김치에서 분리한 Lactobacillus plantarum과 Leuconostoc mesenteroides의 프로바이오틱 효과 Probiotic Effects of Lactobacillus plantarum and Leuconostoc mesenteroides Isolated from Kimchi원문보기
본 연구에서는 김치에서 분리한 우점유산균인 Lactobacillus plantarum KCCM 11352P(LPpnu)와 Leuconostoc mesenteroides KCCM 11353P(LMpnu)의 프로바이오틱 효과를 프로바이오틱 효과가 높기로 잘 알려진 Lactobacillus rhamnosus GG(LRgg)의 효능과 비교하여 확인하였다. 그 결과 LPpnu는 Lab. rhamnosus GG(LRgg)보다 프로바이오틱 효과가 더 뛰어났으며, LMpnu 또한 LRgg와 거의 유사한 수준의 효능을 나타냈다. LPpnu와 LMpnu는 모두 내산, 내담즙성, 장 부착능, 열 안정성의 프로바이오틱의 기본 특성을 가지고 있었으며, 특히 LPpnu는 가장 높은 프로바이오틱 효과를 나타냈다. 또한 LMpnu 및 LRgg와 비교했을 때 LPpnu는 DPPH radical과 hydroxyl radical 소거능 측정에서 더 높은 항산화능을 보였고, Bcl-2 유전자 발현억제와 Bax 유전자 발현 증가를 통해 apoptosis를 유도함으로써 HT-29 human colon cancer cell에서 높은 암세포 성장 저해 효과를 나타냈다. 이를 통해 김치유래 LPpnu와 LMpnu는 프로바이오틱으로서 이용 가능성이 충분하다고 판단되며, 특히 LPpnu는 항산화 및 항암 활성에 뛰어난 효능을 나타내었기에 중요한 프로바이오틱 균주라고 하겠다.
본 연구에서는 김치에서 분리한 우점유산균인 Lactobacillus plantarum KCCM 11352P(LPpnu)와 Leuconostoc mesenteroides KCCM 11353P(LMpnu)의 프로바이오틱 효과를 프로바이오틱 효과가 높기로 잘 알려진 Lactobacillus rhamnosus GG(LRgg)의 효능과 비교하여 확인하였다. 그 결과 LPpnu는 Lab. rhamnosus GG(LRgg)보다 프로바이오틱 효과가 더 뛰어났으며, LMpnu 또한 LRgg와 거의 유사한 수준의 효능을 나타냈다. LPpnu와 LMpnu는 모두 내산, 내담즙성, 장 부착능, 열 안정성의 프로바이오틱의 기본 특성을 가지고 있었으며, 특히 LPpnu는 가장 높은 프로바이오틱 효과를 나타냈다. 또한 LMpnu 및 LRgg와 비교했을 때 LPpnu는 DPPH radical과 hydroxyl radical 소거능 측정에서 더 높은 항산화능을 보였고, Bcl-2 유전자 발현억제와 Bax 유전자 발현 증가를 통해 apoptosis를 유도함으로써 HT-29 human colon cancer cell에서 높은 암세포 성장 저해 효과를 나타냈다. 이를 통해 김치유래 LPpnu와 LMpnu는 프로바이오틱으로서 이용 가능성이 충분하다고 판단되며, 특히 LPpnu는 항산화 및 항암 활성에 뛰어난 효능을 나타내었기에 중요한 프로바이오틱 균주라고 하겠다.
The probiotic effects of kimchi lactic acid bacteria (LAB), Lactobacillus plantarum (Lab. plantarum) and Leuconostoc mesenteroides (Leu. mesenteroides), were studied. Lab. plantarum KCCM 11352P (LPpnu) and Leu. mesenteroides KCCM 11353P (LMpnu) were isolated from kimchi and were the predominant LAB....
The probiotic effects of kimchi lactic acid bacteria (LAB), Lactobacillus plantarum (Lab. plantarum) and Leuconostoc mesenteroides (Leu. mesenteroides), were studied. Lab. plantarum KCCM 11352P (LPpnu) and Leu. mesenteroides KCCM 11353P (LMpnu) were isolated from kimchi and were the predominant LAB. We compared their probiotic effects with Lactobacillus rhamnosus GG (LRgg), a well-known probiotic LAB. LPpnu showed better probiotic activities than LRgg. LMpnu also exhibited almost equal activities as LRgg. These two kimchi LAB strains exhibited resistance to gastric and bile acid, adhesion to intestines, and thermal stability. In particular, LPpnu showed excellent probiotic properties. In addition, LPpnu showed greater antioxidant activity by scavenging DPPH radicals or hydroxyl radicals than LMpnu or LRgg. LPpnu also inhibited growth of HT-29 human colon cancer cells by inducing apoptosis, increasing Bax and suppressing Bcl-2 expression compared to LMpnu or LRgg. Taken together, LPpnu and LMpnu could be used as probiotics, and LPpnu exhibited the most beneficial probiotic activities with anti-oxidant and anti-cancer properties.
The probiotic effects of kimchi lactic acid bacteria (LAB), Lactobacillus plantarum (Lab. plantarum) and Leuconostoc mesenteroides (Leu. mesenteroides), were studied. Lab. plantarum KCCM 11352P (LPpnu) and Leu. mesenteroides KCCM 11353P (LMpnu) were isolated from kimchi and were the predominant LAB. We compared their probiotic effects with Lactobacillus rhamnosus GG (LRgg), a well-known probiotic LAB. LPpnu showed better probiotic activities than LRgg. LMpnu also exhibited almost equal activities as LRgg. These two kimchi LAB strains exhibited resistance to gastric and bile acid, adhesion to intestines, and thermal stability. In particular, LPpnu showed excellent probiotic properties. In addition, LPpnu showed greater antioxidant activity by scavenging DPPH radicals or hydroxyl radicals than LMpnu or LRgg. LPpnu also inhibited growth of HT-29 human colon cancer cells by inducing apoptosis, increasing Bax and suppressing Bcl-2 expression compared to LMpnu or LRgg. Taken together, LPpnu and LMpnu could be used as probiotics, and LPpnu exhibited the most beneficial probiotic activities with anti-oxidant and anti-cancer properties.
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문제 정의
이를 위해 Lab. rhamnosus GG를 대조군으로 하여 2종의 김치 유산균의 위산과 담즙산에 대한 내성, 장내세포에 대한 부착성, 열 안정성을 비교하였으며, 추가적인 기능성을 확인하기 위하여 항산화 및 항암 활성을 평가하여 김치 유산균의 우수성을 과학적으로 입증하고자 하였다.
본 연구에서는 김치에서 2종의 우점 유산균을 분리 동정하여(Lab. plantarum, Leu. mesenteroides) 김치 유산균의 프로바이오틱으로서의 이용 가능성을 확인하고자 하였다. 이를 위해 Lab.
본 연구에서는 김치에서 분리한 우점유산균인 Lactobacillus plantarum KCCM 11352P(LPpnu)와 Leuconostoc mesenteroides KCCM 11353P(LMpnu)의 프로바이오틱 효과를 프로바이오틱 효과가 높기로 잘 알려진 Lactobacillus rhamnosus GG(LRgg)의 효능과 비교하여 확인하였다. 그 결과 LPpnu는 Lab.
제안 방법
분리한 균주의 16S rDNA 유전자 염기서열은 universal primer(27F, AGAGTTTGATCCTGGCTCAG; forward, 1492R, GGCTACCTTGTTACGACTT; reverse)를 이용하여 증폭시킨 후, GenoTech Corp.(Daejeon, Korea)에 염기서열의 상동성 분석을 의뢰하였다. 16S rDNA 염기서열을 NCBI의 database와 비교하여 분석한 결과 분리한 2종의 균주는 각각 Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides와 99%의 상동성을 나타내어 Lactobacillus plantarum PNU(KCCM 11352P)와 Leuconostoc mesenteroides PNU(KCCM 11353P)로 명명하여 한국미생물보존센터(Seoul, Korea)에 기탁하였다.
장관 상피세포벽에 부착된 유산균은 mucin 생산을 촉진시키거나 병원균의 부착 및 장관 투과력을 감소시키고, 이들이 생산한 독성물질의 통과를 억제함으로써 장내 병원균에 의한 상피세포의 손상을 막아 숙주의 방어체계 시스템을 강화한다(26). LRgg는 장상피 세포에 높은 부착능력을 가지고 있는 것으로 보고되고 있으며 본 연구에서는 이를 대조군으로 사용하였다(27). 본 연구에서 HT-29 세포에 대한 부착능은 대조구 LRgg에서는 81.
Bax 유전자의 primer sequence는 5'-AAGCTGAGCGAGTGTCTCCGGCG-3'(forward), 5'-CAGATGCCGGTTCAGGTACTCAGTC-3'(reverse)를 사용하였고, Bcl-2 유전자의 primer sequence는 5'-CTCGTCGCTACCGTCGTGACTTGG-3'(forward), 5'-CAGATGCCGGTTCAGGTACTCAGTC-3'(reverse)를 사용하였으며, GAPDH 유전자의 primer sequence는 5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTC-3'(forward), 5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGA-3'(reverse)를 사용하였다. 각 PCR 산물들은 2% agarose gel(Invitrogen Co.)을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.
각 균주는 MRS broth를 이용하여 37°C에서 혐기적으로 3차 계대 배양하여 프로바이오틱 효능 확인 실험에 사용하였고, 항암 기능성 실험에서는 이를 원심분리(2,000×g, 10분) 한 후 phosphate buffered saline(PBS)에 2회 세척한 다음 100°C에서 1시간 사멸시켜 사용하였다(13).
각 균주를 5.0×106 CFU/mL와 1.0×107 CFU/mL의 농도로 희석하여 15 mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma-Aldrich Co.) 용액과 1:1의 비율로 혼합하여 빛이 차단된 상태에서 30분간 방치한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
각 배추김치를 5°C에서 숙성시키며 pH 4.3인 적숙기에 도달했을 때 착즙하여 멸균한 증류수로 단계별로 희석한 후, 이를 MRS(Difco, Sparks, MD, USA) 평판배지에 접종, 도말한 다음 37°C에서 2~3일간 혐기 배양하여 생성된 유산균 colony를 순수 분리하였다.
그리고 1 mM FeCl3 및 1.04 mM EDTA 용액 50 μL, 1 mM ascorbate 50 μL, 0.1M H2O2 5 μL를 각각 첨가하고 37°C에서 10분간 반응시킨 후, 2.8% trichloroacetic acid 500 μL와 1% 2-thiobarbituric acid 250 μL를 첨가하고 95°C에서 8분간 가열하였다.
김치 유산균의 DPPH radical 소거 활성은 Blois(18)의 방법을 변형하여 측정하였다.
김치 유산균의 HT-29 cell에 대한 부착능을 확인하기 위하여 cell을 각 well당 1.0×104 cells/mL가 되도록 6-well plate에 분주하고, 각 균주를 1.0×108 CFU/mL가 되도록 현탁하여 각 well에 접종하고 37°C, 5% CO2 조건에서 2시간 배양하여 HT-29 세포에 부착시켰다.
0 정도로 유지되어 대부분의 미생물은 위산 내에서 사멸되나 섭취한 음식물의 완충 작용에 의하여 다소 pH가 높아져 미생물의 사멸을 어느 정도 감소시킬 수 있다(20). 김치 유산균의 위산에 대한 내성을 측정하기 위하여 pH 2.0 및 소화효소인 pepsin을 함유한 인공 위액에 각 균주를 접종하여 시간별로 생균수를 측정하였다(Fig. 1). 반응 1시간 후 생균수를 측정하여 반응 전과 비교한 결과 3가지 균주 모두 97% 이상의 높은 생존율을 나타내었다.
배양한 cell에 균주를 5.0×106 CFU/mL와 1.0×107 CFU/mL의 농도로 처리한 후 trizol reagent(Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 분리한 다음 정량하여 oligo dT primer(Invitrogen Co.)와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 ss cDNA로 역전사 하였다.
02% EDTA를 10분간 처리하여 세포를 분리하였다. 분리한 세포를 멸균 증류수로 단계별로 희석하여 MRS 평판배지에 접종하고 48시간 배양하여 생균 수를 측정한 후, 다음과 같이 장 부착률을 측정하였다(16).
열 안정성 측정은 MRS broth에서 배양한 김치 유산균을 55°C에 2시간 방치하며 각 시간별로 생존한 생균수를 측정하여 계산하였다(17).
유산균의 열 안정성은 55°C에서 2시간 정치 후 각 시간별로 생존하는 유산균의 수를 측정하였다(Fig. 4).
인공 담즙산에 대한 내성 평가는 0.02 M cholic acid, 0.02 M deoxycholic acid, 0.05 mg/mL lipase를 첨가한 0.02 mg/mL pancreatin(Sigma-Aldrich Co.) 용액을 1 N HCl 및 NaOH를 이용하여 pH 8.0으로 조정한 인공 담즙산에 각 유산균을 접종하여 37°C에서 6시간 배양하며 2시간마다 생균수를 측정하였다(15).
인공 위액 및 인공 담즙산에서의 생균수는 인공 위액 및 담즙산에서 배양한 각 균주를 멸균 증류수로 단계별로 희석하여 MRS 평판배지에 접종한 후, 37°C에서 48시간 동안 배양하여 측정하였다.
대상 데이터
(Daejeon, Korea)에 염기서열의 상동성 분석을 의뢰하였다. 16S rDNA 염기서열을 NCBI의 database와 비교하여 분석한 결과 분리한 2종의 균주는 각각 Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides와 99%의 상동성을 나타내어 Lactobacillus plantarum PNU(KCCM 11352P)와 Leuconostoc mesenteroides PNU(KCCM 11353P)로 명명하여 한국미생물보존센터(Seoul, Korea)에 기탁하였다.
HT-29 cell(human colon adenocarcinoma cells)은 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 실험에 사용하였다. RPMI 1640, fetal bovine serum(FBS), 100 units/mL penicillin-streptomycin 및 0.
HT-29 cell(human colon adenocarcinoma cells)은 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 실험에 사용하였다. RPMI 1640, fetal bovine serum(FBS), 100 units/mL penicillin-streptomycin 및 0.05% trypsin-0.02% EDTA는 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. HT-29 cell은 10% FBS와 100 units/mL penicillin-streptomycin이 함유된 RPMI 1640을 사용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
plantarum은 전라북도 전주지역 김치 제조 전문인에 의해 제조된 배추김치에서, Leu. mesenteroides는 부산대학교 김치연구소의 항암김치 레시피(12)로 제조한 배추김치에서 각각 분리하였다. 각 배추김치를 5°C에서 숙성시키며 pH 4.
본 연구에서는 김치 유산균의 프로바이오틱 효과를 검증하기 위해 현재 프로바이오틱으로 많이 이용되며 기능적으로 우수성이 증명된 Lab. rhamnosus GG(KCTC 5033; LRgg)를 미생물자원센터에서 구입하여 대조군으로 이용하였다. 각 균주는 MRS broth를 이용하여 37°C에서 혐기적으로 3차 계대 배양하여 프로바이오틱 효능 확인 실험에 사용하였고, 항암 기능성 실험에서는 이를 원심분리(2,000×g, 10분) 한 후 phosphate buffered saline(PBS)에 2회 세척한 다음 100°C에서 1시간 사멸시켜 사용하였다(13).
데이터처리
본 실험 결과는 3번의 반복실험으로 수행하였으며, 그 결과는 평균±표준편차로 나타내었다.
통계적 유의성은 분산분석(ANOVA)을 행한 후 P<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 이용하여 검정하였다.
이론/모형
Hydroxyl radical 소거 활성의 측정은 Halliwell 등(19)의 방법에 따라 5.0×106 CFU/mL와 1.0×107 CFU/mL의 농도로 희석한 균주 50 μL에 2.5 mM 2-deoxy-D-ribose를 함유한 10 mM PBS 용액 345 μL를 혼합하였다.
인공 위산에 대한 내성은 Kobayashi 등(14)의 방법에 따라 1 mg/mL pepsin(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 용액에 HCl을 이용하여 pH를 2.5로 조정한 인공 위산을 제조하여 각 유산균을 접종한 후 37°C에서 3시간 배양하며 1시간마다 생균수를 측정하였다.
성능/효과
2종의 김치 유산균 모두 인공 위액에 대해 LRgg보다 유의적으로 높은 생존율을 보였는데(P<0.05), 이는 본 연구에서 사용한 LPpnu와 LMpnu가 식물성 유산균으로 김치와 같은 산성의 열악한 조건 속에서 우점종을 차지하는 우수한 생존력을 가졌기 때문으로 사료된다.
DPPH는 free radical을 가지고 있어 항산화 활성이 있는 물질과 반응하게 되면 전자를 내어주면서 radical이 소멸되고 그 특유의 보라색이 투명하고 노란빛을 띠게 되며, radical을 환원시키는 능력, 즉 radical scavenging 활성이 클수록 항산화 활성이 높다고 할 수 있다(30). 3종 유산균의 DPPH radical 소거 효과를 측정한 결과(Fig. 5A), 이들 모두 처리 농도가 증가할수록 DPPH radical 소거 활성이 증가하였다. 또한 5.
05). DPPH radical 소거능 결과와 같은 경향으로 LPpnu가 가장 높은 hydroxyl radical 소거 활성을 가지며, 항산화 활성에서 가장 우수한 효능을 나타낸 것을 확인하였다.
HT29 cell에서의 Bax의 발현은 control군에 비하여 유산균을 처리한 군에서 유의적으로 증가하는 경향을 나타내었고, 그 중 특히 LPpnu군에서 유의적으로 높은 증가율을 보였으며 다음으로 LMpnu, LRgg 순으로 나타났다(P<0.05; Fig. 7).
따라서 LPpnu가 가장 큰 DPPH radical 소거능을 가짐으로써 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다. Hydroxyl radical 소거 효과 측정 결과(Fig. 5B), DPPH radical 소거 활성 결과와 마찬가지로 유산균 처리 농도가 높을수록 높은 hydroxyl radical 소거 활성을 보였다. 특히 1.
rhamnosus GG(LRgg)보다 프로바이오틱 효과가 더 뛰어났으며, LMpnu 또한 LRgg와 거의 유사한 수준의 효능을 나타냈다. LPpnu와 LMpnu는 모두 내산, 내담즙성, 장 부착능, 열 안정성의 프로바이오틱의 기본 특성을 가지고 있었으며, 특히 LPpnu는 가장 높은 프로바이오틱 효과를 나타냈다. 또한 LMpnu 및 LRgg와 비교했을 때 LPpnu는 DPPH radical과 hydroxyl radical 소거능 측정에서 더 높은 항산화능을 보였고, Bcl-2 유전자 발현억제와 Bax 유전자 발현 증가를 통해 apoptosis를 유도함으로써 HT-29 human colon cancer cell에서 높은 암세포 성장 저해 효과를 나타냈다.
MTT assay를 이용하여 김치 유산균의 HT-29 cell 성장 억제 효과를 측정하였는데(Fig. 6), 김치 유산균 처리군 모두에서 성장 억제 효능이 관찰되었다. 김치 유산균 농도를 5.
plantarum과 Leu. mesenteroides가 in vitro에서 암세포의 성장을 억제하는 것으로 나타났다.
06%로 나타난 것에 비해 Lab. plantarum BSM-2와 EHJ-1은 4.01%와 4.62%로 LRgg보다 더 높은 장부착능을 보인 것으로 나타났다. 유산균의 세포부착능에 관여하는 인자는 정전기적 인력, 소수성 결합, 세포벽의 lipoteichoic acid와 같은 구조적인 특성 등을 들 수 있으며, 특히 S layer protein, teichoic acid 등의 유산균의 세포벽 물질로 인한 것으로 추정된다(25,28).
그 결과 LPpnu는 Lab. rhamnosus GG(LRgg)보다 프로바이오틱 효과가 더 뛰어났으며, LMpnu 또한 LRgg와 거의 유사한 수준의 효능을 나타냈다. LPpnu와 LMpnu는 모두 내산, 내담즙성, 장 부착능, 열 안정성의 프로바이오틱의 기본 특성을 가지고 있었으며, 특히 LPpnu는 가장 높은 프로바이오틱 효과를 나타냈다.
결론적으로 김치에서 분리한 LPpnu, LMpnu는 모두 프로바이오틱의 기본 특성을 가지고 있으며, 특히 LPpnu는 내산, 내담즙성, 장 부착능, 열 안정성, 항산화 및 항암 효능에서 높은 효능을 나타내어 체내에 도움을 줄 수 있는 프로바이오틱으로서 이용 가능성이 충분하다고 판단된다. 김치는 한국인이 계속해서 즐겨 먹어왔던 발효식품으로 이로부터 분리한 유산균은 우수한 프로바이오틱 균주로 세계적으로 인정되어야 한다.
05), 이는 본 연구에서 사용한 LPpnu와 LMpnu가 식물성 유산균으로 김치와 같은 산성의 열악한 조건 속에서 우점종을 차지하는 우수한 생존력을 가졌기 때문으로 사료된다. 그중 가장 높은 생존율을 나타낸 유산균은 LPpnu로 프로바이오틱스로 섭취하였을 때 위산 환경에서 생존할 가능성이 가장 높을 것으로 판단된다. 높은 산성 조건에서도 생존 가능한 것으로 알려진 Lab.
김치 유산균 농도를 5.0×106 CFU/mL로 처리하였을 때 LPpnu, LMpnu는 각각 20.4±3.5, 12.2±2.8%의 암세포 성장 억제 효과를 보여, 11.7±4.0%의 억제 효과를 나타낸 대조군 LRgg와 비교했을 때 LPpnu가 그중 가장 큰 암세포 성장 억제 효과를 가진 것으로 나타났다.
0%)의 순으로 나타났다. 따라서 LPpnu가 가장 큰 DPPH radical 소거능을 가짐으로써 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다. Hydroxyl radical 소거 효과 측정 결과(Fig.
김치는 β-sitosterol, isothiocyanate와 같은 김치 내 활성성분이나 부재료뿐만 아니라 김치 유산균이 건강 기능성을 나타낸다고 밝혀졌는데, 특히 김치 유산균은 균체 중 peptidoglycan 또는 muramyl dipeptide와 같은 세포벽 성분이 항암 효능을 나타내는 것으로 보고되고 있다(1). 따라서 본 연구에서 김치 유산균 중 우점종으로 나타났던 LPpnu 및 LMpnu는 암세포의 생장을 억제하고 apoptosis를 유도함으로써 김치의 항암 활성에 또한 기여한 것으로 판단된다.
또한 5.0×106 CFU/mL 처리군과 1.0×107 CFU/mL 처리군 모두에서 LPpnu군이 DPPH radical 소거 효과가 각각 57.4±4.6%와 71.1±2.9%로 가장 높게 나타났으며, 다음으로 LRgg군(47.0±3.2%, 64.6±5.0%), LMpnu군(42.4±4.8%, 57.2±3.0%)의 순으로 나타났다.
LPpnu와 LMpnu는 모두 내산, 내담즙성, 장 부착능, 열 안정성의 프로바이오틱의 기본 특성을 가지고 있었으며, 특히 LPpnu는 가장 높은 프로바이오틱 효과를 나타냈다. 또한 LMpnu 및 LRgg와 비교했을 때 LPpnu는 DPPH radical과 hydroxyl radical 소거능 측정에서 더 높은 항산화능을 보였고, Bcl-2 유전자 발현억제와 Bax 유전자 발현 증가를 통해 apoptosis를 유도함으로써 HT-29 human colon cancer cell에서 높은 암세포 성장 저해 효과를 나타냈다. 이를 통해 김치유래 LPpnu와 LMpnu는 프로바이오틱으로서 이용 가능성이 충분하다고 판단되며, 특히 LPpnu는 항산화 및 항암 활성에 뛰어난 효능을 나타내었기에 중요한 프로바이오틱 균주라고 하겠다.
7). 반면 Bcl-2 유전자 발현에서는 control군과 비교했을 때 유산균 처리군에서 유의적으로 감소하는 것을 확인했으며, 대조군인 LRgg군보다 LPpnu와 LMpnu군에서 더 높은 억제 효과를 나타냈다. 이를 통해 김치 유산균 LPpnu와 LMpnu 중 특히 LPpnu는 Bax 발현을 증가시키고 Bcl-2의 발현을 억제시켜 HT-29 대장암세포의 apoptosis를 유도하여 암세포의 성장을 억제하는 효과를 나타내었다고 하겠다.
1). 반응 1시간 후 생균수를 측정하여 반응 전과 비교한 결과 3가지 균주 모두 97% 이상의 높은 생존율을 나타내었다. 반응 2시간 후 LPpnu는 98.
반응 2시간 후 LPpnu는 98.0±1.8%, LMpnu는 96.3±0.7%, LRgg는 94.0±2.9%의 생존율을 보였으며, 반응 3시간 후 LPpnu는 95.6±1.7%, LMpnu는 94.3±1.8%, LRgg는 87.3±2.0%의 생존율을 보였다.
본 실험 결과 55°C에서 2시간 정치 후 대조구인 LRgg는 65.6±6.6%만이 생존하였으나, LPpnu는 71.2±4.1%, LMpnu는 63.0±3.9%가 잔존하였다.
본 연구에서 HT-29 세포에 대한 부착능은 대조구 LRgg에서는 81.5±3.1%로 나타났고, LPpnu는 74.0±4.0%, LMpnu는 66.6±3.8%로 나타났다.
이를 통해 균주 간 통계적인 유의성은 관찰되지 않았지만, LPpnu가 LRgg와 LMpnu보다 높은 열 안전성을 가지고 있는 것을 확인하였다(P>0.05).
반면 Bcl-2 유전자 발현에서는 control군과 비교했을 때 유산균 처리군에서 유의적으로 감소하는 것을 확인했으며, 대조군인 LRgg군보다 LPpnu와 LMpnu군에서 더 높은 억제 효과를 나타냈다. 이를 통해 김치 유산균 LPpnu와 LMpnu 중 특히 LPpnu는 Bax 발현을 증가시키고 Bcl-2의 발현을 억제시켜 HT-29 대장암세포의 apoptosis를 유도하여 암세포의 성장을 억제하는 효과를 나타내었다고 하겠다.
또한 LMpnu 및 LRgg와 비교했을 때 LPpnu는 DPPH radical과 hydroxyl radical 소거능 측정에서 더 높은 항산화능을 보였고, Bcl-2 유전자 발현억제와 Bax 유전자 발현 증가를 통해 apoptosis를 유도함으로써 HT-29 human colon cancer cell에서 높은 암세포 성장 저해 효과를 나타냈다. 이를 통해 김치유래 LPpnu와 LMpnu는 프로바이오틱으로서 이용 가능성이 충분하다고 판단되며, 특히 LPpnu는 항산화 및 항암 활성에 뛰어난 효능을 나타내었기에 중요한 프로바이오틱 균주라고 하겠다.
인공 담즙에 대한 내성 측정 결과(Fig. 2) 반응 후 2시간까지는 각 균주들 간에 큰 차이를 보이지 않았으나, 반응 4시간 후 LPpnu와 LMpnu가 LRgg보다 더 높은 생존율을 나타냈으며, 반응 6시간 후에는 LMpnu와 LPpnu가 초기 균수에 비해 60.4±2.1%, 56.5±2.6%가 생존하여 인공 담즙에 대해 LRgg(45.9±2.4%)보다 높은 내성을 보였다.
특히 1.0×107 CFU/mL 처리군에서는 LPpnu가 37.7±2.1%로 유의적으로 가장 높은 소거능을 나타냈고, LRgg가 32.5±1.5%, LMpnu가 31.6±0.4%의 hydroxyl radical 소거능을 나타냈다(P<0.05).
후속연구
김치는 한국인이 계속해서 즐겨 먹어왔던 발효식품으로 이로부터 분리한 유산균은 우수한 프로바이오틱 균주로 세계적으로 인정되어야 한다. 또한 김치와 함께 이들이 섭취되면 대장건강에 도움을 주리라 생각되며, 이에 대한 후속 연구가 지속되어야 할 것으로 생각된다.
본 연구 결과를 종합해 볼 때 김치에서 분리한 LPpnu 및 LMpnu 균주가 인공위액에서 생존이 가능하고 인공담즙에서도 내성을 가지는 것으로 보아 이들은 장내환경에 생존하기 적합한 균주로 프로바이오틱으로써 이용 가능할 것으로 판단된다. 또한 위산에 강한 내성을 갖는 LPpnu 균주와 담즙산에 강한 내성을 갖는 LMpnu를 혼합하여 이용할 경우 위산뿐만 아니라 담즙산 환경 모두에 강한 내성을 가질 수 있을 것으로 기대된다.
담즙산은 지질로 구성된 미생물의 세포막에 영향을 주어 미생물의 생장을 억제하는데, Lactobacillus를 포함한 많은 종의 유산균에서는 담즙산염 가수분해효소를 생성하여 담즙산을 가수분해하고 이 같은 억제작용을 감소시킨다(23). 본 연구 결과를 종합해 볼 때 김치에서 분리한 LPpnu 및 LMpnu 균주가 인공위액에서 생존이 가능하고 인공담즙에서도 내성을 가지는 것으로 보아 이들은 장내환경에 생존하기 적합한 균주로 프로바이오틱으로써 이용 가능할 것으로 판단된다. 또한 위산에 강한 내성을 갖는 LPpnu 균주와 담즙산에 강한 내성을 갖는 LMpnu를 혼합하여 이용할 경우 위산뿐만 아니라 담즙산 환경 모두에 강한 내성을 가질 수 있을 것으로 기대된다.
plantarum은 높은 항산화 효과를 나타내는 것을 알 수 있다. 본 연구를 통해 항산화 효과가 뛰어난 LPpnu 및 LMpnu의 섭취는 체내 산화적 스트레스에 대항하여 활성산소의 축적을 막는 데 도움을 줄 것으로 여겨진다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
김치의 효능은 무엇이 있으며, 그 원인은 무엇인가?
김치는 십자화과 채소들이 유산균에 의해 발효된 건강식품이며 풍부한 비타민, 미네랄, 식이섬유 등이 함유된 한국의 대표적인 전통발효 식품으로 다양한 체내 생리활성 및 그 기능성이 연구, 보고되고 있다. 김치의 대표적인 건강 기능성으로는 항암, 항산화, 항당뇨, 항비만 활성 등이 있으며, 이는 김치 내 원재료들과 유산균의 발효에서 기인된다 하겠다(1,2). 일반적으로 김치 내 유산균은 107~9 CFU/g 수준의 높은 생균수를 유지하며, 대표적인 유산균으로는 Leuconostoc 속, Lactobacillus 속, Weissella 속 등이 있다(2).
김치에 유래한 우점유산균들은 어느정도의 효능을 가졌는가?
본 연구에서는 김치에서 분리한 우점유산균인 Lactobacillus plantarum KCCM 11352P(LPpnu)와 Leuconostoc mesenteroides KCCM 11353P(LMpnu)의 프로바이오틱 효과를 프로바이오틱 효과가 높기로 잘 알려진 Lactobacillus rhamnosus GG(LRgg)의 효능과 비교하여 확인하였다. 그 결과 LPpnu는 Lab. rhamnosus GG(LRgg)보다 프로바이오틱 효과가 더 뛰어났으며, LMpnu 또한 LRgg와 거의 유사한 수준의 효능을 나타냈다. LPpnu와 LMpnu는 모두 내산, 내담즙성, 장 부착능, 열 안정성의 프로바이오틱의 기본 특성을 가지고 있었으며, 특히 LPpnu는 가장 높은 프로바이오틱 효과를 나타냈다. 또한 LMpnu 및 LRgg와 비교했을 때 LPpnu는 DPPH radical과 hydroxyl radical 소거능 측정에서 더 높은 항산화능을 보였고, Bcl-2 유전자 발현억제와 Bax 유전자 발현 증가를 통해 apoptosis를 유도함으로써 HT-29 human colon cancer cell에서 높은 암세포 성장 저해 효과를 나타냈다. 이를 통해 김치유래 LPpnu와 LMpnu는 프로바이오틱으로서 이용 가능성이 충분하다고 판단되며, 특히 LPpnu는 항산화 및 항암 활성에 뛰어난 효능을 나타내었기에 중요한 프로바이오틱 균주라고 하겠다.
식물성 유산균은 어떤 강점을 지녔는가?
최근에는 이러한 김치 유산균의 항산화, 항암, 항돌연변이, 항비만 효과 및 면역기능 강화 등의 건강 기능성에 대한 과학적 입증들이 새롭게 시도되고 있다(1). 또한 김치와 같은 식물 원료의 발효 식품에서 분리된 식물성 유산균은 타 동물성 발효식품과 비교하여 풍부하지 않은 영양소와 기타 열악한 환경조건에서 생육하기 때문에 영양소를 분해 또는 섭취하는 능력이 높아 다양한 미생물 환경 속에서 경쟁적으로 우점종을 차지하는 우수한 생존력을 가지며, 특히 천연 항균물질 및 생리활성 물질의 생성능이 높은 것으로 알려져 있다(3). 또한 식물유래 유산균은 임상연구에서 변비 완화, 혈중 지질 및 간 기능을 증진시켜 동물유래 유산균보다 프로바이오틱 효과가 높음이 확인된 바 있다(4).
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