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문제 정의
- 본 연구에서는 유용한 기능성을 지닌 최적의 유채싹 선발을 위해 종자를 10일 동안 발아시키면서 일반성분, 항산화능 및 멜라토닌함량 변화를 분석하였다. 종자의 수분함량(3.
- 또한 주요 기능성인 항산화능을 분석한 연구 결과들도 대부분 특정 기간 발아시킨 싹에 대한 것이거나 항산화 분석법의 특성을 고려하지 않은 경우가 많았다. 이에 본 연구에서는 유채종자의 발아동안 일반성분의 변화, 다양한 항산화 분석법을 통한 항산화능 비교및 멜라토닌 함량 변화를 분석함으로서 유채싹의 기능성을 최대로 이용할 수 있는 발아시기를 결정하고자 하였다.
가설 설정
- 1)Means±SD with different letters in the column are significantly different at p<0.05 (n=30 in length, n=3 in approximate composition).
제안 방법
- 1℃ 온도의 암소에서 10일 동안 발아시켰다. 2일 간격으로 싹을 채취하고 30개에 대한 길이를 측정하여 생육정도를 확인하였으며, 종자와 각 발아시기별 싹은 동결건조 (FDU-2200, Eyela, Tokyo, Japan)한 후 액체질소에서 분쇄 하여 분말을 조제하였다.
- 대조구는 시료용액 대신 동량의 메탄올을 사용하였으며 ABTS 라디칼 소거능은 시료 농도별 흡광도의 감소 퍼센트[Inhibition(%)=(1-ODsample/ODcontrol) ×100]를 계산한 후 표준물질로 trolox를 이용해 표준곡선을 작성하여 trolox 당량으로 나타내었다.
- 대조구는 시료용액 대신 동량의 메탄올을 사용하였으며 DPPH 라디칼 소거능은 시료 농도별 흡광도의 감소 퍼센트[Inhibition(%)=(1-ODsample/ODcontrol)×100]를 계산한 후 표준물질로 trolox를 이용한 표준곡선을 작성 하여 trolox 당량(mmol/kg)으로 나타내었다.
- 유채종자의 발아를 위해 먼저 100 ppm 차아염소산 나트륨(NaOCl) 용액에 종자를 30분간 침지하여 소독시킨 다음, 수돗물로 세척 후 상온의 멸균수에 6시간 침지시켰다. 이후 종자를 발아용기에 파종하여 물을 매일 갈아주면서 24±0.
- Fe(III) 이온을 Fe(II) 이온으로 환원시키는 능력(ferric reducing antioxidant power, FRAP)을 측정하는 FRAP법은 Kim의 방법(29)에 준하여 실시하였다. 이를 위해 먼저 300 mM 아세트산염 완충액(pH 3.6), 10 mM TPTZ 용액(10 mM 염산용액에 녹임) 및 20 mM FeCl3 용액을 10:1:1(v/v) 비율로 섞어 FRAP 용액을 조제하였다. 그 다음 메탄올로 희석 시켜 준비한 시료용액 50 μL에 37℃로 미리 가온한 FRAP 용액 950 μL를 혼합하고 30분 간 암소에서 반응시킨 후 593 nm에서의 흡광도 측정하였으며 대조구는 시료용액 대신 동량의 메탄올을 사용하였다.
- 이에 생리적 조건과 유사한 pH 7.4, 37℃ 수용액 조건에서 지질산화와 관련된 퍼록시(ROO·) 라디칼에 대한 소거능을 측정하는 ORAC법(49)을 이용해 항산화능을 추가로 평가하였다.
- 항산화능 평가에 있어 총 페놀함량 분석의 문제점, 그리고 혼합 시료에서의 항산화능이 분석법에 따라 차이가 있음을 고려하여 Prior 등(47)은 항산화능 분석 시 한 가지 방법이 아니라 다른 기작을 가진 여러 분석법들을 적용하여 평가할 필요가 있다고 하였다. 이에 항산화능 분석에 널리 쓰이는 DPPH법, ABTS법, FRAP법 및 ORAC법을 이용해 발아동안 항산화능 변화를 분석하였으며 그 결과는 Fig. 2와 같았다.
- 2 mL의 p-nitrophenyl phosphate 용액을 첨가하여 500 rpm의 orbital shaker에서 20분간 반응시킨 후 1 N NaOH 용액 50 μL를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이후 microplate reader를 이용해 605 nm를 기준파장으로 하여 405 nm에서의 흡광도를 측정한 후 표준 멜라토닌을 이용한 표준곡선으로부터 시료의 멜라토닌 함량을 산출하였다.
- 퍼록시 라디칼(ROO·) 소거능은 Huang 등(30)의 oxygen radical absorbance capacity(ORAC)법을 일부 변형시켜 분석하였다.
- 한편, 기존에 알려진 페놀화합물이나 항산화성분 외에 유채싹의 새로운 기능성 성분으로 멜라토닌함량을 분석하였다. 멜라토닌은 1995년 식물체에서 처음 발견된 이래 많은 식물체에서 수 ng/kg에서 수십 mg/kg 수준으로 존재하는 것으로 확인되었으며 식물에서의 성장조절자, 형태형성인자, 신호분자로 작용하며 스트레스 완화, 병충해 방어, 노화 지연과도 관련된다고 추정되고 있다(24).
대상 데이터
- Folin-Ciocalteu's phenol 시약, gallic acid, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH·), 2,2'-azinobis(3-ethylbenzo thiazoline-6-sulfonic acid(ABTS), ferric 2,4,6-tripyridyl-s-triazine(TPTZ), ferrous sulfate heptahydrate(FeSO4·7H2O), ferric chloride hexahydrate(FeCl3·6H2O), 2,2'-azobis(2-amidino propane) dihydrochloride(AAPH), 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (trolox)는 Sigma-Aldrich 사(St. Louis, MO, USA)의 제품을, fluorescein은 Thermo Fisher Scientific 사(Waltham, MA, USA) 제품을 사용하였다.
- Louis, MO, USA)의 제품을, fluorescein은 Thermo Fisher Scientific 사(Waltham, MA, USA) 제품을 사용하였다. 멜라토닌 분석을 위한 ELISA 키트는 IBL International 사(Hamburg, Germany)의 제품이었으며 그 외 시약들은 분석 등급용을 구입하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 유채종자와 발아용기는 (주)아시아 종묘(Seoul, Korea)에서 구입하였다. Folin-Ciocalteu's phenol 시약, gallic acid, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH·), 2,2'-azinobis(3-ethylbenzo thiazoline-6-sulfonic acid(ABTS), ferric 2,4,6-tripyridyl-s-triazine(TPTZ), ferrous sulfate heptahydrate(FeSO4·7H2O), ferric chloride hexahydrate(FeCl3·6H2O), 2,2'-azobis(2-amidino propane) dihydrochloride(AAPH), 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (trolox)는 Sigma-Aldrich 사(St.
데이터처리
- 실험 결과는 IBM SPSS Statistics(18, IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 이용하여 one way ANOVA법으로 분산분석을 하였으며, p<0.05 수준에서의 조사항목 간 유의성을 검정하기 위해 Duncan의 다중검정법을 수행하였다.
- 일반성분 및 항산화능 분석은 3회, 멜라토닌 분석은 4회실시하였으며 그 결과는 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- Fe(III) 이온을 Fe(II) 이온으로 환원시키는 능력(ferric reducing antioxidant power, FRAP)을 측정하는 FRAP법은 Kim의 방법(29)에 준하여 실시하였다. 이를 위해 먼저 300 mM 아세트산염 완충액(pH 3.
- Kim의 방법(29)에 따라 시료의 ABTS 라디칼 소거능을 분석하였다. 먼저 7 mM의 ABTS 용액에 potassium persulfate를 2.
- 즉, 건조시킨 분말시료에 대해 수분은 105℃ 상압가열건조법, 조지방은 Soxhlet 추출법, 조단백질은 Kjeldahl 법, 조회분은 550℃에서 직접 회화시켜 중량법으로 정량하였으며 탄수화물은 총 중량에서 이들 성분을 제한 값으로 산출하였다. 그리고 환원당은 Somogyi법, 조섬유는 변형 Henneberg-Stohmann법으로 정량하였다(29).
- 시료의 DPPH 라디칼 소거능 분석은 Kim의 방법(29)에 따라 실시하였다. 먼저, 100 mM DPPH 메탄올 용액을 조제한 후 사용 전에 517 nm에서의 흡광도가 1.
- 종자 및 발아싹의 수분, 조지방, 조단백질, 조회분, 탄수화물의 분석은 AOAC 표준분석법에 준하여 Kim의 방법 (29)에 따라 실시하였다. 즉, 건조시킨 분말시료에 대해 수분은 105℃ 상압가열건조법, 조지방은 Soxhlet 추출법, 조단백질은 Kjeldahl 법, 조회분은 550℃에서 직접 회화시켜 중량법으로 정량하였으며 탄수화물은 총 중량에서 이들 성분을 제한 값으로 산출하였다.
- 종자 및 발아싹의 수분, 조지방, 조단백질, 조회분, 탄수화물의 분석은 AOAC 표준분석법에 준하여 Kim의 방법 (29)에 따라 실시하였다. 즉, 건조시킨 분말시료에 대해 수분은 105℃ 상압가열건조법, 조지방은 Soxhlet 추출법, 조단백질은 Kjeldahl 법, 조회분은 550℃에서 직접 회화시켜 중량법으로 정량하였으며 탄수화물은 총 중량에서 이들 성분을 제한 값으로 산출하였다. 그리고 환원당은 Somogyi법, 조섬유는 변형 Henneberg-Stohmann법으로 정량하였다(29).
- 총 페놀 함량 분석 시 얻은 메탄올 추출물 0.6 mL를 진공 농축시킨 다음 증류수 0.6 mL을 넣고 30초간 votexing하여 재용해시켜 시료용액으로 사용하였으며, 멜라토닌 함량분석은 ELISA kit의 방법(19)에 준하여 실시하였다. 즉, 재용 해시킨 시료용액 0.
- 총 페놀함량을 분석하기 위하여 분말시료에 메탄올을 첨가(1:10, w/v)한 후 2시간 동안 vortexing한 다음 4℃, 10,000×g 조건에서 10분간 원심분리(5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)하였으며 이 때 얻어진 상등액을 시료용액으로 사용하였으며 총 페놀함량은 Kim의 방법(29)에 따라 분석하였다.
성능/효과
- 10일의 발아동안 싹의 길이가 거의 직선적으로 증가하여 10일에 평균 8.28 cm에 도달하였고 8일의 발아율은 81.3%에 달해 종자의 정상적인 발아와 싹의 생육이 이루어졌음을 알 수 있었다(Table 1). 일반성분의 경우(Table 1), 종자에서 3.
- 4, 37℃ 수용액 조건에서 지질산화와 관련된 퍼록시(ROO·) 라디칼에 대한 소거능을 측정하는 ORAC법(49)을 이용해 항산화능을 추가로 평가하였다. 그 결과(Fig. 2), 종자에서 65.1 mmol/kg이었던 항산화능이 발아에 따라 증가하여 4일에 최고값인 116.7 mmol/kg에 도달하였으며 이후 다소 감소하였다. 이러한 차이 중의 하나는 앞의 3가지 방법들이 항산화물질의 전자전달능을 평가하는 것과는 달리 ORAC법에서는 수소원자전달능을 평가하는 것이기 때문으로 여겨지며 Apak 등(49)도 ORAC법의 결과가 전자전달능 평가법의 결과와 차이가 있을 수 있다고 하였다.
- 3 mmol/kg) 에 도달하였다. 이상 3가지 방법의 결과로 볼 때, DPPH 라디칼 소거능은 6일, ABTS 라디칼 소거능 및 Fe(III) 이온 환원능은 10일 싹에서 높았다. 즉, 발아 6일까지 항산화능이 증가하다가 8일에 다소 감소하는 경향은 3가지 방법 모두에서 유사하였고 10일 싹의 경우만 차이를 보였다.
- 이상의 결과로부터 발아시킨 싹의 섭취는 항산화능과 멜라토닌 함량 측면에서 종자보다 유용함을 알 수 있었다. 분석방법에 따라 차이는 다소 있지만 4일 이상 발아시킨 싹에서 전반적으로 항산화능이 높아 이 싹들은 항산화 식품으로서의 가치가 있다고 판단되며 실지 시판 십자화과 싹도 대개 4일간 발아시킨 것이다(28).
- 93 μg/kg)을 나타내었다. 이상의 결과로부터 항산화소재로서는 4~10일까지의 발아싹들을 이용될 수 있다고 생각된다. 그러나 멜라토닌 함량, 환원당, 조섬유와 같은 추가적인 기능성분을 함께 고려하면 6일 발아싹이 기능성 싹으로서 적합하다고 판단된다.
- 이에 유채종자의 발아기간별 싹에 대한 분석을 실시한 결과(Fig. 3), 종자에서 0.85 μg/kg이었던 멜라토닌함량은 발아에 따라 증가해 6일에 최고값(14.93μg/kg)에 도달하였다.
- 항산화능(trolox equivalent, mmol/kg)은 발아에 따라 증가하여 4~10일에 좀 더 높은 값을 나타내었는데 분석법에 따라 최고값을 보이는 시기는 다소 차이가 있었다. 즉, DPPH 라디칼 소거능은 6일(55.9), ABTS 라디칼 소거능 (46.3)과 Fe(III)이온 환원능(125.3)은 10일, 퍼록시 라디칼소거능은 4일(116.7)에서 최고값을 보였다. 종자에서 0.
- 이상 3가지 방법의 결과로 볼 때, DPPH 라디칼 소거능은 6일, ABTS 라디칼 소거능 및 Fe(III) 이온 환원능은 10일 싹에서 높았다. 즉, 발아 6일까지 항산화능이 증가하다가 8일에 다소 감소하는 경향은 3가지 방법 모두에서 유사하였고 10일 싹의 경우만 차이를 보였다. 이러한 차이는 DPPH 라디칼의 환원전위가 ABTS 라디칼과 Fe(III)이온의 환원전위보다 낮아 전자전달능이 약한 물질은 DPPH법에 의해 분석되지 않았기 때문으로 추정되며 (48), 10일 싹의 경우 항산화물질의 양은 증가하였지만 전자 전달능이 강한 항산화물질은 오히려 감소하였을 것으로 생각할 수 있다.
- 12%로 높은 값을 나타내었다. 총 페놀함량(gallic acid equivalent)은 발아에 따라 증가하다가 8일에 최고값인 16.8 g/kg에 도달 하였다. 항산화능(trolox equivalent, mmol/kg)은 발아에 따라 증가하여 4~10일에 좀 더 높은 값을 나타내었는데 분석법에 따라 최고값을 보이는 시기는 다소 차이가 있었다.
- 이러한 차이 중의 하나는 앞의 3가지 방법들이 항산화물질의 전자전달능을 평가하는 것과는 달리 ORAC법에서는 수소원자전달능을 평가하는 것이기 때문으로 여겨지며 Apak 등(49)도 ORAC법의 결과가 전자전달능 평가법의 결과와 차이가 있을 수 있다고 하였다. 한편, 전자전달능 분석법에서 우수하였던 6일 싹도 4일 싹 대비 87% 수준(102.1 mmol/kg)의 높은 퍼록시 라디칼 소거능을 나타내었다.
- 이러한 차이는 DPPH 라디칼의 환원전위가 ABTS 라디칼과 Fe(III)이온의 환원전위보다 낮아 전자전달능이 약한 물질은 DPPH법에 의해 분석되지 않았기 때문으로 추정되며 (48), 10일 싹의 경우 항산화물질의 양은 증가하였지만 전자 전달능이 강한 항산화물질은 오히려 감소하였을 것으로 생각할 수 있다. 한편, 총 페놀함량도 항산화능과 관련이 되지만 앞서 언급한 바와 같이 시약의 강한 산화특성으로 인해 일반적인 항산화물질로 인식되지 않는 성분들도 분석되기에(46) Folin-Ciocalteu법 보다는 이들 3가지 방법에 의한 결과가 기능성으로서의 항산화능 평가에 더 적합하다고 판단된다. DPPH, ABTS, FRAP법의 경우, 사용한 라디칼이나 시약들은 생체나 식품에 존재하는 것이 아니어서 생체나 식품에서의 항산화능과는 차이가 있을 수 있다.
- 6 mmol/kg에 도달하였다. 한편, 항산화제로부터 수소원자전달의 가능성을 완전히 배제하고 순수하게 전자전달능만을 평가하기 위하여 Fe(III)이온 환원능을 평가하는 FRAP법(46,47)을 실시한 결과, 앞의 두 방법에서 얻어진 결과와 마찬가지로 발아 2일부터 항산화능이 크게 증가하여 6일에 115.9 mmol/kg에 도달하였고 8일에 다소 감소한 후 10일에서는 ABTS 라디칼 소거능과 마찬가지로 최고값(125.3 mmol/kg) 에 도달하였다. 이상 3가지 방법의 결과로 볼 때, DPPH 라디칼 소거능은 6일, ABTS 라디칼 소거능 및 Fe(III) 이온 환원능은 10일 싹에서 높았다.
후속연구
- 93μg/kg)에 도달하였다. 그리고 멜라토닌의 강한 항산화능(21,22)을 고려할 때 발아초기 항산화능의 증가에도 기여할 것으로 판단된다. 그러나 10일에는 8.
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