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[국내논문] 염산/에탄올로 유도된 급성 위염 동물모델에서 증숙시간에 따른 홍삼의 보호 효과
Protective effects of red ginseng according to steaming time on HCl/ethanol-induced acute gastritis 원문보기

Journal of applied biological chemistry, v.59 no.4, 2016년, pp.365 - 372  

이주영 (College of Korean Medicine, Daegu Haany University) ,  권오준 (Gyeongbuk Regional Industry Evaluation, Daegyeong Institute for Regional Program Evaluation) ,  노정숙 (Department of Food Science & Nutrition, Tongmyong University) ,  노성수 (College of Korean Medicine, Daegu Haany University)

초록
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본 연구에서는 150 mM HCl/60 % ethanol로 급성 위염을 유발한 마우스에서 증숙 시간에 따른 홍삼의 위염 보효 효과에 대해 살펴보고자 하였다. 백삼과 홍삼의 증숙 시간에 따른 성분을 분석한 결과 사포닌, total polyphenol과 total flavonoid의 총 함량이 증숙 시간에 따라 증가하였고 6시간 증숙한 홍삼에서 가장 높은 함량을 보였다. 또한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl와 2,2'-azinobis-3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid radical 소거능 실험을 통해 항산화 활성을 측정한 결과 RG 6에서 가장 높은 활성을 나타냈다. In vitro 실험 결과를 바탕으로 시료를 선택하였고 in vivo 실험을 진행하였다. 급성 위염 마우스 모델에 백삼과 6시간 증숙한 홍삼을 투여하였을 때, RG 6에서 위 점막 손상의 개선을 육안적으로 확인할 수 있었으며, 혈액에서 측정한 ROS 수치도 대조군에 비해 유의적인 감소를 보였다. 또한 염증성 사이토카인을 확인한 결과 대조군에 비해 RG6에서 감소하는 경향을 보였다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때 증숙 시간에 따른 홍삼은 급성 위염 유발 마우스 모델에서 위염 보호 효과가 있는 것으로 사료된다.

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

The objective of the present study was to evaluate the protective effect of red ginseng (RG) according to steaming time on 150 mM HCl/60 % ethanol induced gastric ulcer models in mice. The sample was divided into 3 groups-G (dried ginseng), RG 4 (steamed 4 h and dried ginseng), RG 6 (steamed 6 h and...

Keyword

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제안 방법

  • 백삼(G)은 절단하지 않고 잔뿌리가 떨어지지 않도록 밀폐제습식 건조기(ACE Machinery, Seoul, Korea)를 사용하여 수분함량 15 % 미만으로 건조하였고, 홍삼은 증숙과 무압식 스팀증숙기(ACE Machinery)를 사용하여 증숙온도 90 °C에서 물로 4시간(RG 4), 6시간(RG 6)씩 증숙한 후 건조기에서 건조하였다.
  • 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2 °C, 습도 50±5 %, 명암주기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다.
  • 백삼과 증숙 홍삼 시료들의 추출은 분쇄기로 분쇄한 다음 시료 5 g에 증류수 50 mL를 넣고, 100 °C에서 3시간씩 2회 반복 추출하였다.
  • 그러나 증숙 시간을 달리한 홍삼의 위염 보호 효과에 대한 연구가 미비하다. 이에 본 연구에서는 증숙 시간에 따른 홍삼의 항산화능 변화를 측정하고 급성 위염 동물 모델을 이용하여 산화적 스트레스 소거능, 웨스턴 분석, 조직학적 관찰 등을 통해 홍삼의 위염 보호 효과를 평가하였다.
  • 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2 °C, 습도 50±5 %, 명암주기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다. 사료는 고형사료(조단백질 22.1 % 이상, 조지방 8.0 % 이하, 조섬유 5.0 % 이하, 조회분 8.0 % 이하, 칼슘 0.6 % 이상, 인 0.4 % 이상, 항생제 무첨가, Samyang corporation, Seoul, Korea)와 물을 충분히 공급하였다.
  • 각시료를 농도별로 희석한 용액 100 μL와 0.2 mM DPPH 용액 100 μL를 혼합하여 37 °C에서 30분간 암소 상태에서 반응시켰다.
  • 핵을 얻기 위해 10 % NP-40가 더해진 buffer A에 두 번 헹구고 100 μL의 buffer C (50 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazyl] ethanesulfonic acid (pH 7.9), 50 mM KCl, 0.3 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 10 % glycerol)를 첨가해 재부유 시킨 뒤 10분마다 vortex을 3번 하였다.
  • 각 샘플을 pH 7.4 rhodamine buffer와 5 mM DHR123과 섞은 후 5분간 37 °C에서 흔들어 준 후 5분씩 35분간 emission 파장 535 nm와 excitation 파장 480 nm를 이용하여 30분간 측정한 산출 값을 계산하였다.
  • 혈청과 25 mM 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 혼합한 후, 형광 광도계를 이용하여 0분부터 매 5분씩 35분간 emission 파장 530 nm와 excitation 파장 485 nm를 이용하여 30분간 측정한 산출값을 계산하였다.
  • 희석된 용액 900 μL에 시료 100 μL를 가하여 1분 동안 방치한 후 흡광도를 측정하였다.
  • 급성 위염 유발 동물 실험

    실험동물은 군당 6마리씩 5그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. 급성 위염 유발 전 24시간 동안 절식하였으며 물은 제공하였다.

  • 급성 위염 유발 전 24시간 동안 절식하였으며 물은 제공하였다. 실험 당일, 정상군(Nor)에는 아무런 처치를 하지 않았으며, 대조군(Con)에는 증류수를 경구투여하였고, 양성대조군(SC)에는 sucralfate (Sigma Aldrich)를 10 mg/kg body weight의 농도로 경구투여 하였다. G과 RG 6는 각각 100 mg/kg body weight 로 경구투여 하였다.
  • 적출한 위 조직을 핀으로 고정한 다음, 광학 디지털 카메라 (DSC-HX50V, Sony, Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였다. 손상된 위점막 측정은 I-Solution lite (Innerview Co.
  • 적출한 위 조직을 핀으로 고정한 다음, 광학 디지털 카메라 (DSC-HX50V, Sony, Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였다. 손상된 위점막 측정은 I-Solution lite (Innerview Co., Gyeonggi, Korea) 프로그램을 이용하여 실제 손상 부위의 면적을 측정한 후, 위 전체 면적과 비교하여 정상군에 대한 손상 비율로 표시하였다.
  • 위 조직의 세포질을 얻기 위해 100 mM 2-amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris)-HCl (pH 7.4), 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 15 mM CaCl2, 1.5 M sucrose, 0.1 M dithiothreito (DTT), protease inhibitor cocktail을 첨가한 buffer A를 넣고 tissue grinder (BioSpec Product, Bartlesville, Oklahoma, USA)로 분쇄한 후 10 % NP-40 용액을 첨가하였다. 아이스 위에서 20분간 정치시킨 후 12,000 rpm으로 2분간 원심분리 (12,000 rpm, 20 min, 4 °C)하여 세포질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다.
  • 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody를 처리하여 4 °C에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체(PBS-T로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBS-T로 6분마다 5회 세척하였다.
  • 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody를 처리하여 4 °C에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체(PBS-T로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBS-T로 6분마다 5회 세척하였다. 그리고 enhanced chemiluminescence (GE Healthcare, Arlington Heights, IL, USA)에 노출시킨 후, Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co. Ltd., Seoul, Korea)에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 band를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan)를 사용하여 정량하였다.
  • DPPH 및 ABTS radical 소거능을 이용하여 항산화 효능을 측정하였다. DPPH radical 소거능 측정 결과, G의 IC50 값은 1698.

대상 데이터

  • 시료제조에 사용된 약재는 경기도 여주시 장호원읍에서 재배된 6년근 수삼(Panax ginseng C.A. Meyer)으로 2013년 10월에 직접 수매하여 사용하였다. 백삼(G)은 절단하지 않고 잔뿌리가 떨어지지 않도록 밀폐제습식 건조기(ACE Machinery, Seoul, Korea)를 사용하여 수분함량 15 % 미만으로 건조하였고, 홍삼은 증숙과 무압식 스팀증숙기(ACE Machinery)를 사용하여 증숙온도 90 °C에서 물로 4시간(RG 4), 6시간(RG 6)씩 증숙한 후 건조기에서 건조하였다.
  • 본 실험에 사용한 시료는 대전대학교 한의학과 본초학교실 서영배 교수님께 제공받아 사용하였고 성분분석을 수행하였다. 성분분석 결과는 G는 총 사포닌 함량이 1.
  • 모든 실험은 대구한의대학교 동물실험 윤리위원회의 승인 (DHU2016-021)을 얻어 시행하였으며 동물관리 규정을 준수하였다. ICR mice계의 6주령 수컷을 오리엔트(Gyeonggi, Korea) 에서 구입하여 1주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2 °C, 습도 50±5 %, 명암주기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다.
  • Hatano 등(1989)의 방법으로 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거능 활성을 측정하였다. DPPH는 Sigma-Aldrich에서 구매하였고, 양성대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였다. 각시료를 농도별로 희석한 용액 100 μL와 0.
  • Martins 등(2014)의 방법으로 2,2'-azinobis-3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) radical 소거능 활성을 이용하여 항산화 효과를 측정하였다. 실험에 사용된 ABTS와 potassium persulfate는 Sigma-Aldrich에서 구매하였고, 양성대조군으로 Lascorbic acid를 사용하였다. 7 mM ABTS 용액과 2.

데이터처리

  • Student's paired t-test을 사용하여 백삼과 다른 군 간의 통계적 유의성을 측정하였다(p <0.05).
  • In vitro의 수치는 평균과 표준오차로, in vivo의 수치는 평균과 표준편차로 표시하였으며, SPSS (Version 22.0, IBM, Armonk, NY, USA)을 사용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시한 후 Tukey Multiple Comparison test로 사후검증을 실시하여 군 간의 유의성을 측정하였다. 각 군의 평균 차이에 대한 통계적 유의성을 5 % 수준에서 검증하였다.
  • 0, IBM, Armonk, NY, USA)을 사용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시한 후 Tukey Multiple Comparison test로 사후검증을 실시하여 군 간의 유의성을 측정하였다. 각 군의 평균 차이에 대한 통계적 유의성을 5 % 수준에서 검증하였다. Student's paired t-test을 사용하여 백삼과 다른 군 간의 통계적 유의성을 측정하였다(p <0.
  • Nor, normal mice; Con, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of distilled water; G, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 100 mg/kg ginseng; RG 6, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 100 mg/kg red ginseng by steamed 6 h; SC, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 10 mg/kg sucralfate. a~cDifferent letters show a significantly difference at p <0.05 as determined by one-way ANOVA followed by Turkey multiple comparison test. *The Student’s paired t-test was carried out to compare with the Con group (p <0.
  • Nor, normal mice; Con, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of distilled water; G, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 100 mg/kg ginseng; RG 6, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 100 mg/kg red ginseng by steamed 6 h; SC, HCl/ethanol-induced acute gastritic mice with the administration of 10 mg/kg sucralfate. a~cDifferent letters show a significantly difference at p <0.05 as determined by one-way ANOVA followed by Turkey multiple comparison test. *The Student’s paired t-test was carried out to compare with the Con group (p <0.

이론/모형

  • ONOO−는 Kooy 등(1994)의 연구를 이용하여 측정하였다.
  • Martins 등(2014)의 방법으로 2,2'-azinobis-3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) radical 소거능 활성을 이용하여 항산화 효과를 측정하였다.
  • 페놀성 물질이 phosphomolybic acid와 반응하여 청색을 나타내는 Folin-Denis 법(velioglu 1998)을 이용하여 측정하였다. 각 시료 25 μL (1 mg/mL)과 10 % Folin-Ciocalteau’s phenol reagent 500 μL를 혼합하여 실온에서 5분간 반응시킨다.
  • Total flavonoid의 함량 측정은 Davis법을 변형한 방법(Lister 등, 1994)에 따라 측정하였다. 추출한 시료 300 μL에 diethylene glycol 600 μL를 잘 섞어준 후, 이 혼합물에 1 N NaOH 6 μL를 가하여 37 °C에서 1시간 동안 방치한 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
  • Hatano 등(1989)의 방법으로 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거능 활성을 측정하였다. DPPH는 Sigma-Aldrich에서 구매하였고, 양성대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였다.
  • 심장에서 채혈한 혈액을 4,000 rpm, 10분 동안 원심 분리하여 혈청을 얻었다. ROS 측정은 Ali 등(1992)의 방법을 이용하여 시행하였다. 혈청과 25 mM 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 혼합한 후, 형광 광도계를 이용하여 0분부터 매 5분씩 35분간 emission 파장 530 nm와 excitation 파장 485 nm를 이용하여 30분간 측정한 산출값을 계산하였다.
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질의응답

핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
활성산소종으로 생겨난 산화적 스트레스는 어떻게 방어될 수 있는가? ROS의 축적으로 인해 위 점막의 세포손상이 시작되며 염증반응의 전사인자인 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)를 발현시켜 염증반응을 일어나게 한다(Hogg 등, 1992; HernandezMunoz 등, 2000; Kojima 등, 2000; Guo 등, 2006; Shen과 Tergaonkar 2009). ROS의 형성으로 인한 산화적 스트레스는 생체 내의 방어기작인 항산화 효소에 의하여 억제되지만 폴리페놀 화합물과 비타민 E, C, 플라보노이드 등과 같은 식이 항산화 성분의 섭취에 의해서도 효과적으로 방어될 수 있다(La Casa 등, 2000).
위염이란 무엇인가? 위염은 위 점막에 생기는 염증성 질환을 통틀어 이르는 용어로, 한번 생긴 위염은 만성으로 발전하기 쉽다. 위벽은 4개의 층으로 이루어져 있는데, 첫 번째 층인 위 점막만 손상된 경우를 보통 위염이라고 하고, 두 번째 층 이상이 손상되어 점막하층까지 드러난 경우를 위궤양이라고 한다(Banks 1986).
활성산소종이 과잉 발생하면 생체에 어떤 영향을 주는가? 인체의 생명유지에 필요한 에너지를 생성하는 호흡과정에서 체내로 공급된 산소 중 일부는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 으로 전환된다(Droge 2001). 생체는 활성산소종으로부터 세포를 보호하기 위한 항산화 시스템을 가지고 있어 정상적인 상태에 서는 산화 작용이 해로운 영향을 주지 않지만 활성산소종이 과잉 생산될 경우, 산화적 스트레스가 발생하며 이로 인해 체내 항산화 체계의 균형이 깨져 여러 질환이 발병하는 것으로 알려져 있다(Halliwell 등, 1995). ROS의 축적으로 인해 위 점막의 세포손상이 시작되며 염증반응의 전사인자인 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)를 발현시켜 염증반응을 일어나게 한다(Hogg 등, 1992; HernandezMunoz 등, 2000; Kojima 등, 2000; Guo 등, 2006; Shen과 Tergaonkar 2009).
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