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문제 정의
- 이 물질은 양릉천 자침 시 파킨슨병 동물 모델의 뇌 내 흑질에서 유의하게 증가하여 도파민성신경세포의 보호에 관여하는 것으로 알려져 있으나 9) , 선조체에서도 변화가 있는가는 아직까지 밝혀진 바가 없었 다. 따라서 본 연구에서는 선조체에서도 Akt의 발현이 유의하게 증가하는가를 확인하였다. 그 결과 Kim 등의 연구 결과처럼 MPTP 투여로 인한 흑질의 Akt 인산화의 감소 및 양릉천 자침으로 인한 Akt 인산화의 회복을 확인하였으나, 선조체의 경우 MPTP 투여 5일째의 MPTP군을 제외하고는 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
- 이에 저자들은 MPTP로 파킨슨병을 유도한 생쥐를 이용하여 양릉천 자침의 운동 기능 개선 효과, 흑질 및 선조체의 도파민성 신경 세포 보호 효과, DAT, caspase-3및 Akt의 발현 정도를 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 1×1×50 cm 나무로 제작된 pole에 생쥐를 꼭대기에 올려두고 내려오는 시간을 그룹별로 2차례에 걸쳐(실험 시작 직전, 12일째 마지막 자침 후 2시간 뒤) 실시하였다.
- 12일째 pole test 직후 군 당 6마리씩 생쥐의 뇌를 적출하여 Western blotting을 실시하였다. 생쥐들을 CO2를 이용하여 희생시킨 후, 생쥐의 흑질 및 선조체를 각각 채취하고, 이 조직에 RIPA buffer(LPS solution, 대전, 한국)와 phenylmethylsulfonylfluoride (Sigma, St.
- 12일째 pole test 직후 군 당 6마리씩 생쥐의 뇌를 적출한 후 면역조직염색화학법을 실시하였다. 생쥐들을 포란액(isoflurane, 중외 제약)으로 마취시킨 후, phosphate buffered saline(PBS)으로 관류를 하여 체내의 혈액을 모두 제거하고, 바로 4% paraformaldehyde(PFA) 용액을 관류시켜 조직을 고정시키고 생쥐의 뇌를 적출하였다.
- MPTP로 유도한 파킨슨병 동물 모델을 사용하여, 양릉천 및 후계 자침에 따른 파킨슨병의 치료 효과 및 기전을 비교하고 분석한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- Pole test를 이용하여 생쥐의 운동 능력을 평가하였다. MPTP 투여 전에 막대기 끝에서 바닥까지 내려오는 시간을 측정한 결과 정상군은 13.
- 『素問 至眞要大論』의 病機十九條에서 “諸風掉眩 皆屬於肝”, “諸暴强直 皆屬於風”이라 하여 파킨슨병의 주요 증상 중 하나인 진전, 관절 경화, 서동증을 기술한 이래로, 파킨슨병과 유사한 증상을 震顫, 痓, 痙, 瘈瘲, 攣, 中風 등 다양한 표현으로 서술하였으며 4) 그 병인(病因)을 肝腎陰虛, 氣血兩虛, 積熱痰火, 氣滯血瘀, 肝風內動 등으로 파악하였다.
- 일차항체로는 anti-phospho-Akt antibody(Cell Signaling, Danvers, 미국), anti-Akt-antibody(Cell signaling) 및 anti-β- actin antibody(Santa Cruz Biotechnology)를 이용하였다. 그 후 membrane을 0.1% Tween-20이 함유된 TBS에 2차 항체를 1 : 2000으로 희석시킨 용액에 다시 담근 후 상온에서 1시간 반응시키고 enhanced chemiluminescence kit(Thermo Scientific, Rockford, 미국)를 이용하여 단백질의 발현을 확인하였다.
- 일차 항체로는 anti-tyrosine hydroxylase(TH) antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, 미국), anti-DAT antibody(Abcam, Cambridge, 영국), anti-caspase-3 antibody(Santa Cruz Biotechnology)를 각각 사용하였다. 그 후 이차항체(goat anti-rabbit IgG(Vector Laboratories Inc., Burlin- game, CA, 미국)를 조직과 상온에서 1시간 동안 반응시키고, Avidin Biotin Complex(Vector Laboratories Inc.)를 만들어 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 마지막으로 diaminobenzidine (Vector Laboratories Inc.
- 뇌 조직을 cryotome(Leica Microsystems, Wetzlar, 독일)을 이용하여 35 μm의 두께로 절편을 하였고, 흑질과 선조체를 선별하여 면역조직염색화학법을 실시하였다.
- 생쥐들을 CO2를 이용하여 희생시킨 후, 생쥐의 흑질 및 선조체를 각각 채취하고, 이 조직에 RIPA buffer(LPS solution, 대전, 한국)와 phenylmethylsulfonylfluoride (Sigma, St. Louis, 미국) 용액을 넣어 분쇄기로 분쇄한 후, 원심분리기를 이용하여 12,000 rpm에서 4ºC를 유지하고 20분간 원심분 리를 실시하였다.
- 12일째 pole test 직후 군 당 6마리씩 생쥐의 뇌를 적출한 후 면역조직염색화학법을 실시하였다. 생쥐들을 포란액(isoflurane, 중외 제약)으로 마취시킨 후, phosphate buffered saline(PBS)으로 관류를 하여 체내의 혈액을 모두 제거하고, 바로 4% paraformaldehyde(PFA) 용액을 관류시켜 조직을 고정시키고 생쥐의 뇌를 적출하였다. 적출된 뇌를 24시간동안 PFA에 담궈 완전히 고정시키고, 30% sucrose 용액에 담근 후 조직을 절편할 때까지 4ºC 냉장고에 보관하였다.
- 첫 MPTP 투여 후 2시간 뒤에 첫 자침을 실시하였고, 그 후 24시간 간격으로 1일 1회 총 12회 자침을 실시하였다. 자침 경혈은 후계군의 경우 수태양소장경의 후계(SI3)에 자침하였으며, 양릉천군의 경우 족소양담경의 양릉천(GB34)에 자침하였다. 침은 0.
- 1). 정상군과 MPTP군에도 침 시술을 받은 군과 동일한 스트레스를 주기 위해 보조자가 침 시술 시간과 같은 시간 동안 움직이지 않도록 고정시킨 후 풀어주었다.
- 총 48마리의 동물을 무작위로 정상군(Saline group), MPTP군 (MPTP group), 후계군(MPTP+SI3), 양릉천군(MPTP+GB34)의 4 가지 군에 군당 12마리씩 배정하였다. 정상군은 5일간 1일 1회 같은 시간에 생리식염수 0.1 ml을 복강 내 주입 하였고, 나머지 군들은 파킨슨병을 유발하기 위해서 MPTP(Sigma, St. Louis, MO, USA) 30 mg/kg의 양을 5일간 1일 1회 24시간 간격으로 복강 내주입하였다.
- 첫 MPTP 투여 후 2시간 뒤에 첫 자침을 실시하였고, 그 후 24시간 간격으로 1일 1회 총 12회 자침을 실시하였다. 자침 경혈은 후계군의 경우 수태양소장경의 후계(SI3)에 자침하였으며, 양릉천군의 경우 족소양담경의 양릉천(GB34)에 자침하였다.
- 총 48마리의 동물을 무작위로 정상군(Saline group), MPTP군 (MPTP group), 후계군(MPTP+SI3), 양릉천군(MPTP+GB34)의 4 가지 군에 군당 12마리씩 배정하였다. 정상군은 5일간 1일 1회 같은 시간에 생리식염수 0.
- 침은 0.18 mm× 8 mm 규격의 수지침(동방침구사, 보령, 한국)을 사용하였고, 보조자가 동물이 움직이지 않도록 고정시킨 후에 시술자가 2 mm 깊이로 자침 후 1초에 2회씩 총 60회 염전하고 신속하게 빼내었으며, 좌측 경혈에 먼저 자침한 후 우측 경혈에 자침하였다(Fig. 1).
- A1 microscope(ZEISS, Germany)와 AxioCam ICc3 camera (ZEISS)를 이용하여 조직의 사진을 촬영하였다. 흑질의 도파민성신경세포의 수는 별도의 연구자가 어느 군인지 알지 못하게 한 상태에서 직접 세었으며, 선조체의 TH, DAT 및 caspase-3의 발현은 Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics, Silver Spring, 미국) 프로그램을 이용하여 발현 정도를 측정하였다.
대상 데이터
- )으로 발색한 후 slide glass에 mounting을 시키고, Axio Scope.A1 microscope(ZEISS, Germany)와 AxioCam ICc3 camera (ZEISS)를 이용하여 조직의 사진을 촬영하였다. 흑질의 도파민성신경세포의 수는 별도의 연구자가 어느 군인지 알지 못하게 한 상태에서 직접 세었으며, 선조체의 TH, DAT 및 caspase-3의 발현은 Image-Pro Plus 6.
- ” 12) 라 하였고, 기타 많은 문헌에서 파킨슨병과 유사한 증상들을 震顫, 痓, 痙, 瘈 瘲, 攣, 中風의 偏枯, 中腑症 등으로 표현하였는데 4) , 이들은 모두 筋病 또는 風病의 범주에 속한다고 볼 수 있다. 따라서 역대 의가들은 파킨슨병의 증상이 風邪로 인한 筋의 문제로 발생하게 되었다고 인식한 것으로 판단되며, 그렇기에 본 연구에서는 팔회혈 중 筋會 인 양릉천을 파킨슨병 치료 경혈로 선정하여 사용하였다.
- 실험동물은 체중 20∼22 g의 8주령 C57BL/6계 수컷 검정 생쥐(오리엔트바이오, 한국)를 사용하였으며, 실험 1주일 전부터 실험기간 동안 사육실(온도 22±2ºC)에서 물과 먹이를 자유로이 섭취하도록 하여 실험기간 동안 스트레스 및 환경의 변화에 따른 영향인자를 최소화 하였다.
- 그 후 일차 항체를 50 mM PBS에 1 : 1000의 비율로 희석한 용액에 조직을 넣은 후 상온에서 하루 동안 반응시켰다. 일차 항체로는 anti-tyrosine hydroxylase(TH) antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, 미국), anti-DAT antibody(Abcam, Cambridge, 영국), anti-caspase-3 antibody(Santa Cruz Biotechnology)를 각각 사용하였다. 그 후 이차항체(goat anti-rabbit IgG(Vector Laboratories Inc.
- 일차항체로는 anti-phospho-Akt antibody(Cell Signaling, Danvers, 미국), anti-Akt-antibody(Cell signaling) 및 anti-β- actin antibody(Santa Cruz Biotechnology)를 이용하였다.
데이터처리
- 모든 자료는 평균±표준오차로 나타내었고, 모든 통계는 the Prism 5 for Windows(GraphPad Software Inc., La Jolla, 미국) 프로그램을 사용하였으며, 일원분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 시행한 후 Neuman-Keuls post-hoc test를 사용해 그룹 간 사후 검정을 시행하였다.
이론/모형
- MPTP 투여를 시작한 지 5일 후(마지막 MPTP 투여 후)와 12일 후의 흑질 및 선조체의 Akt의 변화 및 인산화 정도를 Western blotting으로 분석하였다. 흑질의 경우 MPTP 투여 5일 후 및 12일 후에 MPTP를 투여한 모든 동물의 Akt 인산화가 유의하게 감소되었으나, 양릉천군의 경우 MPTP 투여 12일 후에 흑질에서 MPTP군및 후계군에 비해 유의한 증가가 관찰되었다(p＜0.
- Louis, 미국) 용액을 넣어 분쇄기로 분쇄한 후, 원심분리기를 이용하여 12,000 rpm에서 4ºC를 유지하고 20분간 원심분 리를 실시하였다. 그 후 상층액을 불순물이 섞이지 않게 채취해고, Bradford 방법을 이용하여 단백질의 양을 정량한 뒤, 샘플 당 30 ㎍ 의 단백질을 12% polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시하여 분리하고, 이를 nitrocelluloase membrane(GE healthcare, Pittsburgh, 미국)에 옮겨 붙였다. Membrane을 tris-buffered salineTBS)에 5% bovine serum albumin(Bovogen, Essendon, 호주)을 첨가한 용액에 담근 상태로 상온에서 1시간동안 blocking 한 후, 5% BSA가 함유된 TBS 용액에 일차항체를 1 : 1000으로 희석한 후 membrane을 넣고 4ºC에서 하루 동안 반응시켰다.
- 행동 측정실험으로는 파킨슨병 생쥐 모델에 가장 적합하다고 알려진 Abe 등이 제시한 pole test를 사용 하였다 10) . 1×1×50 cm 나무로 제작된 pole에 생쥐를 꼭대기에 올려두고 내려오는 시간을 그룹별로 2차례에 걸쳐(실험 시작 직전, 12일째 마지막 자침 후 2시간 뒤) 실시하였다.
성능/효과
- 1. MPTP로 유도된 생쥐의 파킨슨병 발병 정도를 pole test를 이용하여 비교, 평가한 결과 양릉천 자침이 MPTP로 인한 운동 장애를 유의하게 감소시켰다.
- 2. MPTP 투여는 흑질과 선조체의 도파민성신경세포를 유의하게 파괴시켰으나, 양릉천을 자침하는 경우 이 파괴가 유의하게 억제되었다.
- 3. MPTP 투여는 선조체 내 도파민수송체의 발현을 억제하였으 나, 양릉천 자침이 도파민수송체의 발현을 회복시켰다.
- 4. MPTP 투여는 선조체 내 caspase-3의 발현을 증가시켰으나, 양릉천 자침이 이를 유의하게 억제하였다.
- 5. MPTP 투여는 흑질 및 선조체 내 Akt 인산화를 억제하였으나, 양릉천 자침이 흑질의 Akt 인산화를 회복시켰다.
- MPTP 투여 전에 막대기 끝에서 바닥까지 내려오는 시간을 측정한 결과 정상군은 13.29±1.16초, MPTP군은 13.04±1.87초, 후계군은 13.79±3.62초, 양릉천군은 13.04±1.67초가 소요되었으며, 군 간의 통계적 유의성은 없었다.
- MPTP 투여를 시작한지 12일 후 DAT의 발현을 조사한 결과, 정상군(100±4.40%)에 비해 MPTP군에서 DAT의 발현이 유의하게 감소되었음을 확인하였다(73.09± 8.81%, p＜0.05).
- MPTP 투여를 시작한지 12일 후 caspase-3의 발현을 조사한 결과, MPTP군의 경우 정상군(100±6.21%)에 비해 발현이 유의하게(121±4.66%, p＜0.05) 증가하였고, 후계군의 경우 발현이 약간 증가하였지만(115.9±2.94%) 유의하지는 않았다.
- MPTP 투여를 시작한지 12일 후에 흑질 내 도파민성신경세포의 수를 측정한 결과, 정상군(100±11.7%)에 비해 MPTP군의 도파민 성신경세포가 유의하게 감소되었으며(44.72±7.63%, p＜0.01), 후계군 또한 정상군에 비해 도파민성신경세포가 유의하게 감소하였다(51.93±7.36%, p＜0.01).
- 따라서 본 연구에서는 선조체에서도 Akt의 발현이 유의하게 증가하는가를 확인하였다. 그 결과 Kim 등의 연구 결과처럼 MPTP 투여로 인한 흑질의 Akt 인산화의 감소 및 양릉천 자침으로 인한 Akt 인산화의 회복을 확인하였으나, 선조체의 경우 MPTP 투여 5일째의 MPTP군을 제외하고는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 이는 Akt의 인산화가 선조체보다 흑질에서 더욱 활발하게 일어나는 것을 의미하며, 또한 양릉천 자침이 Akt 이외의 다른 세포 보호 기전을 활성화 할 가능성이 있음을 암시한다.
- 본 연구는 양릉천 자침이 파킨슨병 동물 모델에서 동물들의 운동 기능을 회복시키고, 도파민성신경세포의 파괴를 억제하며, 흑질내 Akt의 인산화를 증가시킨다는 것을 확인하였다.
- . 본 연구에서는 MPTP 투여 시 선조체에서 caspase-3의 발현이 유의하게 증가되며, 양릉천 자침이 이를 유의하게 억제함을 확인하였다. 이는 양릉천 자침이 MPTP 투여로 인한 도파민성신경세포의 사멸을 억제하는 효과가 있음을 암시한다.
- 또한 Kim 등의 연구에서는 양릉천 자침이 선조체의 도파민 대사를 활성화하고 도파민의 분비를 촉진함으로써 운동 기능을 회복시킨다고 보고하였는데 13) , 신경세포 내 도파민의 양은 한정되어있으므로 지속적인 분비를 위해서는 도파민의 재흡수가 필수적이다. 본 연구에서는 MPTP를 투여하는 경우 도파민수송체의 발현이 감소되었으나, 양릉천에 자침하는 경우 도파민수송체의 발현량이 회복되는 것으로 나타났다. 이는 양릉천 자침이 MPTP로 인한 선조체 내 축색돌기의 파괴를 억제하고, 아울러 도파민의 재흡수를 정상화함으로써 도파민성신경세포의 기능을 유지시키고 운동 기능을 회복시키는 것으로 판단된다.
- 실제로 행동실험 결과 양릉천에 침 치료를 받은 동물들은 침 치료를 받지 않은 동물들에 비해 유의하게 운동 기능을 유지하고 있는 것으로 나타났으며, 흑질 및 선조체의 도파민성신경세포의 파괴 정도를 확인한 결과 또한 양릉천 자침이 도파민성신경세포의 파괴를 유의하게 억제하는 것으로 나타났다. 파킨슨병의 증상은 흑질 및 선조체의 도파민성신경세포의 파괴로 나타나기에, 양릉천 자침이 MPTP 투여로 인한 도파민성신경세포의 파괴를 억제함으로써 동물의 운동 기능을 유지시키는 것으로 사료된다.
- 이상을 종합해 볼 때, 양릉천 자침은 Akt 인산화를 촉진시킴으로써 MPTP로 유발된 파킨슨병 모델에서 나타나는 흑질 및 선조체의 도파민성신경세포 파괴를 억제하는 것으로 사료된다. 본 연구를 통해 양릉천 자침이 실제 임상에서도 파킨슨병의 치료에 도움이 될 수 있을 것으로 판단되나, 이에 대해서는 추가적인 연구가 더 필요 하다.
- 정상 군(100±10.96%)에 비해 MPTP군(64.3±7.26%)의 TH 발현이 유의하게(p＜0.05) 감소되었으며, 후계군 또한 발현이 감소되었으나 (80.19±8.87) 통계적 유의성은 없었고, 양릉천군은 MPTP군에 비해 유의하게(p＜0.05) 발현이 증가되었다(95.96±4.23%, Fig. 4).
- 하지만 MPTP 투여 및 12번의 침 치료후 다시 측정한 결과 정상군은 15.33±1.87초가 소요되었는데, MPTP군의 경우 32.75±5.74초가 소요되어 유의하게(p＜0.05) 내려오는 시간이 증가하였다.
- 후계군은 정상군에 비해 발현이 감소되었으나 통계적 유의성은 없었으나 (85.81±5.22%), 양릉천군의 경우 DAT의 발현이 108.8±5.07%로 MPTP군(p＜0.01) 및 후계군(p＜0.05) 에 비해 유의하게 증가하였다(Fig. 5).
- MPTP 투여를 시작한 지 5일 후(마지막 MPTP 투여 후)와 12일 후의 흑질 및 선조체의 Akt의 변화 및 인산화 정도를 Western blotting으로 분석하였다. 흑질의 경우 MPTP 투여 5일 후 및 12일 후에 MPTP를 투여한 모든 동물의 Akt 인산화가 유의하게 감소되었으나, 양릉천군의 경우 MPTP 투여 12일 후에 흑질에서 MPTP군및 후계군에 비해 유의한 증가가 관찰되었다(p＜0.05). 선조체의 경우 MPTP를 투여한 모든 군에서 MPTP 투여 5일째에 Akt 인산화의 감소가 관찰되었으나 MPTP군에서만 유의하였으며(p＜0.
후속연구
- 이는 양릉천 자침이 MPTP 투여로 인한 도파민성신경세포의 사멸을 억제하는 효과가 있음을 암시한다. 다만 caspase-3의 경우 활성화되어야 세포의 사멸을 유도하게 되는데, 본 연구에서는 caspase-3의 양을 측정하였을 뿐 그 활성화 정도는 확인하지 못했다. 이에 대해서는 추후 심도 있는 연구를 통해 확인할 것이다.
- 이상을 종합해 볼 때, 양릉천 자침은 Akt 인산화를 촉진시킴으로써 MPTP로 유발된 파킨슨병 모델에서 나타나는 흑질 및 선조체의 도파민성신경세포 파괴를 억제하는 것으로 사료된다. 본 연구를 통해 양릉천 자침이 실제 임상에서도 파킨슨병의 치료에 도움이 될 수 있을 것으로 판단되나, 이에 대해서는 추가적인 연구가 더 필요 하다.
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