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문제 정의
- 본 연구에서는 Soxhlet 추출을 이용하여 감귤 껍질을 추출할 때 용매의 종류와 추출 시간이 d-limonene 추출량에 미치는 영향을 알아보고, 그에 따른 최적의 추출 조건을 조사하였다. 추출 용매로 에탄올, n-헥산, 석유에테르를 사용했고, 각 용매마다 추출 시간을 1시간, 2시간, 4시간으로 두었다.
제안 방법
- 세 가지 용매 모두 200 mL를 측정하여 Soxhlet 추출기의 둥근 플라스크에 담아 추출 용매로 사용하였고, 추출 온도는 heating mantle을 이용해 플라스크를 가열하여 120℃로 일정하게 유지시켰다. 2시간 동안 추출한 선행연구를 바탕으로[6] 추출 시간에 따라 수율의 차이를 알아보기 위해 추출 시간을 1시간, 2시간, 4시간으로 하였다. 각 용매 당 3회에 걸쳐 총 9가지의 추출 시료를 얻었다.
- Soxhlet 추출기에서 에탄올, n-헥산, 석유에테르를 용매로 하여 귤껍질 40g을 120℃에서 각각 1시간, 2시간, 4시간 동안 추출한 시료를 HPLC에서 정량분석 하였다.
- d-limonene이 비극성 물질이므로, 이를 희석하기 위한 비극성 용매는 n-헥산(Duksan Chemistry, Korea)을 사용하였다. d-limonene 표준시약을 0.006, 0.032, 0.064, 0.096 mL만큼 각각 측정한 후 n-헥산 40 mL에 희석하여 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM의 표준용액을 만들었다.
- 08의 메탄올-증류수(80:20, v/v) 이동상, 그 외의 조건은 변경하지 않은 상태에서 5 mM d-limonene 표준용액을 분석한 결과이다. d-limonene 피크의 머무름 시간은 19분으로 나와 Fig. 3B의 조건보다 분석시간이 단축되었고, 불순물과의 분리도 명확하기 때문에 추출시료를 분석하는 위한 HPLC 이동상은 메탄올과 증류수를 80:20으로 혼합한 용매를 선택하였다. 이용매 조건에서 d-limonene 농도에 따라 피크면적을 나타내는 검량선을 얻은 결과, 수식은 y(mV·s)=6858.
- d-limonene을 분석하기 용이한 이동상을 찾기 위해 4번에 걸쳐 용매 종류와 부피 비를 변경하였다. 첫 번째로 n-헥산과 에탄올(Duksan Chemistry, Korea)의 90:10[10], 두 번째는 메탄올(Samchun Chemical, Korea)과 증류수 75:25로 섞은 용매[11], 세 번째와 네 번째는 메탄올과 증류수를 각각 85:15 및 80:20으로 혼합한 용매를 사용하였다.
- 2시간 동안 추출한 선행연구를 바탕으로[6] 추출 시간에 따라 수율의 차이를 알아보기 위해 추출 시간을 1시간, 2시간, 4시간으로 하였다. 각 용매 당 3회에 걸쳐 총 9가지의 추출 시료를 얻었다. 그 이후엔 앞서 결정된 HPLC 분석 조건을 이용하여 9가지의 추출 시료에 대해 각각 정량분석 하였다.
- 각 용매 당 3회에 걸쳐 총 9가지의 추출 시료를 얻었다. 그 이후엔 앞서 결정된 HPLC 분석 조건을 이용하여 9가지의 추출 시료에 대해 각각 정량분석 하였다.
- 본 연구에서는 Soxhlet 추출기에서 극성도가 서로 다른 에탄올, 헥산, 석유에테르 3가지 용매를 사용하여 1시간, 2시간, 4시간 동안 각각 추출시간을 바꾸며 일정량의 감귤 껍질을 추출하였다. 그리고 d-limonene 추출의 효율성 및 경제성을 비교하기 위한 역상 HPLC의 최적의 분석 조건을 찾고, 감귤 껍질로부터 추출한 시료들을 HPLC에서 정량 분석하여 가장 효율적으로 d-limonene을 추출할 수 있는 최적의 용매와 추출 시간을 알아보았다.
- 감귤 껍질로부터 d-limonene을 추출하기 위해 국내 제주도산 감귤을 사용하였다. 보관 온도를 약 4℃로 유지시켜 냉장보관 했으며, 최대한 오염이 되지 않은 상태로 유수분이 있는 원래의 상태를 유지시킨 상태에서 과육으로부터 껍질을 분리하고 즉시 실험에 이용하였다. 환류냉각장치와 heating mantle (Taisite, China), Soxhlet 추출기(Duran group, Germany)를 추출 장비로 구성하였다.
- 본 연구에서는 Soxhlet 추출기에서 극성도가 서로 다른 에탄올, 헥산, 석유에테르 3가지 용매를 사용하여 1시간, 2시간, 4시간 동안 각각 추출시간을 바꾸며 일정량의 감귤 껍질을 추출하였다. 그리고 d-limonene 추출의 효율성 및 경제성을 비교하기 위한 역상 HPLC의 최적의 분석 조건을 찾고, 감귤 껍질로부터 추출한 시료들을 HPLC에서 정량 분석하여 가장 효율적으로 d-limonene을 추출할 수 있는 최적의 용매와 추출 시간을 알아보았다.
- 에탄올과 나머지 두 용매의 결과를 비교하여 극성도에 대한 효율차이를 알 수 있고, 극성도가 같은 n-헥산과 석유에테르를 비교함으로써 끓는점에 대한 차이를 알 수 있다. 세 가지 용매 모두 200 mL를 측정하여 Soxhlet 추출기의 둥근 플라스크에 담아 추출 용매로 사용하였고, 추출 온도는 heating mantle을 이용해 플라스크를 가열하여 120℃로 일정하게 유지시켰다. 2시간 동안 추출한 선행연구를 바탕으로[6] 추출 시간에 따라 수율의 차이를 알아보기 위해 추출 시간을 1시간, 2시간, 4시간으로 하였다.
- 0 mL/min, 컬럼 온도는 25℃, 시료용량은 20 μL, UV 파장은 200 nm로 일정하게 유지시켰다. 적합한 용매를 결정한 후 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM 표준용액을 분석하여 표준 d-limonene을 정량분석 할 수 있는 검량선을 얻었다.
- d-limonene을 분석하기 용이한 이동상을 찾기 위해 4번에 걸쳐 용매 종류와 부피 비를 변경하였다. 첫 번째로 n-헥산과 에탄올(Duksan Chemistry, Korea)의 90:10[10], 두 번째는 메탄올(Samchun Chemical, Korea)과 증류수 75:25로 섞은 용매[11], 세 번째와 네 번째는 메탄올과 증류수를 각각 85:15 및 80:20으로 혼합한 용매를 사용하였다. 펌프의 유량은 1.
- 본 연구에서는 Soxhlet 추출을 이용하여 감귤 껍질을 추출할 때 용매의 종류와 추출 시간이 d-limonene 추출량에 미치는 영향을 알아보고, 그에 따른 최적의 추출 조건을 조사하였다. 추출 용매로 에탄올, n-헥산, 석유에테르를 사용했고, 각 용매마다 추출 시간을 1시간, 2시간, 4시간으로 두었다. 추출 시료를 HPLC에서 분석한 결과, 세 용매 중 극성도가 가장 높은 에탄올을 추출 용매로 하여 2시간 동안 추출했을 때 7.
- , Canada)을 사용하였다. 컬럼을 통과한 시료를 UV-detector 장치인 783A Programmable Absorbance Detector (Applied Biosystem, USA)를 통해 전기적 신호를 받고, Autochro Data Module (Younglin Instrument, Korea)과 Autochro 2000 (Younglin Instrument, Korea) 프로그램을 사용하여 전기 신호를 디지털 신호로 바꾸어 PC 화면으로 크로마토그램을 확인하였다.
- 표준 d-limonene의 정량분석을 위해 d-limonene 표준용액을 제작하였다. 표준용액 제작에 사용된 표준시약은 순도 97%의 액상(R)-(+)-Limonene (Sigma, USA)이다.
- 표준용액 및 시료을 분석하기 위한 HPLC 장치를 구성하였다. 이 동상을 컬럼에 흘려보내는 펌프로 110B Solvent Delivery Module (Beckman, Germany)을 사용했다.
- 보관 온도를 약 4℃로 유지시켜 냉장보관 했으며, 최대한 오염이 되지 않은 상태로 유수분이 있는 원래의 상태를 유지시킨 상태에서 과육으로부터 껍질을 분리하고 즉시 실험에 이용하였다. 환류냉각장치와 heating mantle (Taisite, China), Soxhlet 추출기(Duran group, Germany)를 추출 장비로 구성하였다. 감귤 껍질 추출 과정을 Fig.
대상 데이터
- Automated Switching Valve (Millipore, USA)를 이용하여 ULTRAMEX-C18 (0.46×25 cm, 5 μm) 컬럼에 시료를 주입하였다.
- 감귤 껍질로부터 d-limonene을 추출하기 위해 국내 제주도산 감귤을 사용하였다. 보관 온도를 약 4℃로 유지시켜 냉장보관 했으며, 최대한 오염이 되지 않은 상태로 유수분이 있는 원래의 상태를 유지시킨 상태에서 과육으로부터 껍질을 분리하고 즉시 실험에 이용하였다.
- d-limonene을 추출하기 위한 용매는 유기 용매가 주로 사용되었다[6]. 본 연구에서는 극성도(polarity)와 끓는점의 차이에 의한 추출 정도 알아보기 위해 추출 용매를 에탄올(Duksan Chemistry, Korea), n-헥산(Duksan Chemistry, Korea), 석유에테르(J. T. Baker, USA), 세 가지를 사용했다. 각 용매의 극성도와 끓는점을 Table 1에 정리하였다[12].
- 표준용액 및 시료을 분석하기 위한 HPLC 장치를 구성하였다. 이 동상을 컬럼에 흘려보내는 펌프로 110B Solvent Delivery Module (Beckman, Germany)을 사용했다. Automated Switching Valve (Millipore, USA)를 이용하여 ULTRAMEX-C18 (0.
성능/효과
- 18×103 mV·s이었다. 검량선을 통해 d-limonene 농도를 추정한 결과 0.31, 0.53, 0.24 mM이었고, 추출 후 남은 용매의 부피를 고려하여 실제 추출량을 계산한 결과 각각 6.88, 11.18, 5.06 mg의 d-limonene이 검출되었다.
- 45×103 mV·s이었다. 검량선을 통해 d-limonene 농도를 추정한 결과 0.57, 0.89, 0.86 mM이었고, 추출 후 남은 용매의 부피를 고려하여 실제 추출량을 계산한 결과 각각 12.80, 19.48, 20.02 mg의 d-limonene이 검출되었다.
- 87×104 mV·s이었다. 검량선을 통해 d-limonene 농도를 추정한 결과 7.72, 14.72, 11.43 mM이었고, 추출 후 남은 용매의 부피를 고려하여 실제 추출량을 계산한 결과 각각 171.99, 310.84, 225.69 mg의 d-limonene이 검출되었다.
- 즉, 에탄올을 이용해 추출할 경우 나머지 두 용매를 이용해 추출하는 경우에 비해 더 많은 d-limonene을 얻을 수 있었다. 끓는점이 크게 차이가 나지 않는 세 용매에서 d-limonene 추출량을 비교했을 때, 에탄올 내에서의 d-limonene 함유량이 n-헥산 및 에테르의 함유량보다 현저하게 많은 것으로 보아 용매의 끓는점 보다는 극성도가 더욱 중요한 인자라는 것을 알 수 있었다. 에탄올에 비해 상대적으로 비극성 용매인 n-헥산과 석유 에테르 용매에서 d-limonene의 용해도가 높기 때문에, 증류와 냉각을 반복한 추출 과정에서 용매와 함께 d-limonene 성분이 증발한 것으로 보인다.
- 3D)와 마찬가지로 19분에 단일 피크가 검출되었다. 세 피크를 비교했을 때 피크의 폭은 모두 비슷했으나 1시간 추출 시료의 피크높이가 가장 낮게 나타났고 2시간 추출 시료의 피크가 가장 높았다. 4시간 추출 시료의 피크는 2시간의 경우보다 조금 작은 피크가 검출되었다.
- 시간별 d-limonene 피크 면적을 적분한 결과, 1시간 추출 시료의 피크 면적은 1.67×103 mV·s, 2시간 추출 시료는 3.15×103 mV·s, 4시간 추출 시료는 1.18×103 mV·s이었다.
- 시간별 d-limonene 피크 면적을 적분한 결과, 1시간 추출 시료의 피크 면적은 2.60×104 mV·s, 2시간 추출 시료는 5.00×104 mV·s, 4시간 추출 시료는 3.87×104 mV·s이었다.
- 시간별 d-limonene 피크 면적을 적분한 결과, 1시간 추출 시료의 피크면적은 3.46×103 mV·s, 2시간 추출 시료는 5.65×103 mV·s, 4시간 추출 시료는 5.45×103 mV·s이었다.
- 5는 n-헥산을 용매로 하여 120℃에서 각각 1, 2, 4시간 동안 추출한 시료를 HPLC에 주입한 결과를 나타내는 크로마토그램이다. 에탄올추출물의 시료보다 다양한 불순물 피크가 발생했고, 머무름 시간 19분에 단일 피크가 검출되었다. 에탄올의 경우와 마찬가지로 1시간 추출 시료의 피크 높이가 가장 낮았으며, 2시간 추출 시료와 4시간 추출 시료의 피크 높이는 비슷하게 나타났다.
- 77 mg/g의 수율로 d-limonene이 가장 많이 추출된 것으로 나타났다. 이를 통해 Soxhlet 추출기와 같은 연속증류 추출 방법을 사용하여 감귤 껍질로부터 d-limonene을 추출할 때는 껍질에서 추출되는 양과 증발로 인한 손실되는 양을 모두 고려한 최적시간인 2시간에 근접한 시간을 선택하고, 용매는 n-헥산이나 석유에테르와 같은 무극성 용매보다는 에탄올과 같은 극성 유기용매를 선택하는 것이 효과적이다.
- 77 mg/g 이었다. 즉, 에탄올을 이용해 추출할 경우 나머지 두 용매를 이용해 추출하는 경우에 비해 더 많은 d-limonene을 얻을 수 있었다. 끓는점이 크게 차이가 나지 않는 세 용매에서 d-limonene 추출량을 비교했을 때, 에탄올 내에서의 d-limonene 함유량이 n-헥산 및 에테르의 함유량보다 현저하게 많은 것으로 보아 용매의 끓는점 보다는 극성도가 더욱 중요한 인자라는 것을 알 수 있었다.
- 추출 시료를 HPLC에서 분석한 결과, 세 용매 중 극성도가 가장 높은 에탄올을 추출 용매로 하여 2시간 동안 추출했을 때 7.77 mg/g의 수율로 d-limonene이 가장 많이 추출된 것으로 나타났다.
- 이는 아직 증발량이 추출량보다 더 큰 시간을 지나지 않은 것으로 보인다. 하지만, d-limonene 함유량이 에탄올 추출물에 비해 낮은 농도이므로 극성도가 높은 에탄올에서의 추출이 가장 효율적인 방법이라는 것을 알 수 있었다. 추출조건의 최적화는 천연물 추출과 크로마토그래피 분석에서 필요한 실험 방법으로 반응표면 분석법이 자주 사용된다[13,14].
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