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문제 정의
- 위한 연구가 증가하는 추세이다. 따라서 본 연구에서는 온 청음 구성약재인 당귀, 작약, 황금, 지황, 천궁의 복합추출물이 미용식품 및 한방화장품의 소재로 활용하기 위하여 항산화, 항균, 항염증 등의 생리활성 효과를 조사한 결과는 다음과 같다.
- 원인이 된다. 따라서 본 연구에서는 황금, 천궁, 당귀, 작약, 지황 혼합 물 추출물과 에탄올 추출물의 활성산소의 제거 능을 측정하기 위하여 전자공여능과 지질산패 억제능을 측정하였다. 전자공여능 측정에 사용된 1, 1-diphenyl-2- picrylhydrazyl(DPPH)는 자체가 매우 안정한 free radical로서 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 라디칼이 소거되면서 DPPH 고유의 청남색이 옅어져 육안적으로 항산화 활성을 관찰할 수 있다.
- 또한 약초나 민간약초에 생물공학 기술을 적용한 기능성 제품개발이 경쟁력 있는 산업으로 발전하고 있다. 이에 본 연구에서는 온청음 구성약재인 황금(Scutellaria baicalens Georgi), 천궁(Cnidium officinale Makino), 당귀(Angelica gigas Nakai), 작약(Paeonia lactiflora Pall), 지황(Rechmannia glutinosa Libosch)를 혼합하여 물과 에탄올로 추출하여 그 추출물로 항산화, 항균 및 항염증 효능을 평가하여 미용 식품 및 기능성 한방화장품 소재로서의 사용 가능성을 확인하고자 하였다.
- 이에 본 연구에서는 한방소재인 당귀, 천궁, 적작약, 지황, 황금 복합 추출물을 이용하여 항산화, 항균 및 항염증 효능을 평가하여 미용식품 및 기능성 한방화장품 소재로서의 사용 가능성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 단백질이 이동된 membrane 은 fast green solution으로 transfer의 유무를 확인한 후 blocking buffer(5% skim milk in TBST)로 blocking 하였다. 10분 간격으로 TBST로 3회 세척하고 iNOS(1:1000), COX-2(1:1000) 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night 한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 세척하고 mouse anti-rabbit IgG HRP, bovine anti-goat IgG HRP(1:1000) 의 각각의 2차 항체를 1:1000으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 3회 세척한 뒤 암실에서 ECL 용액으로 2분간 반응시키고 Kodac 필름에 감광하여 나타난 band의 두께를 비교하여 단백질 발현 유무 및 그 차이를 확인하였다.
- 10분 간격으로 TBST로 3회 세척하고 iNOS(1:1000), COX-2(1:1000) 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night 한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 세척하고 mouse anti-rabbit IgG HRP, bovine anti-goat IgG HRP(1:1000) 의 각각의 2차 항체를 1:1000으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 3회 세척한 뒤 암실에서 ECL 용액으로 2분간 반응시키고 Kodac 필름에 감광하여 나타난 band의 두께를 비교하여 단백질 발현 유무 및 그 차이를 확인하였다.
- Nitric oxide(NO) 측정은 cell의 supernatant에서의 NO 의 량을 nitrite와 nitrate로서 측정하였다. Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent를 사용하였으며, 6well plate(2×106 cells/well)에 RAW264.
- 측정하였다. RAW264.7 세포(5×104cells/well)를 96-well culture plate에 100µl의 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 배지와 함께 하룻밤 배양한 후 당귀, 천궁, 적작약, 지황, 황금 혼합추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 각 well에 5mg/ml 농도의 MTT 용액을 50µl 씩 넣은 후 4시간 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 100µl의 DMSO 용액을 첨가하여 보라색의 formazan 결정을 완전히 용해시킨다.
- iNOS protein 활성 측정을 확인하기 위하여 대식세포주인 Raw 264.7 세포를 각 well당 2×104cells/ml로 가한 후 24 시간 동안 배양하고 당귀, 천궁, 작약, 지황, 황금 혼합추출물을 농도별로 처리하여 1시간동안 배양한 후 LPS 1μ g/ml을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 세포를 PBS로 2~3회 세척한 후 1ml의 lysis buffer(50mM Tris-HCl pH 7.
- 이상의 결과에서 당귀, 천궁, 적작약, 지황, 황금 혼합물 및 에탄올 추출물은 50µg/ml 이하의 농도에서는 세포독성이 낮아 세포의 생존율에 크게 영향을 주지 않는다는 사실을 알 수 있었다. 따라서 본 결과를 바탕으로 RAW 264.7를 이용한 효능평가에서는 당귀, 천궁, 작약, 지황, 황금 혼합추출물의 최대 농도를 50µg/ml로 설정하여 실시하였다.
- 1ml 접종하여 3~6시간 본 배양한 후 평판배지 1개당 균수를 약 107 cells되게 접종하여 멸균 면봉으로 균일하게 도말하였다. 멸균된 filter paper disc(8mm, Tokyo, Japan)를 고체 평판배지에 올려놓은 다음 0.05ml/disc가 되도록 시료를 농도별로 흡수시켜 37℃에서 18~24시간 배양하여 disc 주위의 clear zone(mm)의 직경을 측정하였다.
- 7 세포의 confluence가 80%일 때, PBS로 2번 washing한 후에 무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 후에 시료를 농도별로 처리하여 1시간동안 배양한 다음 lipopolysacchride(LPS) 1µg/ml 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양액의 상층 액을 취하여 griess 시약과 반응시킨 후 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하여 NO 생성율을 백분율로 표시하였다.
- 즉, 물 추출물은 당귀, 천궁, 적작약, 지황, 황금을 Table 1의 구성비로 개량한 다음 시료 중량 대비 10배 양의 증류수를 가하여 85℃에서 3시간 환류냉각 추출하여 상징액과 침전물을 분리하였으며, 동일 조작을 3회 반복 추출하였다. 에탄올 추출물은 시료 중량대비 70% 에탄올 10배의 양을 가하여 실온에서 24시간 shaking하여 추출하고, 추출 후 상등액과 침전물을 분리하였으며, 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 추출물을 원심분리 및 여과, 농축하여 동결건조 후 냉동실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.
- 1과 같이 추출하였다. 즉, 물 추출물은 당귀, 천궁, 적작약, 지황, 황금을 Table 1의 구성비로 개량한 다음 시료 중량 대비 10배 양의 증류수를 가하여 85℃에서 3시간 환류냉각 추출하여 상징액과 침전물을 분리하였으며, 동일 조작을 3회 반복 추출하였다. 에탄올 추출물은 시료 중량대비 70% 에탄올 10배의 양을 가하여 실온에서 24시간 shaking하여 추출하고, 추출 후 상등액과 침전물을 분리하였으며, 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다.
- 으로 측정하였다. 즉, 평판배지에 배양된 각 균주를 1 백금이량 취해서 액체 배지 10 ml에서 18~24시간 배양하여 활성화시킨 후 다시 액체 배지 10ml에 균액을 0.1ml 접종하여 3~6시간 본 배양한 후 평판배지 1개당 균수를 약 107 cells되게 접종하여 멸균 면봉으로 균일하게 도말하였다. 멸균된 filter paper disc(8mm, Tokyo, Japan)를 고체 평판배지에 올려놓은 다음 0.
대상 데이터
- 마우스의 대식세포주인 RAW 264.7은 한국세포주은행 (Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 37℃, 5% CO2 조건에서 10% FBS, 25 mM HEPES가 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 당귀(국산), 천궁(국산), 작약(국산), 지황(중국산), 황금(국산) 약재는 경북 영천 소재의 옴니허브(주) 에서 구입하여 물로 세척하여 음건 후 사용하였다. 시료의 생약명과 학명은 Table 1과 같으며 약재의 구성비는 항산화 실험에서 효능이 우수한 것을 기준으로 비율을 선정한 것이다.
- Louis, USA) 제품을 사용하였다. 세포 배양용 시약 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), Fetal bovine serum(FBS), penicillin- streptomycin 은 Gibco BRL(Grand Island, USA)사에서 구입하였으며, 일차 항체 iNOS와 COX-2는 Cell Signaling(Boston, USA) 사에서, 이차 항체 mouse anti-rabbit IgG HRP와 bovine anti-goat IgG HRP는 Santacruz(CA, USA)사에서 구입하였다. 그 외 실험에 사용된 시약들은 분석용 등급 이상으로 사용하였다.
- 실험에 사용된 시약 중 3-(4, 5-dimethylthiazole-2-yl) -2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT), griess reagent, TRI-zol, LPS는 Sigma(St. Louis, USA) 제품을 사용하였다. 세포 배양용 시약 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), Fetal bovine serum(FBS), penicillin- streptomycin 은 Gibco BRL(Grand Island, USA)사에서 구입하였으며, 일차 항체 iNOS와 COX-2는 Cell Signaling(Boston, USA) 사에서, 이차 항체 mouse anti-rabbit IgG HRP와 bovine anti-goat IgG HRP는 Santacruz(CA, USA)사에서 구입하였다.
- 항균력 검색 실험에 사용한 공시균주인 Staphylococcus epidermidis KCTC 1917(S. epidermidis), Staphylococcus aureus KCTC 1621(S. aureus), Escherichia coli KCTC 1039(E. coli) 및 Propionibactrium acnes KCTC 3314(P. acnes)는 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다. S.
데이터처리
- 결과 통계처리는 SPSS 10.0 for windows program을 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석(ANOVA : analysis of variance)을 한 후 α=0.05 수준에서 Duncan의 다중검증법 (DMRT : Duncan's multiple range test)에 따라 분석하였다.
이론/모형
- Fish oil의 산패촉진을 위해서는 50µg/ml의 Fe2+ 이온 용액을 사용하였으며, 지방 산패억제도 측정은 Buege와 Aust 의 방법20)에 따라 측정하였다. Oil emulsion 0.
- 세포의 생존율은 3-(4, 5-dimethylthiazole-2-yl)-2, 5- diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) 환원 방법을 이용하여 측정하였다. RAW264.
- 전자공여능(EDA: electron donating abilities)은 Blois의방법19)에 따라 측정하였다. 각 시료용액 2ml에 0.
- 항균력 측정은 paper disc법21)으로 측정하였다. 즉, 평판배지에 배양된 각 균주를 1 백금이량 취해서 액체 배지 10 ml에서 18~24시간 배양하여 활성화시킨 후 다시 액체 배지 10ml에 균액을 0.
성능/효과
- 1. 전자공여능, 지방산패 억제능을 이용하여 항산화 효과를 측정한 결과 전자공여능은 농도 500µg/ml에서 물 추출물은 60.0%, 에탄올 추출물은 90.0%이상의 높은 효과를 나타내었으며, 지방산패 억제능은 1, 000µg/ml에서 물 추출물은 40%, 에탄올 추출물은 50% 이상의 억제능을 나타내었다. 물 추출물과 에탄올 추출물과 비교하였을 때 에탄올 추출물이 항산화 효과가 높게 나타났다.
- 2. 피부 상재균과 여드름균에 대한 항균활성을 생육 저해 환으로 측정한 결과 피부 상재균에 대한 항균효과는 물과 에탄올 추출물 둘 다에서 나타지 않았으나 여드름 균에 대한 항균효과는 물 추출물 4mg/disc에서 19mm, 에탄올 추출물 2mg/disc에서 15mm, 4mg/disc에서 19mm를 나타내었다.
- 3. RAW 264.7 마우스 대식세포에 대한 추출물의 세포독성을 측정한 결과 농도 50µg/ml에서는90%이상의 세포 생존율을 나타내었지만 100µg/ml에서는 80% 이하의 세포 생존율을 나타내었다.
- 4. RAW 264.7 세포를 LPS로 자극하였을때 추출물의 항염증 효과를 NO 및 iNOS와 COX-2 단백질 발현 저해 효과를 조사한 결과 농도 의존적으로 저해활성이 높게 나타내었다.
- NO 생성에 영향을 미치는 iNOS와 COX-2의 세포 내 단백질 발현억제에 관한 활성을 western blot으로 분석한 결과 Fig. 8에서와 같이 RAW 264.7 세포를 LPS로 처리하여 자극을 주었을 때 iNOS와 COX-2 단백질이 강하게 유도되었으며, 당귀, 천궁, 작약, 지황, 황금 혼합추출물 50µg/ml의 농도로 처리하였을 때 iNOS와 COX-2의 발현은 물과 에탄올 추출물 모두에서 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
- 7에서와 같이 LPS 처리 후 NO 생성량은 대조구에 비하여 약 2배 이상 증가되었으며 당귀, 천궁, 작약, 지황, 황금 혼합추출물의 처리농도가 높을수록 생성량이 감소하는 경향을 나타내었다. 농도 50µg/ml에서 물 및 에탄올 추출물은 각각 52.7%, 56.7%의 NO 생성 저해를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- 당귀, 천궁, 작약, 지황, 황금 혼합 추출물의 항산화 효과를 측정한 결과는 Fig. 2에서 보는 바와 같이 추출물의 농도가 증가할수록 전자공여능이 증가하는 경향을 나타내었으며, 물 추출물은 500µg/ml에서 60.0% 이상의 효과를 나타내었고, 에탄올 추출물에서는 90.0% 이상의 높은 효과를 나타내었다. 또한 추출물간의 항산화능을 비교하기 위하여 시료 첨가 양에 따른 전자공여능이 50%에 이르는데 필요한 시료의 농도(IC50, 50% inhibition concentration)를 측정한 결과물 추출물은 187.
- 당귀, 천궁, 작약, 지황, 황금 혼합추출물의 물 및 에탄올 추출물에 대한 세포 생존율을 알아보기 위하여 대식세포인 RAW264.7에 추출물을 5~100µg/ml 농도로 첨가하여 MTT assay하여 세포생존율을 조사하였으며 그 결과는 Fig. 6에서 보는 바와 같이 대식세포에 대한 세포독성은 세포만 배양한 대조구의 세포생존율을 100%로 보았을 때 50µg/ml의 농도까지는 세포의 생존율이 90%이상을 나타내었지만 100µg/ml 의 농도에서는 세포의 생존율이 80%이하의 생존율을 나타내었다. 이상의 결과에서 당귀, 천궁, 적작약, 지황, 황금 혼합물 및 에탄올 추출물은 50µg/ml 이하의 농도에서는 세포독성이 낮아 세포의 생존율에 크게 영향을 주지 않는다는 사실을 알 수 있었다.
- 당귀, 천궁, 작약, 지황, 황금 혼합추출물이 산화촉진제인 Fe2+이온 첨가에 의해 산패가 촉진된 fish oil emulsion의 산패억제 효과를 측정한 결과 Fig. 3과 같이 농도 의존적으로 억제 효과가 높아지는 경향을 나타내었으며 에탄올 추출물을 농도 1,000µg/ml 첨가군에서 43.1%, 52.1%의 억제 효과로 에탄올 추출물이 높은 지방산패 억제능을 나타내었다.
- 0% 이상의 높은 효과를 나타내었다. 또한 추출물간의 항산화능을 비교하기 위하여 시료 첨가 양에 따른 전자공여능이 50%에 이르는데 필요한 시료의 농도(IC50, 50% inhibition concentration)를 측정한 결과물 추출물은 187.17µg/ml, 에탄올 추출물은 33.40µg/ml로 나타났다. 이상의 결과에서 70% 에탄올로 당귀, 천궁, 작약, 지황, 황금 혼합추출물이 물 혼합추출물보다 전자공여능이 높음을 알 수 있었다.
- 0%이상의 높은 효과를 나타내었으며, 지방산패 억제능은 1, 000µg/ml에서 물 추출물은 40%, 에탄올 추출물은 50% 이상의 억제능을 나타내었다. 물 추출물과 에탄올 추출물과 비교하였을 때 에탄올 추출물이 항산화 효과가 높게 나타났다.
- 4, 5와 같이 나타내었다. 물과 에탄올 추출물 모두 피부 상재균인 S. aureus, E. coli 및 S. epidermidis는 항균효과를 나타내지 않았으나, 여드름 원인균인 P. acnes에 대해서는 항균 효과를 나타내었다. 물 추출물에서는 4mg/disc에서 19mm, 에탄올 추출물에서는 2 mg/disc에서 15 mm, 4mg/disc에서 19mm를 나타내었다.
- 물 추출물에서는 4mg/disc에서 19mm, 에탄올 추출물에서는 2 mg/disc에서 15 mm, 4mg/disc에서 19mm를 나타내었다. 이는 물 추출물에 비하여 에탄올 추출물의 항균효과가 높게 나타내었으며 특히, 각종 습진 및 여드름 유발에 관여하는 P. acnes에 대한 항균력이 뛰어났음을 확인할 수 있었다.
- 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 당귀, 천궁, 적작약, 지황, 황금을 혼합하여 물과 에탄올로 추출한 추출물로 전자공여능, 지방산패 억제능, 피부 염증관련 3균주에 대한 항균활성, NO 생성 억제 및 iNOS와 COX-2의 발현 억제에 대한 효능평가를 실시한 결과 전체적으로 두 추출물 모두 활성을 나타내었으며 특히, 에탄올 추출물이 물 추출물보다 높은 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 당귀, 작약, 황금, 지황, 천궁의 복합 에탄올 추출물은 미용식품 및 한방화장품 소재로서의 활용이 가능할 것으로 사료된다.
- 40µg/ml로 나타났다. 이상의 결과에서 70% 에탄올로 당귀, 천궁, 작약, 지황, 황금 혼합추출물이 물 혼합추출물보다 전자공여능이 높음을 알 수 있었다.
- 6에서 보는 바와 같이 대식세포에 대한 세포독성은 세포만 배양한 대조구의 세포생존율을 100%로 보았을 때 50µg/ml의 농도까지는 세포의 생존율이 90%이상을 나타내었지만 100µg/ml 의 농도에서는 세포의 생존율이 80%이하의 생존율을 나타내었다. 이상의 결과에서 당귀, 천궁, 적작약, 지황, 황금 혼합물 및 에탄올 추출물은 50µg/ml 이하의 농도에서는 세포독성이 낮아 세포의 생존율에 크게 영향을 주지 않는다는 사실을 알 수 있었다. 따라서 본 결과를 바탕으로 RAW 264.
- 7에 대한 당귀, 천궁, 적작약, 지황, 황금 혼합추출물의 세포독성은 50µg/ml의 농도까지는 세포의 생존율이 90%이상을 나타내었다. 이에 농도 50 µg/ml 이하로 물과 에탄올 추출물을 처리하였을때 NO 생성억제와 iNOS와 COX-2의 발현은 모든 추출물에서 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
- 생체내에서 세포막에 존재하는 인지질 및 당지질과 혈관에 존재하는 지질은 산소와 결합하여 과산화물을 만들고 이들의 연속반응에 의하여 alchol류, aldehyde류, ketone류 등을 생성하여 생체 내에서 DNA를 손상시켜 암을 유발하기도 하며, 세포의 노화와도 관련이 있는 것으로 알려져 있다26, 27). 이에 전자공여능과 지질산패 억제능을 측정한 결과 당귀, 천궁, 적작약, 지황, 황금 혼합 추출물은 물 추출물의 결과에서보다 에탄올 추출물에서 더 높은 효과를 나타내었다.
- acnes에 대해서는 항균 효과를 나타내었다. 특히 물 추출물보다 에탄올 추출물이 각종 습진 및 여드름 유발에 관여하는 P. acnes에 대한 항균력이 뛰어났음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 당귀, 천궁, 작약, 지황, 황금 혼합 에탄올추출물은 여드름과 같은 염증성 피부질환을 개선하는데 큰 도움이 될 것으로 사료된다.
- acnes는 여드름균으로서 혐기성 세균(anaerobic bacteria)이며, 리파아제 (lipase)를 분비하여 많은 양의 글리세롤과 지방산을 생성하여 염증을 유발한다31). 한약재 복합 물과 에탄올 추출물 둘다 피부 상재균인 S. aureus, E. coli 및 S. epidermidis는 항균효과를 나타내지 않았으나, 여드름 원인균인 P. acnes에 대해서는 항균 효과를 나타내었다. 특히 물 추출물보다 에탄올 추출물이 각종 습진 및 여드름 유발에 관여하는 P.
- 항염증 효과를 평가하기 위하여 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 세포 배양액에 당귀, 천궁, 작약, 지황, 황금 혼합추출물의 NO 생성저해 효과를 조사한 결과 Fig. 7에서와 같이 LPS 처리 후 NO 생성량은 대조구에 비하여 약 2배 이상 증가되었으며 당귀, 천궁, 작약, 지황, 황금 혼합추출물의 처리농도가 높을수록 생성량이 감소하는 경향을 나타내었다. 농도 50µg/ml에서 물 및 에탄올 추출물은 각각 52.
후속연구
- 알 수 있었다. 당귀, 작약, 황금, 지황, 천궁의 복합 에탄올 추출물은 미용식품 및 한방화장품 소재로서의 활용이 가능할 것으로 사료된다.
- acnes에 대한 항균력이 뛰어났음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 당귀, 천궁, 작약, 지황, 황금 혼합 에탄올추출물은 여드름과 같은 염증성 피부질환을 개선하는데 큰 도움이 될 것으로 사료된다.
- 이상의 생리활성 검증 결과 당귀, 작약, 황금, 지황, 천궁의 복합 추출물이 대부분 높은 생리활성을 나타내어 미용 식품 및 한방화장품 소재로서의 활용이 가능할 것으로 사료된다.
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