 효모의 집락 모양, 크기, 색깔 등 형태적 특징을 관찰하여 서로 다른 균주를 YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) 한천 배지를 사용하여 순수분리 하였다. 순수 분리된 효모는 YPD 액체 배지에 배양 후, glycerol를 20% 함유하도록 첨가하여 80°C에서 보관하여 실험에 사용하였다.
- 에탄올 내성 평가는 YPD 한천 배지에 5%, 10%, 15%의 에탄올을 첨가하여 제조한 후 효모를 접종하여 집락의 생성여부에 따라 내성을 평가하였다[17]. 아황산 내성 평가는 YPD 한천 배지에 tartaric acid (Sigma-Aldrich Co.
- 이때 대조구는 포도당 1%를 첨가한 YPD 액체 배지에서 효모 균주의 성장으로 하였다. 에탄올 내성은 에탄올이 각각 0, 5, 10, 15%의 농도로 함유된 YPD 액체 배지 10 ml에 전 배양한 효모의 배양액을 0.1% 농도로 접종하고 25°C에서 5일간 배양 후, 600 nm에서 흡광도를 측정하여 균주의 성장을 조사하였다.
- 위 결과를 바탕으로 biogenic amine decarboxylase 활성 미보유 균주, 황화수소 저생성 균주 중심으로 1차 선별 하였으며, 이후 효소 활성능, cerulenin, TFL, SO2, 에탄올 내성 특성 등을 보유한 12 균주를 선별하였다(Table 2).
- 주류 제조에 이용되는 효모는 고농도의 당에서 충분히 생육을 하면서 알코올 발효를 진행할 수 있어야 하므로 선발된 효모 12 균주를 대상으로 포도당이 20%, 30%, 40%로 첨가된 YM 액체 배지에서 생육과 당 내성을 비교하였다(Fig. 2).
- 효모가 생성하는 고급 알코올류와 에스테르 계열의 성분들이 주류의 향을 증진시킬 수 있음을 감안하여, cerulenin과 TFL에 내성을 보유한 효모를 탐색하였다. Cerulenin과 TFL은 isoamyl alcohol과 caproic acid를 생산할 수 있는 균을 선별하는데 사용되어 왔다[8].
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 효모는 전국에서 수집한 발효액 등의 발효식품 126점에서 1,007주를 분리하여 사용하였다. 비교 균주로 시판효모인 Fermivin (Sacchromyces cerevisiae, Gist Brocades, Denmark), Frootzen (Pichia kluyvery, Chr.
이론/모형
- 프라이머[27]로 NL1 (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3') 및 NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')를 사용하여 26S rRNA D1/D2 부위 단편을 증폭 후, ㈜ZEOTECH사에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)의 BLAST를 사용하여 26S rRNA 유전자 단편의 염기서열 상동성을 비교하였으며, 염기서열은 DNASTAR pro software (SeqMan Pro, Ver 8.1.5., Lasergene)를 이용하여 수행하였다. 효모의 계통분석도(phylogenetic tree) 작성은 GenBank에 보고된 다른 효모 균주의 26S rRNA 염기서열을 비교 분석하여, MEGA version 4.
- ) 활성을 확인하였다. 한천 평판법으로 실험하였고 각 효소의 적합한 한천 평판을 만든 후 분리 효모를 접종하여 효소활성 유무를 확인하였다. β-Glucosidase 활성은 esculin (Sigma-Aldrich Co.
- , Lasergene)를 이용하여 수행하였다. 효모의 계통분석도(phylogenetic tree) 작성은 GenBank에 보고된 다른 효모 균주의 26S rRNA 염기서열을 비교 분석하여, MEGA version 4.0 [24]의 neighbor-joining method [20]로 작성하였다.
성능/효과
- 바이오제닉아민류는 단백질을 함유한 식품이 미생물에 의해 분해되는 과정에서 생성되며, 알러지 유발물질인 히스타민(histamine)과 티라민(tyramine)이 대표적이다[18]. Amino acid decarboxylase 활성을 보유한 효모는 바이오제닉아민류 생성 가능성이 높으며, 각 아미노산 기질을 바이오제닉아민류로 변화시킨 균주를 조사한 결과, histidine은 69 균주, tyrosine은 306 균주, phenylanine은 171 균주, tryptophane은 23 균주, lysine은 197 균주, leucine은 198 균주로 나타났다. 또한 cerulenin, TFL, SO2, 에탄올 내성 균주 및 황화수소 생성능에 대한 결과는 Table 1에 나타내었다.
- 선별된 12주의 효모 중 cerulenin과 TFL에 대하여 내성을 나타낸 효모는 각각 8, 7 균주로 나타났다(Table 3). N43-8, N56-10, N77-4, SM2-7, Y447, Y685 및 HP1-2 균주는 cerulenin과 TFL에 대한 내성을 동시에 가지며, CM4-5 균주는 cerulenin 내성만 가지는 것으로 나타났다. A9-1, BY30-1, M1-9, SD1-2 효모와 시판효모인 S.
- 4), S. cerevisiae SD1-2 균주의 에탄올 생성량이 9.5%로 가장 우수하였으며, S. cerevisiae 속 균주들은 최소 7.
- S. cerevisiae 효모 중에서 BY30-1 균주를 제외하고, 대체적으로 포도당 40%가 첨가된 YM 액체 배지에서 양호한 생육을 나타내었다. non-Saccharomyces 효모 중에서는 H.
- 3), 배양 5일 뒤 S. cerevisiae 효모 중에서 BY30-1를 제외하고는 10% 에탄올 첨가한 YM 액체 배지에서 효모의 생육은 양호하였으나 15% 에탄올 농도에서는 모두 생육이 낮게 나타났다. non-Saccharomyces 효모 중에서는 균주마다 다른 특성이 나타났다.
- cerevisiae, P. kluyvery보다 분리 효모인 N43-8, N77-4, SM2-7, Y685, BY30-1, M1-9, SD1-2 등 7 균주가 더 우수한 것으로 나타났다.
- opuntiae HP1-2, C. tropicalis Y447 균주를 제외하고 포도당 40%가 첨가된 YM 액체 배지에서 생육이 양호한 것으로 보아 내당성이 우수하며 주류 제조에 사용 가능성이 충분한 것으로 판단된다.
- Protease의 경우, 약한 활성을 보인 균주가 7균주로 나타났다. 또한, amino acid decarboxylase 활성은 선발 효모와 시판 효모 모두 음성으로 나타난 것으로 보아 바이오제닉아민류 생성 가능성이 매우 낮을 것으로 예상되었다.
- Cerulenin과 TFL은 isoamyl alcohol과 caproic acid를 생산할 수 있는 균을 선별하는데 사용되어 왔다[8]. 선별된 12주의 효모 중 cerulenin과 TFL에 대하여 내성을 나타낸 효모는 각각 8, 7 균주로 나타났다(Table 3). N43-8, N56-10, N77-4, SM2-7, Y447, Y685 및 HP1-2 균주는 cerulenin과 TFL에 대한 내성을 동시에 가지며, CM4-5 균주는 cerulenin 내성만 가지는 것으로 나타났다.
- cerevisiae는 SO2에 대한 내성이 높은 것으로 나타났다. 알코올 내성에 대해서는 대부분의 효모가 높은 내성을 보였으며, 그 중 N56-10, Y447 균주는 알코올 내성이 상대적으로 낮은 것으로 나타났다. 황화수소는 와인이나 알코올 음료에 좋지 않는 냄새로 미생물 발효에 의해 생성될 수 있는데[5], 본 연구에 사용한 시판효모를 포함하여 대부분의 효모는 황화수소 생성능이 낮았으며, SM2-7, Y447, CM4-5, M1-9, SD1-2, HP1-2 균주는 생성능이 거의 없는 것으로 보아 와인이나 전통주 발효산업에 사용 가능할 것으로 기대된다.
- 알코올 내성에 대해서는 대부분의 효모가 높은 내성을 보였으며, 그 중 N56-10, Y447 균주는 알코올 내성이 상대적으로 낮은 것으로 나타났다. 황화수소는 와인이나 알코올 음료에 좋지 않는 냄새로 미생물 발효에 의해 생성될 수 있는데[5], 본 연구에 사용한 시판효모를 포함하여 대부분의 효모는 황화수소 생성능이 낮았으며, SM2-7, Y447, CM4-5, M1-9, SD1-2, HP1-2 균주는 생성능이 거의 없는 것으로 보아 와인이나 전통주 발효산업에 사용 가능할 것으로 기대된다.
- 일반적으로 일정 수준 이상의 에탄올 농도에서는 효모 생육이 저해되어 더 이상 알코올 발효가 일어나지 않는 것으로 알려져 있으며[24], 주류 등 알코올 발효음료 제조용 효모는 에탄올에 우수한 내성을 보유하는 것이 바람직하다. 효모 12 균주를 대상으로 에탄올을 5%, 10%, 15% 농도로 첨가한 YM 액체 배지에서 효모 생육과 에탄올을 첨가하지 않은 YM 액체 배지에서의 생육을 비교한 결과(Fig. 3), 배양 5일 뒤 S.
후속연구
- cerevisiae와 대조적인 결과를 나타내었다. Cerulenin과 TFL에 내성을 나타낸 7주의 효모는 고급 알코올류와 에스테르 계열의 향기성분을 생산할 수 있을 것으로 예상되며, 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다. SO2에 대하여 내성을 나타낸 효모는 2 균주로 A9-1과 HP1-2로 나타났다.
- 1%로 나타나 막걸리 제조시 좋은 후보 균주가 될 수 있다고 보고하였다. 또한 Pichia 속 효모와 non-Saccharomyces 속 효모들은 와인 등의 아로마 형성에 중요한 역할을 한다고 알려져[3, 23] 본 연구에서 선발한 7주의 non-Saccharomyces 속 효모 균주 역시 추가적인 주류 제조 연구를 진행하고 있으며 독특한 향미를 가진 주류 발효음료 제조 가능성이 있을 것으로 판단된다.
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