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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 어린이집 유아들이 사용하는 칫솔 및 양치 컵의 미생물 오염도와 식중독 미생물의 독소 유전자 및 독소 생산능력을 분석하여 칫솔에 의해 면역력이 취약한 유아들에게 발생할 수 있는 식중독을 사전 예방하고자 하였다.
제안 방법
- aureus 식중균의 독소 유전자 함유 여부를 확인하기 위해 각각 균주를 Tryptic Soy Broth (TSB; Oxoid)에 도말하여 김 등14)의 보고와 동일하게 유전자를 추출한 후 Spectrophotometer (BioPhotometer; Eppendrof, Hamburg, Germany)를 이용 DNA 농도가 1 μg/mL가 되도록 멸균증류수로 희석하였다15). B. cereus 독소 유전자 확인 실험에 사용된 primer sequences는 Table 1 나타내었으며14,15) Polymerase Chain Reaction (PCR) 조건은 initial denaturation 95℃, 300 seconds, denaturation 95℃, 60 seconds, extension 72℃, 120 seconds, final extension 72℃, 300 seconds의 조건으로 35 cycle을 반복하였으며 각각의 annealing 온도는 nheA, hblA 56℃, nheB, nheC 54℃, hblC, hblD, ces 58℃, entFM 60℃, cytK 48℃로 실험하였다. S.
- aureus toxin ID PCR Kit (Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 이용 제조사의 방법에 따라 실험하였으며 Eppendrop thermal cycler (Mastercycler Gradient S)를 이용 PCR 반응을 실시 하였다. 독소 유전자 확인을 위해 PCR product를 Dyne Loading STAR (DyneBio, Seoul, Korea)와 혼합하여 1% agarose gel에 loading한 후 UV transilluminator (Gel Doc 2000; Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용 각각의 밴드를 확인하였다15). B.
- 배양결과 β-heamolysis를 나타내는 균주에 대하여 API Staph test kit (bioMerieux)를 이용하여 생화학시험을 실시 하였고 API Staph version 4.113)를 이용하여 S. aureus를 동정하였다.
- 배양결과 β-hemolysis를 나타내는 균주에 대하여 API 50CHB와 API 20E test kit(bioMerieux, Marcyl’Etoile, France)를 이용하여 생화학시험을 실시하였고, 결과는 API 50CHB version 4.013)를 이용 하여 동정하였다.
- 분리 동정된 B. cereus와 S. aureus 식중균의 독소 유전자 함유 여부를 확인하기 위해 각각 균주를 Tryptic Soy Broth (TSB; Oxoid)에 도말하여 김 등14)의 보고와 동일하게 유전자를 추출한 후 Spectrophotometer (BioPhotometer; Eppendrof, Hamburg, Germany)를 이용 DNA 농도가 1 μg/mL가 되도록 멸균증류수로 희석하였다15).
- 어린이집 유아들이 사용하는 칫솔 및 양치 컵의 미생물 오염도와 분리된 식중독 미생물의 독소 유전자 및 독소 생산능력을 분석하여 칫솔과 양치 컵에 의해 발생할 수있는 식중독을 예방하고자 칫솔 75개, 칫솔걸이 29개, 양치 컵 65개를 실험하였다. 일반세균수는 평균 5.
- 어린이집 유아들이 식사 후 구강 청결을 위해 사용하는 칫솔, 칫솔걸이, 양치 컵의 미생물 오염도를 분석하고자 일반세균수, 대장균군수 및 진균수를 실험하였으며 그 결과는 Table 2에 나타내었다. 일반세균수는 불검출에서 8.
- 에 따라 측정하였으며 평판 당 30~300개의 집락을 형성한 평판을 선택하여 계수할 수 있도록 10단계 희석된 각각의 시험용액과 희석액을 멸균 Petri dish 6매에 각각 1 mL씩 분주하였다. 일반세균수는 Standard Plate Count agar (Oxoid, Basingstoke, England)를 Petri dish 2매에 무균적으로 분주한 후 35℃에서 48시간 배양하였고, 대장균군수는 Desoxycholate Lactose agar (Oxoid)를 Petri dish 2매에 무균적으로 분주한 후 35℃에서 24시간 배양하여 계수 하였다. 진균수는 Potato Dextrose agar (PDA; Difco, Detroit, MI, USA)를 Petri dish 2매에 무균적으로 분주한 후 25℃에서 5일간 배양하여 계수하였다.
대상 데이터
- 3종의 식중독 미생물은 식품공전12)에 따라 실험하였으며 B.cereus는 시험용액 100 μL를 mannitol-egg york-polymycin agar (MYP; Oxied)에 도말하여 35℃에서 24시간 배양한후 lechitinase 활성을 나타내어 혼탁한 환을 갖는 분홍색 집락을 선별 Blood agar (Komed, Seoul, Korea)에 도말하여 35℃에서 24시간 배양하였다.
- 독소 유전자 확인을 위해 PCR product를 Dyne Loading STAR (DyneBio, Seoul, Korea)와 혼합하여 1% agarose gel에 loading한 후 UV transilluminator (Gel Doc 2000; Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용 각각의 밴드를 확인하였다15). B. cereus 14579와 F4810/72 및 S. aureus ATCC 25922를 대조균주로 사용하였다.
- 75 μg), vancomycin (30 μg)으로 실험하였다. B. cereus 식중독균은 각각 항생제에 대한 감수성기준이 설정되어 있지 않아 S. aureus 식중독균의 항생제 감수성기준을 적용 판단하였으며 S. aureus ATCC 25923을 대조균주로 사용하였다.
- aureus 식중균의 독소 생산능을 확인하기 위해 각각 균주를 TSB (Oxoid)에 접종하여 35℃에서 24시간 배양한 후 3000 × g에서 10분간 원심분리 하여 상등액을 실험에 사용하였다. B. cereus의 heamolysin BL enterotoxin (HBL)은 B. cereus enterotoxin-reversed passive latex agglutination kit (BCET-RPLA; Oxoid)를 사용하였고, non-heamolytic enterotoxin (NHE)은 Bacillus diarrheal enterotoxin visual immunoassay kit (BDE-VIA; Tecra international pty Ltd., Reading, U.K.)를 사용하였다. S.
- 경기도 내 어린이집 9곳에서 어린이가 식사 후 양치에 사용하는 칫솔 75개, 칫솔걸이 29개, 양치 컵 65개를 실험대상으로 하였다. 미생물 오염도 실험을 위하여 칫솔은 칫솔모 부분을 saline 10 mL에 넣어 때때로 흔들어주며 10분간 방치한 후 시험용액으로 하였고, 칫솔걸이와 양치 컵은 내면을 멸균 면봉으로 swab하여 saline 10 mL에 넣어 균질화한 후 시험용액으로 사용하였다.
이론/모형
- B. cereus와 S. aureus 식중독균의 항생제 감수성 실험은 Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) Guideline16)의 디스크 확산법에 따라 실험하였으며 사용된 항생제 디스크는 Oxoid의 ampicillin (10 μg), cefepime (30 μg), cefotetan (30 μg), ciprofloxacin (5 μg), chloramphenicol (30 μg), clindamycin (2 μg), erythromycin (15 μg), gentamicin (10 μg), imipenem (10 μg), oxacillin (1 μg), penicillin (10 U), rifampin (5 μg), tetracycline (30 μg), trimethoprim/sulfamethoxazole (1.255 μg / 23.75 μg), vancomycin (30 μg)으로 실험하였다.
- cereus 독소 유전자 확인 실험에 사용된 primer sequences는 Table 1 나타내었으며14,15) Polymerase Chain Reaction (PCR) 조건은 initial denaturation 95℃, 300 seconds, denaturation 95℃, 60 seconds, extension 72℃, 120 seconds, final extension 72℃, 300 seconds의 조건으로 35 cycle을 반복하였으며 각각의 annealing 온도는 nheA, hblA 56℃, nheB, nheC 54℃, hblC, hblD, ces 58℃, entFM 60℃, cytK 48℃로 실험하였다. S. aureus 독소 유전자는 PowerChekTM S. aureus toxin ID PCR Kit (Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 이용 제조사의 방법에 따라 실험하였으며 Eppendrop thermal cycler (Mastercycler Gradient S)를 이용 PCR 반응을 실시 하였다. 독소 유전자 확인을 위해 PCR product를 Dyne Loading STAR (DyneBio, Seoul, Korea)와 혼합하여 1% agarose gel에 loading한 후 UV transilluminator (Gel Doc 2000; Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용 각각의 밴드를 확인하였다15).
- )를 사용하였다. S. aureus의 enterotoxin 생성능은 Staphylococcus aureus enterotoxin-reversed passive latex agglutination kit (SETRPLA; Denka Seiken, Tokyo, Japan)를 사용 하였으며 각각의 kit는 제조사가 권장하는 방법에 따라 실험하였다.
- 일반세균수, 대장균군수 및 진균수는 식품공전12)에 따라 측정하였으며 평판 당 30~300개의 집락을 형성한 평판을 선택하여 계수할 수 있도록 10단계 희석된 각각의 시험용액과 희석액을 멸균 Petri dish 6매에 각각 1 mL씩 분주하였다. 일반세균수는 Standard Plate Count agar (Oxoid, Basingstoke, England)를 Petri dish 2매에 무균적으로 분주한 후 35℃에서 48시간 배양하였고, 대장균군수는 Desoxycholate Lactose agar (Oxoid)를 Petri dish 2매에 무균적으로 분주한 후 35℃에서 24시간 배양하여 계수 하였다.
성능/효과
- B. cereus와 S. aureus 식중독 미생물의 직접적인 식중독 유발 위험성을 분석하고자 독소 유전자와 독소 생산능을 실험한 결과 S. aureus 식중독균의 16종 독소 유전자와 (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej, sek, sel, sem, sen, seo, sep, seq) 4종 독소단백질 (enterotoxin A, B, C, D) 모두 불검출 되었다. 이러한 결과로 보아 어린이집 유아들이 사용하는 양치 컵에 오염된 S.
- cereus가 β-lactam계 항생제에 내성을 나타낸다는 보고28)와 일치하는 실험결과를 나타내 었다. S. aureus의 항생제 내성 실험결과 ampicillin과 penicillin에만 내성을 나타내었고 실험에 사용된 항생제에는 모두 감수성을 나타내었다. 이러한 결과는 병원과 환경에서 분리된 S.
- 를 실험한 결과 실험에 사용된 모든 시료에서 Salmonella spp.는 검출되지 않았으나, B. cereus는 칫솔 75건 중 1건 (1.3%), 양치 컵 65건 중 2건 (3.1%)에서 검출되었고 S. aureus는 양치 컵 65건 중 1건 (1.5%)에서 검출되어 S. aureus 보다 B. cereus가 높은 검출율을 나타내었다. 칫솔, 양치 컵에 대한 식중독 미생물 오염도에 대한 국내 연구결과는 매우 미약하여 직접적인 비교가 곤란하나 어린이 손의 S.
- 7 log CFU 검출되어 가장 높은 오염도를 나타내었다. 대장균군은 칫솔 75건 중 41건 (54.7%), 칫솔걸이 29건 중 13건 (44.8%), 양치 컵 65건 중 29건 (44.6%)에서 검출되었으며 진균수는 평균 3.2 log CFU 검출되었고 칫솔이 평균 4.6 log CFU 검출되어 칫솔의 대장균군, 진균 오염도가 가장 높게 나타났다. Salmonella spp.
- 0% 검출되었다는 보고20)에 비해 매우 낮은 결과로서 어린이집 유아 사용 칫솔과 양치 컵의 경우 손, 수건 등에 비해 식중독 미생물로부터 안전하다고 판단할 수 있으나 칫솔과 양치 컵은 구강과 직접 접촉하는 위생용품으로서 부적절한 관리로 인한 식중독 위험성은 상존한다고 할 수 있겠다. 따라서 교차오염에 의한 식중독 발생을 예방하기 위하여 칫솔 및 양치 컵의 건조 보관 및 건조 후 자외선 살균고를 이용한 살균이 필요한 것으로 판단되었다.
- 7 log CFU 검출되어 가장 높은 오염도를 나타내었다. 위생지표미생물로 사용되고 있는 대장균군은 칫솔 75건중 41건 (54.7%), 칫솔걸이 29건 중 13건 (44.8%), 양치컵 65건 중 29건 (44.6%)에서 검출되어 일반세균수와 동일하게 칫솔의 오염도가 가장 높게 나타났다. 진균수는 불검출에서 5.
- 어린이집 유아들이 식사 후 구강 청결을 위해 사용하는 칫솔, 칫솔걸이, 양치 컵의 미생물 오염도를 분석하고자 일반세균수, 대장균군수 및 진균수를 실험하였으며 그 결과는 Table 2에 나타내었다. 일반세균수는 불검출에서 8.0 log CFU 범위에 평균 5.3 log CFU 검출되었고 칫솔은 평균 6.7 log CFU 검출되어 가장 높은 오염도를 나타내었다. 위생지표미생물로 사용되고 있는 대장균군은 칫솔 75건중 41건 (54.
- 어린이집 유아들이 사용하는 칫솔 및 양치 컵의 미생물 오염도와 분리된 식중독 미생물의 독소 유전자 및 독소 생산능력을 분석하여 칫솔과 양치 컵에 의해 발생할 수있는 식중독을 예방하고자 칫솔 75개, 칫솔걸이 29개, 양치 컵 65개를 실험하였다. 일반세균수는 평균 5.3 log CFU 검출되었고 칫솔은 평균 6.7 log CFU 검출되어 가장 높은 오염도를 나타내었다. 대장균군은 칫솔 75건 중 41건 (54.
- 6%)에서 검출되어 일반세균수와 동일하게 칫솔의 오염도가 가장 높게 나타났다. 진균수는 불검출에서 5.8 log CFU 범위에 평균 3.2 log CFU 검출되었고 칫솔이 평균 4.6 log CFU 검출되어 진균수 오염도가 가장 높게 나타났다.
- 5%)에서 검출되었다. 칫솔에서 분리된 B. cereus의 경우 nheA, nheB, nheC, hblC, hblD, hblA, entFM 등 7종의 설사독소 유전자가 검출되었고 양치 컵에서 분리된 B. cereus 2균주는 nheA, nheB, nheC, entFM 설사독소 유전자만 검출되었다. 칫솔에서 분리된 B.
- cereus의 독소 유전자와 독소 생산능은 Table 3에 나타내었다. 칫솔에서 분리된 B. cereus의 경우 설사독소 유전자인 cytK와 구토 독소 유전자인 ces를 제외하고 nheA 등 7종의 설사독소 유전자가 검출되었으며 양치 컵에서 분리된 B. cereus 2균주는 모두 cytK와 ces 유전자를 보유하지 않고 nheA, nheB, nheC, entFM 설사독소 유전자만 보유하였다. 이러한 결과는 국내 식품과 의료 환경에서 분리된 B.
후속연구
- aureus에 의한 식중독 발생 위험성을 낮게 판단할 수 있으나 Salmonella spp., pathogenic Escherichia coli 등과 함께 미래 집단 식중독의 주요 원인 미생물로 예측되는 S. aureus에23) 의한 식중독 발생을 예방하기 위하여 양치 컵에 대한 지속적인 위생관리가 필요한 것으로 판단된다.
- cereus에 의한 식중독 위험성이상존하는 것으로 판단되었다. 따라서 면역력이 취약한 어린이집 유아가 사용하는 칫솔 및 양치 컵을 건조한 후 자외선 살균고 등을 이용 살균하여 상대습도가 낮은 건조한 곳에 보관하여야 할 것으로 판단되었다.
- cereus에 의한 식중독 위험성이상존하는 것으로 판단되었다. 따라서 면역력이 취약한 어린이집 유아가 사용하는 칫솔 및 양치 컵을 건조한 후 자외선 살균고 등을 이용 살균하여 상대습도가 낮은 건조한 곳에 보관하여야 할 것으로 판단되었다.
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