[논문]복숭아꽃 에탄올 추출물과 분획물의 in vitro 항산화 효과 및 RAW 264.7 대식세포에서의 항염증 효과

곽충실; 최혜인

doi:10.3746/jkfn.2015.44.10.1439

[국내논문] 복숭아꽃 에탄올 추출물과 분획물의 in vitro 항산화 효과 및 RAW 264.7 대식세포에서의 항염증 효과
In vitro Antioxidant and Anti-Inflammatory Activities of Ethanol Extract and Sequential Fractions of Flowers of Prunus persica in LPS-Stimulated RAW 264.7 Macrophages 원문보기

한국식품영양과학회지 = Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, v.44 no.10, 2015년, pp.1439 - 1449

곽충실 (서울대학교 노화고령사회연구소) , 최혜인 (서울대학교 노화고령사회연구소)

초록
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우리나라에서는 전통적으로 복숭아꽃을 차로 마셔왔으며 피부 부스럼 등의 치료에 이용하였다는 기록이 있어 복숭아꽃 추출물이 산화적 스트레스와 염증반응을 억제시키는 효과가 있는지를 본 연구에서 확인하고자 하였다. 복숭아꽃을 건조시킨 다음 에탄올 추출 농축액(EtOH)을 얻었고, 이로부터 다시 hexane(Hx), dichloromethane(DM), ethyl acetate(EA), n-butanol(BtOH) 및 water(DW) 순으로 순차적 용매 분획을 시행하여 획득한 각 농축액에서 총 페놀화합물 함량, 플라보노이드 함량, DPPH 라디칼과 ABTS 라디칼 소거능을 측정하였고, LPS를 처리한 RAW 264.7 대식세포에서 이들 추출물들이 NO, PGE2, IL-6, TNF-${\alpha}$ 생성에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과 총 페놀화합물 함량과 플라보노이드 함량은 EA 분획(394.6 mg TA/g, 253.7 mg RT/g)이 가장 높았고, 그다음이 BtOH 분획(128.3 mg TA/g, 93.1 mg RT/g), DM 분획(79.5 mg TA/g, 52.9 mg RT/g), EtOH 추출물(78.1 mg TA/g, 55.3 mg RT/g) 순이었다. DPPH 라디칼 소거능은 EA> BtOH${\geq}$ EtOH> DM=DW> Hx 순이었으며, ABTS 라디칼 소거능은 EA> BtOH> EtOH=DM> Hx=DW 분획 순으로 항산화 효과는 EA, BtOH 분획이 가장 우수하였다. 총 페놀화합물의 함량은 DPPH 라디칼 소거능($IC_{50}$)(r=-0.6081, P<0.01), ABTS 라디칼 소거능(r=0.9683, P<0.001)과 유의적인 상관관계를 나타내었으며, DPPH 라디칼 소거능($IC_{50}$)과 ABTS 라디칼 소거능은 서로 유의한 상관관계(r=-0.7172, P<0.001)를 나타내었다. LPS를 처리한 대식세포에 각 추출시료를 세포독성이 없는 농도로 처리한 결과 EtOH 추출물과 Hx, DM, EA 분획이 NO 생성을 유의하게 감소시켰으며(P<0.05), EtOH 추출물과 DM, EA 분획이 PGE2 생성을 유의하게 감소시켰다(P<0.05). 염증성 사이토카인인 IL-6와 TNF-${\alpha}$ 생성은 EtOH 추출물과 Hx, DM, EA, BtOH 분획 모두 유의하게 감소시켰다(P<0.05). 더 나아가 LPS를 처리한 대식세포에서 복숭아꽃 EtOH 추출물을 처리하였을 때 농도의존적으로 iNOS와 COX-2의 합성을 효과적으로 억제시킴으로써 주요한 염증 매개물질인 NO와 PGE2의 생성이 억제되는 기전을 제시하였다. 한편 대식세포에서 분비된 아질산염의 농도는 TNF-${\alpha}$ 농도(r=0.6477, P<0.05) 및 PGE2 농도(r=0.6377, P<0.05)와 유의한 상관관계를 나타내었으며, 아질산염, PGE2, IL-6 농도는 총 페놀화합물 함량이나 항산화 효과 지표들과 유의한 상관성을 보이지 않았다. 다만 TNF-${\alpha}$ 농도만 총 페놀화합물 함량(r=0.6524, P<0.05), 플라보노이드 함량(r=0.6914, P<0.05), DPPH 라디칼 소거능($IC_{50}$)(r=-0.6839, P<0.05), ABTS 라디칼 소거능(r=0.7921, P<0.01)과 각각 유의한 상관관계를 나타내었으며, 염증반응의 매개물질인 PGE2 및 IL-6 농도와는 유의한 상관성이 없었다. 본 실험 결과를 종합하면 복숭아꽃 에탄올 추출물은 항산화 효과와 항염증 효과가 우수하였으며, 그로부터 얻은 분획물 중에서 특히 EA와 BtOH 분획은 항산화 효과가 매우 우수하였고, DM과 EA 분획은 항염증 효과가 우수하였다. 따라서 복숭아꽃 에탄올 추출물을 비롯한 이들 분획물들은 산화적 스트레스 및 염증반응의 상승과 관련되어 있는 만성질환을 예방하는 건강기능성 식품의 개발을 위한 천연소재로 이용 가능할 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Prunus persica Flos (PPF) were investigated for their antioxidant and anti-inflammatory activities to find a natural functional food resource preventing degenerative diseases associated with excessive oxidative stress and chronic inflammation. PPF was extracted using ethanol (EtOH) and then sequentially fractioned by hexane (Hx), dichloromethane (DM), ethyl acetate (EA), n-butanol (BtOH), and water (DW). Contents of total phenolics and flavonoids, as well as 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical and 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical scavenging activities were measured. Anti-inflammatory effects in terms of nitric oxide (NO), prostaglandin (PG) E2, and pro-inflammatory cytokines such as interleukin (IL)-6 and tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$ production were also measured using LPS-treated RAW 264.7 macrophages. EtOH extract showed relatively high antioxidant activity with high total phenolic (78.1 mg tannic acid/g) and flavonoid contents (55.3 mg rutin/g). EA fraction contained the highest total phenolic and flavonoid contents (394.6 mg tannic acid/g, 253.7 mg rutin/g), followed by BtOH (128.3 mg tannic acid/g, 93.1 mg rutin/g). EA and BtOH fractions and EtOH extract showed higher DPPH radical and ABTS radical scavenging activities than the others (P<0.05). In LPS-treated RAW 264.7 macrophages, EtOH extract ($200{\mu}g/mL$) showed significantly reduced (P<0.05) NO, PGE2, and TNF-${\alpha}$ production levels to 38.5%, 32.3%, and 48.9% of the control, respectively, as well as reduced iNOS and COX-2 protein expression. DM fraction ($50{\mu}g/mL$) showed significantly reduced (P<0.05) NO, PGE2, IL-6, and TNF-${\alpha}$ production levels to 43.5%, 13.3%, 38.7%, and 41.3% of the control, respectively, and EA fraction ($50{\mu}g/mL$) showed significantly reduced NO, PGE2, IL-6, and TNF-${\alpha}$ production levels to 44.8%, 22.4%, 45.7%, and 62.0% of the control, respectively. Taken together, EtOH extract of PPF showed potent antioxidant and anti-inflammatory activities, and EA and BtOH fractions showed comparatively stronger antioxidant activities while DM and EA fractions showed stronger anti-inflammatory activities. It can be concluded that EtOH extract of PPF and its fractions are good candidates as natural resources for the development of anti-oxidative and anti-inflammatory functional food products.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

NO는 백혈구가 염증 부위로 이동하는 초기단계에 많은 역할을 하는 반면, PGE2는 발열과 통증이 나타나는 후반부에 주로 작용한다고 알려져 있다 (33,34). COX-2의 작용과정은 여러 염증반응 경로의 후반부에 공통적으로 포함되는 경로이기 때문에 급성적이든 만성적이든 대부분의 항염증 약물개발 과정에서는 COX-2를 선택적으로 억제함으로써 PGE2의 생성을 억제하는 것을 목표로 한다(11). LPS로 염증반응을 유도한 RAW 264.
본 연구의 목적은 복숭아꽃 추출물의 항산화 및 항염증 효과를 측정함으로써 향후 산화적 스트레스 및 염증반응의 증가와 관련이 있는 만성질병들을 예방할 수 있는 건강보조식품의 소재로 이용될 수 있는지 알아보고자 하였다. 이를 위하여 복숭아꽃 에탄올 추출물을 얻은 후 극성의 정도가 서로 다른 5종의 용매를 이용하여 순차적으로 분획 추출한 다음 총 페놀화합물의 함량과 항산화 효과를 측정 비교하였고, 염증반응에서 매우 중요한 역할을 하는 대식세포를 이용하여 LPS로 염증반응을 유도한 상태에서 에탄올 추출물과 분획물들이 NO, PGE2, IL-6, TNF-α의 생성 및 iNOS와 COX-2의 합성에 미치는 영향을 측정하였다.
우리나라에서는 전통적으로 복숭아꽃을 차로 마셔왔으며 피부 부스럼 등의 치료에 이용하였다는 기록이 있어 복숭아꽃 추출물이 산화적 스트레스와 염증반응을 억제시키는 효과가 있는지를 본 연구에서 확인하고자 하였다. 복숭아꽃을 건조시킨 다음 에탄올 추출 농축액(EtOH)을 얻었고, 이로부터 다시 hexane(Hx), dichloromethane(DM), ethyl acetate (EA), n-butanol(BtOH) 및 water(DW) 순으로 순차적 용매 분획을 시행하여 획득한 각 농축액에서 총 페놀화합물 함량, 플라보노이드 함량, DPPH 라디칼과 ABTS 라디칼 소거능을 측정하였고, LPS를 처리한 RAW 264.

제안 방법

DW 분획은 NO, PGE2 생성 억제 효과도 없었고, 항산화 효과도 낮아 IL-6와 TNF-α생성에 미치는 영향에 대하여 측정하지 않았다.
)를 가하고 100°C에서 5분간 끓였다. Mini-PROTEAN system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 10% SDS polyacrylamide gel을 만들어 각 well에 단백질 양이 동일하도록 각 시료를 loading 하고 전기영동을 시행하였으며 이어서 Immobilon membranes(Millipore, Billerica, MA, USA)에 90분간 transfer 시켰다. Membrane을 5% nonfat dry milk in Tris-buffered saline containing 0.
NO, PGE2, IL-6, TNF-α생성량 측정 무혈청, 무페놀 DMEM 배지를 이용하여 RAW 264.7 세포를 12 well plate에 5×105/mL의 농도로 심고 24시간 동안 37°C, 5% CO2 세포배양기에서 배양하여 부착시킨 다음 시료를 다양한 농도로 처리하고 1시간 배양 후 LPS(1 μg/ mL)를 처리하여 염증반응을 촉발시키고 24시간 동안 37°C, 5% CO2 세포배양기에서 배양한 다음 배양액을 취하여 NO, PGE2, IL-6, TNF-α의 생성 정도를 측정하였다.
PGE2, IL-6, TNF-α 생성량 역시 배양액을 취하여 enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) kit(R&D System, Inc., Minneapolis, MN, USA)을 이용하여 각각의 농도를 측정하였다.
TNF-α, IL-6, IL-1β 등은 선천적 면역반응에서 나타나는 가장 중요한 염증매개물질로 과도하게 생성되면 전신적인 염증질환을 초래할 수 있다고 알려져 있기 때문에(11, 35) 본 연구에서 LPS에 의하여 염증반응을 유도한 대식세포에서 복숭아꽃 추출물들이 TNF-α와 IL-6의 생성에 미치는 영향을 측정하였고 그 결과는 Fig. 5와 같다.
0)에 녹인 5% nonfat dry milk에 넣어 실온에서 1시간 동안 blocking 한 후 일차 항체(anti-NOS, anti-COX-2, anti-β-actin antibody(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 1:1,000으로 희석한 용액에 넣어 4°C에서 overnight shaking 하였다. 다시 TBST로 4회 세척한 다음 membrane을 실온에서 이차 항체(horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG, 1:1,000~1:2,000, Santa Cruz Biotechnology)에 2시간 동안 shaking 하면서 노출시킨 다음 세척하고 ECL solution (Pierce, Rockford, IL, USA)을 뿌려 현상한 후 LAS-4000 Luminescent Image Analyzer(Fujifilm, Tokyo, Japan)를 이용하여 밴드를 확인하고 정량하였다.
대조군에 비하여 세포생존율이 90% 이상인 시료 농도를 무독성 안전 농도로 간주하였는데 EtOH 추출물과 BtOH 분획은 200 μg/mL, Hx, DM, EA, DW 분획은 50 μg/mL 이하였다.
05). 더 나아가 LPS를 처리한 대식세포에서 복숭아꽃 EtOH 추출물을 처리하였을 때 농도의존적으로 iNOS와 COX-2의 합성을 효과적으로 억제시킴으로써 주요한 염증 매개물질인 NO와 PGE2의 생성이 억제되는 기전을 제시하였다. 한편 대식세포에서 분비된 아질산염의 농도는 TNF-α농도(r=0.
먼저 세포로부터 단백질을 추출하기 위하여 배양액을 제거하고 차가운 PBS(pH 7.4)로 2회 세척한 다음 protease inhibitor(Roche, Basel, Germany)를 포함하는 RIPA 버퍼 (Sigma-Aldirch Co.)를 넣고 얼음 위에 20분간 두었다가 4°C, 10,000×g에서 15분간 원심분리 하여 상층액을 모았다.
먼저 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM 배양액으로 2.5×104/mL의 밀도가 되도록 준비 하여 96 well plate에 각 well 당 200 μL씩 분주한 후 37°C, 5% CO2의 세포배양기에서 24시간 배양하여 부착시킨 다음 무혈청 DMEM 배양액으로 교환하면서 시료를 여러 농도 (0~200 μg/mL)로 처리하고 24시간 배양하였다.
1과 같다. 복숭아꽃 건조시료 일정량에 20배 부피의 에탄올(Ducksan)을 플라스크에 붓고 입구를 봉한 다음 stirring 하면서 실온에서 24시간 동안 2회 반복 추출하였다. 추출용액을 모아 Whatman 여과지(No.
복숭아꽃을 건조시킨 다음 에탄올 추출 농축액(EtOH)을 얻었고, 이로부터 다시 hexane(Hx), dichloromethane(DM), ethyl acetate (EA), n-butanol(BtOH) 및 water(DW) 순으로 순차적 용매 분획을 시행하여 획득한 각 농축액에서 총 페놀화합물 함량, 플라보노이드 함량, DPPH 라디칼과 ABTS 라디칼 소거능을 측정하였고, LPS를 처리한 RAW 264.7 대식세포에서 이들 추출물들이 NO, PGE2, IL-6, TNF-α 생성에 미치는 영향을 측정하였다.
본 연구 결과 LPS를 처리한 RAW 264.7 세포에서 복숭아꽃 EtOH 추출물과 DM, EA 분획물이 NO와 PGE2의 생성량을 유의하게 억제시켰는데, 그러한 결과가 iNOS와 COX-2의 합성 저해로 인한 것인지를 알아보기 위하여 복숭아꽃 EtOH 추출물을 세포에 처리한 후 western blot 분석을 시행하였고 그 결과는 Fig. 6과 같다.
시료는 에탄올을 이용하여 여러 농도로 희석한 다음 각각 200 μL씩을 취하고 에탄올에 녹인 200 μM의 DPPH 용액 800 μL를 넣어 37°C에서 30분간 incubation 한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 넣지 않은 대조군의 흡광도와 비교하여 시료 처리군에서 감소한 흡광도의 비율로부터 DPPH 라디칼 소거율을 계산하였고, 농도와 소거율과의 관계식을 이용하여 소거율이 50%에 해당하는 시료 농도(IC₅₀)를 계산하였다. 양성대조군 시약으로 ascorbic acid를 사용하였다.
이를 위하여 복숭아꽃 에탄올 추출물을 얻은 후 극성의 정도가 서로 다른 5종의 용매를 이용하여 순차적으로 분획 추출한 다음 총 페놀화합물의 함량과 항산화 효과를 측정 비교하였고, 염증반응에서 매우 중요한 역할을 하는 대식세포를 이용하여 LPS로 염증반응을 유도한 상태에서 에탄올 추출물과 분획물들이 NO, PGE2, IL-6, TNF-α의 생성 및 iNOS와 COX-2의 합성에 미치는 영향을 측정하였다.
대조군에 비하여 세포생존율이 90% 이상인 시료 농도를 무독성 안전 농도로 간주하였는데 EtOH 추출물과 BtOH 분획은 200 μg/mL, Hx, DM, EA, DW 분획은 50 μg/mL 이하였다. 이후 세포실험에서 각 추출시료의 처리는 이 농도 범위에서 수행하였다.
총 플라보노이드 함량은 AOAC에서 공인된 방법을 약간 수정한 Chae 등(19)의 방법에 따라 추출시료 100 μL에 90% diethylene glycol 900 μL를 첨가하고, 다시 1 N NaOH를 20 μL를 가한 후 37°C water bath에서 1시간 동안 둔 다음 spectrophotometer로 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
활성산소는 염증반응의 촉진제로 알려져 있기 때문에(4) 본 연구에서도 라디칼을 효과적으로 제거할 수 있는 추출물이 염증반응도 억제시키는 효과가 클 것으로 기대하고 염증 반응의 지표물질인 아질산염, PGE2, IL-6 및 TNF-α 농도와 총 페놀화합물 함량, 플라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능 등과의 상관성을 분석하였다.

대상 데이터

마우스 대식세포인 RAW 264.7을 100 φ 세포배양접시에서 10% FBS(v/v), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 함유하는 DMEM 배지를 이용하여 37°C, 5% CO2 세포배양기에서 계대배양 하였다.
시료는 전라남도 화순에서 재배하여 증기로 쪄서 건조시킨 복숭아꽃차를 구입하여 사용하였다. 구입한 복숭아꽃차는 실험실에서 동결건조기(Samwon, Sungnam, Korea)에서 감압 하에 1일간 더 건조시킨 후 가정용 식품분쇄기를 이용하여 곱게 분쇄한 다음 냉동실에 보관하였다.
시료를 넣지 않은 대조군의 흡광도와 비교하여 시료 처리군에서 감소한 흡광도의 비율로부터 DPPH 라디칼 소거율을 계산하였고, 농도와 소거율과의 관계식을 이용하여 소거율이 50%에 해당하는 시료 농도(IC₅₀)를 계산하였다. 양성대조군 시약으로 ascorbic acid를 사용하였다.
2, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)로 거른 후 여과액을 rotary vacuum evaporator(EYELA, Tokyo, Japan)로 30°C, 감압 하에 에탄올을 증발시켜 농축액을 얻었다. 에탄올 추출농축액(EtOH)에 적당량의 물을 섞어 분산시킨 후 극성의 정도에 따라 hexane(Hx), dichloromethane(DM), ethyl acetate(EA), n-butanol(BtOH) 및 water(DW) 분획의 순으로 separatory funnel을 이용하여 순차적으로 용매분획을 시행한 다음 각 분획물을 rotary evaporator로 농축한 후 DMSO로 녹여(100 mg/mL) 냉동 보관하였다가 실험에 사용하였다.
1% NEDD를 1:1로 혼합) 100 μL를 넣고 실온의 어두운 곳에서 20분간 두었다가 plate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 sodium nitrite를 사용하였다. PGE2, IL-6, TNF-α 생성량 역시 배양액을 취하여 enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) kit(R&D System, Inc.

데이터처리

3)Means with the same letter within a column are not significantly different at P<0.05 by ANOVA and Duncan's multiple range test.
Means with the same letter above the bars are not significantly different at P<0.05 by ANOVA and Duncan's multiple range test.
Means with the same letter above the bars within each sample are not significantly different at P<0.05 by ANOVA and Duncan's multiple range test.
또한 시료들 간의 실험 측정치를 비교하기 위하여 Statistics Analysis Systems(SAS) 통계프로그램(ver 9.4, SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 t-test 또는 ANOVA-test 실시 후 Duncan test를 실시하여 P<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 평가하였다.

이론/모형

NO 생성은 Griess 반응법(23)으로 측정하였는데 96 well plate의 각 well에 세포배양액 100 μL와 Griess 용액(1% sulfanilamide in 5% HCl과 0.1% NEDD를 1:1로 혼합) 100 μL를 넣고 실온의 어두운 곳에서 20분간 두었다가 plate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
대표적인 항산화능의 지표로 이용되는 DPPH 라디칼 소거능은 Senba 등(20)의 방법에 따라 측정하였다. 시료는 에탄올을 이용하여 여러 농도로 희석한 다음 각각 200 μL씩을 취하고 에탄올에 녹인 200 μM의 DPPH 용액 800 μL를 넣어 37°C에서 30분간 incubation 한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
)를 넣고 얼음 위에 20분간 두었다가 4°C, 10,000×g에서 15분간 원심분리 하여 상층액을 모았다. 상층액의 단백질 농도는 Bradford 방법(24)으로 측정하였다. 모든 시료의 단백질 농도가 동일하도록 조정한 후 5× sodium dodecyl sulfate(SDS) sample buffer(Sigma-Aldrich Co.
세포에 대한 시료의 독성을 알아보기 위하여 MTT assay 방법(22)으로 분석하였다. 먼저 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM 배양액으로 2.
총 페놀화합물 함량은 Singleton 등(18)의 방법에 따라 추출시료 100 μL에 Folin-Ciocalteu reagent 1 mL, 7.5%의 sodium carbonate(Na2CO3) 800 μL를 가하고 빛을 차단하여 실온에서 30분간 방치한 후 spectrophotometer (Ultrospec 2100Pro, Amersham Phamacia Biotech, Cambridge, UK)로 760 nm에서 흡광도를 측정하였다.

성능/효과

05). DM, EA, BtOH 분획은 각각의 최고 처리 농도에서 IL-6 농도를 대조군의 38.7%, 45.7%, 52.0% 수준으로 크게 감소시켰다. 또한 복숭아꽃 추출시료를 처리했을 때 EtOH 추출물과 BtOH 분획은 200 μg/ mL, Hx 분획은 25 μg/mL, DM 분획은 12.
DPPH 라디칼 소거능은 EA> BtOH≥ EtOH> DM=DW> Hx 순이었으며, ABTS 라디칼 소거능은 EA> BtOH> EtOH=DM> Hx=DW 분획 순으로 항산화 효과는 EA, BtOH 분획이 가장 우수하였다.
EtOH 추출물, Hx, DM 분획은 각각의 최고 처리 농도에서 TNF-α의 농도를 대조군의 48.9%, 43.6%, 41.3%로 감소시켰다.
05), Hx, BtOH, DW 분획은 모든 처리 농도에서 PGE2의 농도를 감소시키지 못하였다. EtOH 추출물과 DM, EA 분획은 각각의 최고 처리 농도에서 PGE2의 농도를 대조군의 32.3%, 13.3%, 22.4% 수준으로 감소시켰다(Fig. 4). 그러나 LPS를 처리한 대식세포에서 복숭아꽃 추출물에 의한 PGE2 생성에 미치는 효과에 대한 다른 연구보고가 없어 본 연구 결과와 비교할 수가 없었다.
LPS를 처리하지 않은 RAW 264.7 세포에서는 iNOS와 COX-2 단백질이 거의 보이지 않았으나 LPS를 처리한 세포에서는 iNOS와 COX-2 단백질 합성량이 매우 크게 상승하였음을 볼 수 있었다. 복숭아꽃 EtOH 추출물을 100 또는 200 μg/mL 농도로 2시간 사전 처리한 후 LPS를 처리한 경우 iNOS 단백질은 LPS만 처리한 대조군에 비하여 각각 60.
LPS를 처리한 대식세포에 각 추출시료를 세포독성이 없는 농도로 처리한 결과 EtOH 추출물과 Hx, DM, EA 분획이 NO 생성을 유의하게 감소시켰으며(P<0.05), EtOH 추출물과 DM, EA 분획이 PGE2 생성을 유의하게 감소시켰다(P<0.05).
TNF-α 농도는 총 페놀화합물 함량(r=0.6524, P<0.05), 플라보노이드 함량(r=0.6914, P<0.05), DPPH 라디칼 소거능(IC50)(r=-0.6839, P<0.05), ABTS 라디칼 소거능(r=0.7921, P<0.01)과 각각 유의한 상관성을 나타낸 반면, PGE2나 IL-6 농도와는 유의한 상관성이 없었다.
그 결과 아질산염의 농도는 총 페놀화합물 함량, 플라보노이드 함량 및 항산화 효과 지표와는 유의한 상관성을 보이지 않았으나, PGE2 농도(r=0.6377, P<0.05) 및 TNF-α 농도 (r=0.6477, P<0.05)와는 각각 유의한 상관관계를 나타내었다.
7 대식세포에서 이들 추출물들이 NO, PGE2, IL-6, TNF-α 생성에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과 총 페놀화합물 함량과 플라보노이드 함량은 EA 분획(394.6 mg TA/g, 253.7 mg RT/g)이 가장 높았고, 그다음이 BtOH 분획(128.3 mg TA/g, 93.1 mg RT/g), DM 분획(79.5 mg TA/g, 52.9 mg RT/g), EtOH 추출물(78.1 mg TA/g, 55.3 mg RT/g) 순이었다. DPPH 라디칼 소거능은 EA> BtOH≥ EtOH> DM=DW> Hx 순이었으며, ABTS 라디칼 소거능은 EA> BtOH> EtOH=DM> Hx=DW 분획 순으로 항산화 효과는 EA, BtOH 분획이 가장 우수하였다.
86 mg/g 으로 3가지 추출물 중에서 70% 에탄올 추출물의 함량이 가장 높았다. 그러나 본 연구에서 사용한 100% 에탄올 추출물의 총 페놀화합물 함량은 이와 비교하면 5배 이상으로 매우 높은 수준이었다.
다만 TNF-α 농도만 총 페놀 화합물 함량(r=0.6524, P<0.05), 플라보노이드 함량(r=0.6914, P<0.05), DPPH 라디칼 소거능(IC50)(r=-0.6839, P<0.05), ABTS 라디칼 소거능(r=0.7921, P<0.01)과 각각 유의한 상관관계를 나타내었으며, 염증반응의 매개물질인 PGE2 및 IL-6 농도와는 유의한 상관성이 없었다.
따라서 복숭아꽃의 경우 DPPH 라디칼과 ABTS 라디칼 소거능이 높은 추출물일수록 대식세포에서 TNF-α의 생성을더 효과적으로 감소시킬 것으로 기대되었다.
또한 항산화 효과를 나타내는 지표인 DPPH 라디칼 소거능(IC50)과 ABTS 라디칼 소거능 간에도 서로 유의한 상관관계를 나타내었다(r=-0.7172, P<0.001)(Table 4).
모든 실험 결과는 3회 이상 반복하여 평균±표준편차로 나타내었다.
복숭아꽃 EtOH 추출물을 100 또는 200 μg/mL 농도로 2시간 사전 처리한 후 LPS를 처리한 경우 iNOS 단백질은 LPS만 처리한 대조군에 비하여 각각 60.9%와 34.8% 수준으로 크게 감소하였으며, COX-2 단백질은 각각 85.5%와 70.5% 수준으로 감소하였다.
복숭아꽃 추출시료를 3가지 다른 농도로 처리하였을 때 EtOH 추출물은 100 μg/mL, Hx과 EA분획은 25 μg/mL, DM 분획은 50 μg/ mL, BtOH 분획은 200 μg/mL 이상의 농도에서 LPS에 의하여 증가한 아질산염의 농도를 유의하게 감소시켰으며(P<0.05), DW 분획은 모든 농도에서 아질산염 농도를 감소시키지 못하였다.
01)과 각각 유의한 상관관계를 나타내었으며, 염증반응의 매개물질인 PGE2 및 IL-6 농도와는 유의한 상관성이 없었다. 본 실험 결과를 종합하면 복숭아꽃 에탄올 추출물은 항산화 효과와 항염증 효과가 우수하였으며, 그로부터 얻은 분획물 중에서 특히 EA와 BtOH 분획은 항산화 효과가 매우 우수하였고, DM과 EA 분획은 항염증 효과가 우수하였다. 따라서 복숭아꽃 에탄올 추출물을 비롯한 이들 분획물들은 산화적 스트레스 및 염증반응의 상승과 관련되어 있는 만성질환을 예방하는 건강기능성 식품의 개발을 위한 천연소재로 이용 가능할 것으로 기대된다.
본 연구 결과 복숭아꽃의 EtOH 추출물의 총 페놀화합물 함량과 플라보노이드 함량은 각각 78.1 mg/g과 55.3 mg/g 이었다(Table 2). Lee와 An(14)의 보고에서는 복숭아꽃을 음건한 후 추출한 열수, 70% 에탄올, 70% 아세톤 추출물의 폴리페놀 함량은 각각 6.
본 연구에서 LPS 처리군(LPS+)의 아질산염 농도는 24.3μM로 무처리군(LPS-)의 1.2 μM에 비하여 NO 생성량이 20배 정도 증가(P<0.001)한 것으로 보아 LPS에 의하여 염증반응이 충분히 활성화된 것을 알 수 있었다.
본 연구에서 복숭아꽃 추출물의 총 페놀화합물과 플라보노이드 함량은 DPPH 라디칼 소거능 및 ABTS 라디칼 소거능과 모두 유의한 상관관계를 나타내었지만 상관계수를 비교해보면 DPPH 라디칼 소거능보다는 ABTS 라디칼 소거능과 더 밀접한 상관관계를 보인다는 것을 알 수 있으며, 복숭아꽃의 항산화 효과의 대부분은 페놀화합물에 속하는 물질에 의한 작용에 의한 것으로 예측된다. Li와 Wang(3)도 복숭아꽃의 우수한 항산화 효과는 페놀화합물과 플라보노이드와 같은 구성물질에 기인한다고 하였다.
본 연구에서 총 페놀화합물 함량, 플라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거능(IC50), 200 μg/mL 농도 처리 시의 ABTS 라디칼 소거능 간의 상관관계를 살펴본 결과 총 페놀화합물의 함량은 플라보노이드 함량(r=0.9897, P<0.001), DPPH 라디칼 소거능(IC50)(r=-0.6081, P<0.01), ABTS 라디칼 소거능(r=0.9683, P<0.001)과 각각 유의적인 상관관계를 나타내었으며, 총 플라보노이드 함량 역시 DPPH 라디칼 소거능(IC50)(r=-0.5803, P<0.05) 및 ABTS 라디칼 소거능(r=0.9645, P<0.001)과 각각 유의적인 상관관계를 나타내었다.
본 연구에서는 RAW 264.7 대식세포에서 LPS 무처리군 (LPS-)에서는 염증촉진 매개물질인 IL-6와 TNF-α가 검출 되지 않았으나 LPS 처리군(LPS+)에서는 크게 증가하였다 (P<0.001).
동결 건조한 복숭아꽃으로부터 얻은 에탄올 추출물 및 분획물의 수율은 Table 1과 같다. 에탄올 추출 수율은 34.7%였으며, 극성이 다른 5가지 용매를 이용하여 비극성에서 극성이 강한 방향으로 순차적으로 분획 추출한 결과 DW 분획과 Hx 분획의 수율이 각각 13.7%와 12.9%로 높은 수준이었으며, DM 분획의 수율이 1.1%로 가장 낮았다.
5% 수준으로 감소하였다. 이로써 복숭아꽃 EtOH 추출물은 대식세포에서 LPS에 의하여 증가한 iNOS와 COX-2의 합성을 억제함으로써 NO와 PGE2의 생성을 감소시키는 효과가 유도되었다는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 현재까지 복숭아꽃 추출물에 의한 iNOS 또는 COX-2 단백질 합성에 미치는 영향에 대한 연구보고가 없어 다른 연구보고와 비교할 수는 없었다.
총 페놀화합물의 함량은 DPPH 라디칼 소거능 (IC50)(r=-0.6081, P<0.01), ABTS 라디칼 소거능(r=0.9683, P<0.001)과 유의적인 상관관계를 나타내었으며, DPPH 라디칼 소거능(IC50)과 ABTS 라디칼 소거능은 서로 유의한 상관관계(r=-0.7172, P<0.001)를 나타내었다.
한편 복숭아꽃의 에탄올 추출물로부터 순차적으로 분획 추출하여 얻은 5가지 분획물과 에탄올 추출물에 함유되어 있는 총 페놀화합물 함량을 상대적으로 비교하면 EA> BtOH> EtOH=DM> DW> Hx의 순이었고, 총 플라보노이드 함량 역시 EA> BtOH> EtOH=DM> Hx> DW로 총 페놀화합물 함량의 순과 거의 비슷하였다. 특히 EA와 BtOH 분획의 총 페놀화합물 함량은 각각 394.6 mg/g, 128.3 mg/g으로 에탄올 추출물에 비하여 각각 약 5.1배와 1.6배를 나타내었으며, 총 플라보노이드 함량도 각각 253.7 mg/g, 93.1 mg/g으로 에탄올 추출물의 약 4.6배와 1.7배를 나타내었다 (Table 2).
05), DW 분획은 모든 농도에서 아질산염 농도를 감소시키지 못하였다. 특히 EtOH 추출물과 Hx, DM, EA 분획은 각각의 최고 처리 농도에서 아질산염의 농도를 대조군의 38.5%, 39.3%, 43.5%, 44.8% 수준으로 크게 감소시켰다 (Fig. 4). Lee와 An(14)은 복숭아꽃의 열수 및 70% 에탄올 추출물은 50 μg/mL 이상에서, 70% 아세톤은 100 μg/mL 이상의 농도에서 RAW 264.
한편 대식세포에서 분비된 아질산염의 농도는 TNF-α농도(r=0.6477, P<0.05) 및 PGE2 농도(r=0.6377, P<0.05) 와 유의한 상관관계를 나타내었으며, 아질산염, PGE2, IL6 농도는 총 페놀화합물 함량이나 항산화 효과 지표들과 유의한 상관성을 보이지 않았다.
한편 복숭아꽃의 에탄올 추출물로부터 순차적으로 분획 추출하여 얻은 5가지 분획물과 에탄올 추출물에 함유되어 있는 총 페놀화합물 함량을 상대적으로 비교하면 EA> BtOH> EtOH=DM> DW> Hx의 순이었고, 총 플라보노이드 함량 역시 EA> BtOH> EtOH=DM> Hx> DW로 총 페놀화합물 함량의 순과 거의 비슷하였다.

후속연구

본 실험 결과를 종합하면 복숭아꽃 에탄올 추출물은 항산화 효과와 항염증 효과가 우수하였으며, 그로부터 얻은 분획물 중에서 특히 EA와 BtOH 분획은 항산화 효과가 매우 우수하였고, DM과 EA 분획은 항염증 효과가 우수하였다. 따라서 복숭아꽃 에탄올 추출물을 비롯한 이들 분획물들은 산화적 스트레스 및 염증반응의 상승과 관련되어 있는 만성질환을 예방하는 건강기능성 식품의 개발을 위한 천연소재로 이용 가능할 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	염증반응에서 대식세포의 역할은?	염증반응에서 대식세포는 매우 중요한 역할을 한다. 염증유발물질이나 신호가 세포 내로 유입되면 초기에 대식세포가 빠르게 활성화되어 많은 산화질소와 prostaglandin(PG)E2 및 interleukin(IL)-6, tumor necrosis factor(TNF)-α와 같은 염증성 interleukin과 부착성 물질 등의 분비를 증가시킴으로써 염증반응을 가속화시킨다(8). PGE2는 염증 부위에서 혈류의 증가, 부종, 통증을 유발시키는 주된 물질이며, TNF-α는 대표적인 염증성 사이토카인으로 염증반응 초기단계에서 IL-1β와 IL-6를 비롯한 다른 사이토카인들의 생성을 조절하는 작용을 하고, 염증세포를 염증 부위로 불러 모아 통증과 연골의 손상을 촉진시킨다(9)
	활성산소는 세포에 어떤 영향을 미치는가?	활성산소는 세포막 지질의 과산화를 촉진하고 nuclear factor kappa B(NF-κB)를 비롯한 여러 신호전달계를 활성화시킴으로써 염증반응을 촉진한다(4-6). 염증반응은 광범위한 외부 자극에 대하여 신체를 보호하기 위한 가장 중요한 면역 작용 중의 하나이지만 그 정도가 과도하거나 장기화되면 관절염, 천식, 다발성 경화증, 만성장염, 건선 등의 만성적 염증질환을 유발하게 된다(7).
	복숭아꽃에는 어떤 성분이 함유되어 있는가?	또한 Heo 등(16)은 동물실험 결과 복숭아꽃 에탄올 추출물이 자외선 B와 C에 의한 DNA 손상과 피부종양을 억제하는 효과가 있었는데 그것은 우수한 항산화 효과 때문이라 하였고, Li와 Wang(3)도 복숭아꽃 메탄올 추출물이 라디칼에 의해 유도되는 DNA 손상으로부터 보호하는 효과가 있다고 하였다. 복숭아꽃에는 플라보노이드에 속하는 kaempferol과 그 배당체, albamyricetin 등의 성분들이 함유되어 있고, kaempferol의 경우 지질과산화와 콜레스테롤 억제 효과가 있으며, 항산화 효과가 높다고 알려져 있다 (3,10). 최근 Lee와 An(17)은 복숭아꽃 아세톤 추출물로부터 얻은 여러 분획 중 일부가 LPS를 처리한 RAW 264.

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표제어: PCR

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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