MCF-7 인체 유방암 세포에서 옻나무 추출물이 p53-Dependent G1 Cell Cycle에 미치는 영향 Induction of p53-Dependent G1 Cell Cycle Arrest by Rhus verniciflua. Stokes Extract in Human Breast Carcinoma MCF-7 Cells원문보기
Objectives : In Korea, Rhus verniciflua Stokes (RVS) has been used in traditional medicine for various diseases such as back pain, syndromes of the blood system in women, gastrointestinal disease, and cancer. However, the molecular mechanisms of its anti-cancer activity have not been clearly elucida...
Objectives : In Korea, Rhus verniciflua Stokes (RVS) has been used in traditional medicine for various diseases such as back pain, syndromes of the blood system in women, gastrointestinal disease, and cancer. However, the molecular mechanisms of its anti-cancer activity have not been clearly elucidated yet. Methods : This study investigated the possible mechanisms by which RVS extract (RVE) exerts its anti-proliferative action in cultured human breast carcinoma MCF-7 cells. Results : Treatment with RVE in MCF-7 cells resulted in inhibition of cell viability through G1 arrest of the cell cycle and induction of apoptosis in a time- and concentration-dependent manner, as determined by MTT assay and flow cytometry analysis. The induction of G1 arrest by RVE treatment was associated with the inhibition of cyclin D1, cyclin-dependent kinase (Cdk) 2, retinoblastoma protein (pRB), and mouse double minute 2 (MDM2) expression. Moreover, RVE treatment concentration dependently increased the levels of tumor suppressor p53, which was associated with the marked induction of Cdk inhibitors such as p21 (Waf1/Cip1) and p27 (Kip1). However, the inhibition of p53 function by the wild-type p53-specific inhibitor, pifithrin-α, abolished the above-mentioned effects of RVE, showing that p53 was responsible for the cytotoxicity of RVE Conclusions : These data indicate that a molecular pathway involving p53-dependent G1 cell cycle arrest plays a pivotal role in the cellular response to RVE, and demonstrate the potential applications of RVE as an anti-cancer drug for breast cancer treatment.
Objectives : In Korea, Rhus verniciflua Stokes (RVS) has been used in traditional medicine for various diseases such as back pain, syndromes of the blood system in women, gastrointestinal disease, and cancer. However, the molecular mechanisms of its anti-cancer activity have not been clearly elucidated yet. Methods : This study investigated the possible mechanisms by which RVS extract (RVE) exerts its anti-proliferative action in cultured human breast carcinoma MCF-7 cells. Results : Treatment with RVE in MCF-7 cells resulted in inhibition of cell viability through G1 arrest of the cell cycle and induction of apoptosis in a time- and concentration-dependent manner, as determined by MTT assay and flow cytometry analysis. The induction of G1 arrest by RVE treatment was associated with the inhibition of cyclin D1, cyclin-dependent kinase (Cdk) 2, retinoblastoma protein (pRB), and mouse double minute 2 (MDM2) expression. Moreover, RVE treatment concentration dependently increased the levels of tumor suppressor p53, which was associated with the marked induction of Cdk inhibitors such as p21 (Waf1/Cip1) and p27 (Kip1). However, the inhibition of p53 function by the wild-type p53-specific inhibitor, pifithrin-α, abolished the above-mentioned effects of RVE, showing that p53 was responsible for the cytotoxicity of RVE Conclusions : These data indicate that a molecular pathway involving p53-dependent G1 cell cycle arrest plays a pivotal role in the cellular response to RVE, and demonstrate the potential applications of RVE as an anti-cancer drug for breast cancer treatment.
본 연구에서는 옻나무 추출물(RE)의 항암효과에 관한 생화학적인 기전을 밝히기 위하여 MCF-7 인체 유방암 세포에서의 성장억제 정도와 세포주기 조절과 관련된 주요 인자들의 발현 변화를 조사한 결과 몇 가지 중요한 유전자들의 발현 변화에 대한 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
이에 저자는 이미 진행된 실험 결과 및 비록 증례 보고이지만 임상적 효능이 추론되는 유방암 세포주를 대상으로 옻나무추출물의 작용기전을 검증하고자 하였다. 본 연구에서는 RE의 항암활성 기전을 연구하기 위하여 인체 유방암 MCF-7 세포를 이용하였으며, MCF-7 세포의 증식에 미치는 RE의 영향을 조사하기 위하여 MTT assay를 실시한 결과, RE의 처리 농도 및 시간이 증가될수록 MCF-7 유방암세포의 증식이 현저히 감소하였고 이는 세포주기 G1 arrest 및 apoptosis 유발과 연관성이 있었다.
제안 방법
다음은 RE의 처리에 의한 MCF-7 세포의 증식억제가 세포주기 특정 시기의 진행억제와 연관성을 지니는지의 여부를 조사하기 위하여 MCF-7 세포의 세포주기 분포에 미치는 RE의 영향을 조사하였다. 이를 위하여 정상 및 다양한 농도의 RE가 처리된 배지에서 24시간 및 48시간 배양한 후 flow cytometry를 이용하여 분석하였다.
상기 결과에 의하면 RE 처리에 의한 MCF-7 세포의 증식억제가 G1 arrest와 연관이 있었기에, 이와 연관된 기전 해석을 위하여 세포주기 G1 조절과 연관된 주요 유전자들의 발현에 미치는 RE의 영향을 조사하였다. Fig.
이상에서 관찰된 RE 처리에 의한 p53의 발현 증가가 RE의 MCF-7 세포 증식 억제에 어떤 의미를 가지는지를 조사하기 위하여 정상 p53 유전자의 활성을 선택적으로 차단하는 pifithrin-α10를 적용하였다. Fig.
인체 유방암 MCF-7 세포에서 RE 처리에 의한 증식 억제 현상을 조사하기 위하여 RE를 적정 농도로 24시간 및 48시간 동안 처리한 후 MTT assay를 실시하였다. Fig.
대상 데이터
본 실험에 사용된 RE는 충북 옥천군 소재 (주) 참옻들에서 생산된 참옻 분말을 구입하여 사용하였다. 참옻 분말의 생산은 충북 옥천군 소재의 20년 이상 된 참옻나무를 특허 제 10-1228119호, 특허 제10-0763320호의 의거하여 제조(수율 7.
본 실험에 사용한 인체 유방암 MCF-7 세포는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 분주 받아 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS: Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 및 1%의 penicillin 및 streptomycin이 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL)를 사용하여 37 ℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
본 실험에 사용된 RE는 충북 옥천군 소재 (주) 참옻들에서 생산된 참옻 분말을 구입하여 사용하였다. 참옻 분말의 생산은 충북 옥천군 소재의 20년 이상 된 참옻나무를 특허 제 10-1228119호, 특허 제10-0763320호의 의거하여 제조(수율 7.5%)되었다. 준비된 RE는 3차 증류수에 녹여 100 mg/ml의 stock solution으로 만든 다음 이를 적정 농도로 배지에 희석하여 처리하였다.
데이터처리
모든 실험결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였고 SigmaPlot(Systat Software Inc., San Jose, CA, USA)을 이용하여 Student t-test를 이용하여 통계적 유의성을 얻었다.
이론/모형
RE 처리에 의한 MCF-7 세포의 증식 억제 정도를 확인하기 위하여 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium(MTT) assay를 이용하였다. 이를 위하여 MCF-7 세포에 적정 농도의 RE를 처리하고 24시간 또는 48시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 MTT(Sigma-Aldrich Chemical Co.
성능/효과
RE 처리에 의한 MCF-7 세포의 증식 억제가 apoptosis 유발과 연관성이 있는지를 조사하기 위하여 annexin V 염색을 이용하여 flow cytometry 분석을 실시한 결과, 현저한 apoptosis 유발 효과는 없었지만, RE의 처리 농도 및 시간이 증가할수록 유의적인 apoptosis 유발 증가를 확인할 수 있었다(Fig. 1B).
본 연구에서 RE는 MCF-7 세포의 증식을 처리 농도 및 시간 의존적으로 억제시켰으며, 이는 세포주기 G1 arrest 및 apoptosis 유발과 연관성이 있음을 MTT assay 및 flow cytometry 분석으로 확인하였다. RE에 의한 MCF-7 세포의 G1 arrest는 cyclin D1, Cdk2, pRB 및 MDM2의 발현 저하와 연관성이 있었다. 또한 RE는 처리 농도 의존적으로 종양억제 유전자 p53의 발현을 매우 증가시켰으며, Cdk 억제자인 p21(Waf1/Cip1) 및 p27(Kip1)의 발현 증가가 동반되었다.
또한 RE는 처리 농도 의존적으로 종양억제 유전자 p53의 발현을 매우 증가시켰으며, Cdk 억제자인 p21(Waf1/Cip1) 및 p27(Kip1)의 발현 증가가 동반되었다. 그러나 p53 선택적 억제제인 pifithrin-α에 의한 p53의 발현 억제는 p21(Waf1/Cip1)의 발현 억제뿐 만 아니라 RE에 의한 G1 arrest를 해리시켰다. 따라서 본 연구의 결과는 RE가 p53 의존적인 G1 arrest를 통하여 MCF-7 세포의 증식을 억제시켰음을 의미하며, RE는 p53을 정상적으로 가지는 유방암 치료제 개발의 활용에 사용될 수 있음을 보여주는 것이다.
진핵세포의 세포주기조절은 각 주기별 관여하는 다양한 유전자들에 의해 조절되는데, 기본적으로 세포주기 checkpoint 각 시기에 요구되어지는 양성 조절인자인 cyclins에 의 하여 Cdks의 연속적인 활성과 불활성 및 Cdk 저해인자의 발현 정도에 따라 결정되어 진다17,19. 따라서 RE의 처리에 의한 MCF-7 세포의 증식억제가 세포주기 특정 시기의 진행 억제와 연관성을 지니는지의 여부를 조사하기 위하여 MCF-7 세포의 세포주기 분포에 미치는 RE의 영향을 조사한 결과, G1기에 해당되는 세포의 빈도 증가에 따라 S 및 G2/M기에 속하는 세포의 빈도가 상대적으로 감소되어 RE 처리에 MCF-7 세포의 증식억제는 세포주기 G1 arrest와 연관이 있었다(Table 1).
따라서 본 연구의 결과는 비록 RE가 cyclin E나 Cdk4 및 Cdk6 등의 발현에는 큰 변화를 주지 못하지만, p21(Waf1/Cip1) 및 p27(Kip1)의 발현 증 가와 동반된 pRB의 발현을 억제하여 cyclins/Cdks complex의 활성을 저해하며, 그로 인하여 S기 진입에 요구되는 인자들의 발현을 억제하는 것으로 추정된다. 또한 이러한 모든 RE의 항암활성이 p53 의존적으로 이루어지며, p53이 정상인 암세포의 증식 제어를 위한 RE의 활용 가능성이 높을 것으로 사료된다.
RE에 의한 MCF-7 세포의 G1 arrest는 cyclin D1, Cdk2, pRB 및 MDM2의 발현 저하와 연관성이 있었다. 또한 RE는 처리 농도 의존적으로 종양억제 유전자 p53의 발현을 매우 증가시켰으며, Cdk 억제자인 p21(Waf1/Cip1) 및 p27(Kip1)의 발현 증가가 동반되었다. 그러나 p53 선택적 억제제인 pifithrin-α에 의한 p53의 발현 억제는 p21(Waf1/Cip1)의 발현 억제뿐 만 아니라 RE에 의한 G1 arrest를 해리시켰다.
본 연구에서 RE는 MCF-7 세포의 증식을 처리 농도 및 시간 의존적으로 억제시켰으며, 이는 세포주기 G1 arrest 및 apoptosis 유발과 연관성이 있음을 MTT assay 및 flow cytometry 분석으로 확인하였다. RE에 의한 MCF-7 세포의 G1 arrest는 cyclin D1, Cdk2, pRB 및 MDM2의 발현 저하와 연관성이 있었다.
그 중 CIP/KIP family에 속하는 p21(Waf1/Cip1) 및 p27(Kip1)은 DNA 손상에 의한 종양 억제인자인 p53에 의해 조 절을 받는다고 알려져 있다19,25,26. 본 연구에서 RE에 의한 MCF-7 세포의 증식억제가 G1 arrest와 연관이 있었기에, 이와 연관된 기전 해석을 위하여 몇 가지 유전자들의 발현에 미치는 RE의 영향을 조사한 결과 다양한 인자들 중에서 cyclin D1 및 Cdk2의 발현뿐만 아니라 pRB의 발현도 저해되었다(Fig. 2).
이에 저자는 이미 진행된 실험 결과 및 비록 증례 보고이지만 임상적 효능이 추론되는 유방암 세포주를 대상으로 옻나무추출물의 작용기전을 검증하고자 하였다. 본 연구에서는 RE의 항암활성 기전을 연구하기 위하여 인체 유방암 MCF-7 세포를 이용하였으며, MCF-7 세포의 증식에 미치는 RE의 영향을 조사하기 위하여 MTT assay를 실시한 결과, RE의 처리 농도 및 시간이 증가될수록 MCF-7 유방암세포의 증식이 현저히 감소하였고 이는 세포주기 G1 arrest 및 apoptosis 유발과 연관성이 있었다. 또한 RE에 의한 G1 arrest는 종양 억제 유전자 p53 의존적 p21(Waf1/Cip1)의 발현 증가와도 연관성이 있었다.
3). 특히 p53의 발현 증가에 동반한 p21(Waf1/Cip1) 및 p27(Kip1)의 발현 증가는 RE에 의해 증가된 p53과 연관이 있을 것으로 추정되어 p53의 선택적 저해제인 pifithrin-α를 전처리한 결과 p53의 발현 억제뿐만 아니라 p21(Waf1/Cip1)의 발현도 완벽하게 차단되었다(Fig. 4).
후속연구
그러나 p53 선택적 억제제인 pifithrin-α에 의한 p53의 발현 억제는 p21(Waf1/Cip1)의 발현 억제뿐 만 아니라 RE에 의한 G1 arrest를 해리시켰다. 따라서 본 연구의 결과는 RE가 p53 의존적인 G1 arrest를 통하여 MCF-7 세포의 증식을 억제시켰음을 의미하며, RE는 p53을 정상적으로 가지는 유방암 치료제 개발의 활용에 사용될 수 있음을 보여주는 것이다.
따라서 본 연구의 결과는 비록 RE가 cyclin E나 Cdk4 및 Cdk6 등의 발현에는 큰 변화를 주지 못하지만, p21(Waf1/Cip1) 및 p27(Kip1)의 발현 증 가와 동반된 pRB의 발현을 억제하여 cyclins/Cdks complex의 활성을 저해하며, 그로 인하여 S기 진입에 요구되는 인자들의 발현을 억제하는 것으로 추정된다. 또한 이러한 모든 RE의 항암활성이 p53 의존적으로 이루어지며, p53이 정상인 암세포의 증식 제어를 위한 RE의 활용 가능성이 높을 것으로 사료된다.
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