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문제 정의
- 더하여 잔대의 에틸아세테이트 추출물을 인간의 간세포주인 HepG2 세포에 처리하였을 때 항산화 유전자 발현이 증가하였고(5), HepG2 세포와 고지방 식이를 섭취한 비만 마우스에서 콜레스테롤 합성 및 대사 관련 유전자와 단백질 발현에 영향을 미쳐 고지혈증 개선 효과가 있었으며 항비만 효과도 있었다(6). 그러나 잔대 추출물, 분획물 및 잔대의 주요 물질이 산화적 스트레스 조건에서 항산화 효과에 의해 뇌신경세포에서 발생하는 ROS를 소거함으로써 뇌신경세포 보호 효과가 있다는 연구보고는 전무하여 본 연구에서 진행하였고 이들 결과는 뇌질환 개선을 위한 식･의약 소재 개발을 위한 기초 자료를 제공하고자 한다.
- Chung 등(1)은 곤드레, 누룩치 그리고 산마늘 추출물이 항산화 활성에 의해 산화적 스트레스로부터 뇌신경세포를 보호할 수 있을 것으로 추정하였다. 따라서 본 연구에서도 산화적 스트레스 조건에서 AT의 항산화 효과에 의해 SKN-SH 세포를 보호할 수 있는지 알아보았다.
가설 설정
- Cell viability (A, B), DPPH radical scavenger activity (C), and intracellular reactive oxygen species (ROS) in SK-N-SH cells (D) of extract from Adenophora triphylla (AT). A: The cells were exposed with AT of the indicated concentrations for 24 h. C represent control cell (AT-untreated cells).
제안 방법
- cells/well로 조정하여 96-well plates에 세포를 깔아주고 24시간 동안 배양하여 MTT assay와 세포 내 ROS를 검출하기 위하여 사용하였다. 12시간 기아상태를 유지시킨 후 시료인 AT, AT-EA, AT-HE, AT-AQ, AT-CH 또는 AT-BU를 우태아 혈청을 첨가하지 않은 성장배지로 희석하여 24시간 단독 처리하여 시료의 세포독성을 알아보았다. 산화적 스트레스에 대항하는 시료의 뇌신경세포 보호 효과 및 ROS 생성 억제능을 알아보기 위해 SK-N-SH 세포에 시료와 500 μM H2O2를 30분 간 SK-N-SH 세포에 동시에 처리하였다.
- MPLC를 이용하여 물질을 분리한 결과 14개의 subfraction(1~14)으로 분리되었고(결과 미제시), 그중에 6개의 subfraction(2, 4, 6, 8, 10 그리고 11)을 1H-NMR, 13CNMR 그리고 EI-MS로 구조를 분석하였다. Subfraction 4, 8 그리고 11 혼합물로 확인되었고 subfraction 10은 chain 형태의 hydrocarbon류로 추측된다(결과 미제시).
- SK-N-SH 세포 내 phospho-p38(p-p38) MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 활성화를 알아보기 위해 시료를 처리한 세포에서 단백질을 분리하여 p38 MAPK의 인산화 정도를 MAPK(Thr180/Tyr182) Sandwich ELISA Kit(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)을 사용하여 ELISA를 제조사의 방법에 따라 수행하였다.
- SK-N-SH 세포 내에서 산화적 스트레스의 유무 및 시료가 뇌신경세포 내 ROS를 소거할 수 있는지를 확인하기 위해서 2,7-dichlorofluorescein diacetate(DCF-DA; Sigma-Aldrich Co.)를 prove로 이용한 SK-N-SH 세포 내 생성된 ROS 양을 측정하였다. 10 mM DCF-DA를 만들어 10 µM 농도가 되도록 PBS로 희석시켰다.
- 곤드레의 에틸아세테이트 분획물이 헥산, 클로로포름, 에틸아세티이트, 부탄올 및 물 분획물들 중 가장 뛰어난 항산화력 및 산화적 스트레스에 방어하여 뇌신경세포 사멸 억제 효과가 있었고(1), 누룩치 추출물, 산초 및 씀바귀의 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 보였다는 연구 결과들과 비교해 보면 DPPH 라디칼 소거 활성 결과와는 일치하지만(13-15), 곤드레 에틸아세테이트가 뇌신경세포 사멸 억제 효과가 가장 뛰어났는데 본 연구에서는 잔대의 클로로포름 분획물이 가장 뛰어났으므로 다른 결과를 나타내었다(1). 계속되는 연구에서는 항산화 효과가 뛰어나고 산화적 스트레스에 대항하여 뇌신경세포 보호 효과가 가장 뛰어난 잔대의 클로로포름 분획물에 함유된 주요 생리활성물질을 분리 및 동정하였다.
- 따라서 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호 효과를 알아보기 위해 0, 100, 200 μg/mL 잔대 에탄올 추출물(AT)을 500 μM H2O2와 동시에 처리하였다.
- 산화적 스트레스에 대항하는 시료의 뇌신경세포 보호 효과 및 ROS 생성 억제능을 알아보기 위해 SK-N-SH 세포에 시료와 500 μM H2O2를 30분 간 SK-N-SH 세포에 동시에 처리하였다. 무처리군과 H2O2 처리군은 대조군 및 양성 대조군으로 사용하였다.
- 분리조건을 위한 용매조성은 헥산 : 에틸아세테이트(100:0 → 0:100)로 하였다.
- 사람의 신경모세포종 SK-N-SH를 10% 비활성화 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco-BRL, Carlsbad, CA, USA)과 1% penicillin(Gibco-BRL)과 streptomycin (Gibco-BRL)을 넣은 Eagle's minimum essential medium (EMEM; ATCC, Manassas, VA, USA) 배양액으로 5% CO2가 공급되는 배양기(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 37℃ 조건으로 배양하였다.
- 산화적 스트레스에 대항하는 시료의 뇌신경세포 보호 효과 및 ROS 생성 억제능을 알아보기 위해 SK-N-SH 세포에 시료와 500 μM H2O2를 30분 간 SK-N-SH 세포에 동시에 처리하였다.
- DCF-DA 용액을 제거한 후 PBS로 남아 있는 DCF-DA를 완전히 제거한 다음 PBS를 첨가하여 5분 간 배양시켰다. 세포 내 형광 광도의 변화를 형광광도계(Bio Tek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 488 nm(excitation)와 525 nm(emission)에서 측정하였다(1).
- 세포 생존율을 알아보기 위해 Dulbecco's phosphatebuffered saline(DPBS, 1×)을 이용하여 5 mg/mL MTT 용액을 제조하여 150 μL/well 처리하였고, 4시간 동안 다시 배양하였다.
- Mass spectrometry(MS) 분석을 통하여 화합물의 기본 구조를 예측한 후 정확한 화학 구조를 동정하기 위하여 nuclear magnetic resonance(NMR) spectroscopy(Bruker, Germany)를 이용하였다. 수소 간 상관관계를 규명하기 위하여 1H-NMR spectrum(900 MHz)을 측정하였고, 탄소의 위치 및 치환체와의 상관관계를 위해 13C-NMR spectrum (500 MHz)을 측정하였다(10).
- 양성 대조군으로 αtocopherol을 사용하였고, 10 μg/mL 이상의 농도에서는 100%에 가까운 DPPH 라디칼 소거 활성 작용이 있었으며, α-tocopherol 5, 2.5, 1 μg/mL에서는 각각 91.5, 81.2, 50.8% DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었다(결과 미제시).
- AT-CH 그리고 이것으로부터 분리된 화합물은 p38 경로를 저해하였다. 이들 결과는 AT-CH는 p38 경로를 저해하고 세포 내 ROS 소거작용에 의해 산화적 스트레스로부터 뇌신경세포 보호 효과를 가질 것이라 제안하였다.
- 잔대 70% 에탄올 추출물, 클로로포름 분획물 및 그 분획 물에서 분리된 β-sitosterol과 daucosterol이 어떤 기전에 의해 뇌신경세포 보호 효과가 있는지 알아보기 위해 산화적 스트레스 조건에서 뇌신경세포 사멸과 관련하여 활성화되는 것으로 알려져 있는 p38의 인산화를 측정하였다(16).
- 충분한 세포를 얻기 위해 배양용 플라스크(T75 cm2)에서 세포를 배양하고, 2~3일에 한 번씩 배지를 80% 교체하여 충분히 자랐을 때 trypsin-EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid; Gibco-BRL) 용액(1×)을 사용하여 부착된 세포를 떼어낸 후 성장배지에 세포수를 1×104 cells/well과 2×104 cells/well로 조정하여 96-well plates에 세포를 깔아주고 24시간 동안 배양하여 MTT assay와 세포 내 ROS를 검출하기 위하여 사용하였다.
- 그 후 microplate reader(Max plus 384, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 시 공시료는 DMSO로 하였고, 세포의 생존율은 아래와 같이 계산하였다.
대상 데이터
- 70% 에탄올 추출물(AT), 그리고 다섯 가지 분획물(에틸아세테이트, 헥산, 물, 클로로포름, 부탄올)을 여과, 농축 및 동결건조기(Clean vac 8, Hanil, Incheon, Korea)로 동결 건조한 시료들(AT-EA, AT-HE, AT-AQ, AT-CH, AT-BU)을 -20°C의 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 강원도 횡성에서 재배된 잔대(Adenophora triphylla)를 2014년 7월에 구입하여 건조 후 분쇄한 분말 시료 중량의 10배인 70% 에탄올을 첨가하여 shaking incubator(JSSI100C, JSR, Seoul, Korea)의 150 rpm과 25°C 조건에서 8시간 동안 3회 추출하였고, 추출물은 Whatman No.1 filter paper(Whatman, London, UK)로 여과하여 감압 농축기(N-1200, Eyela, Tokyo, Japan)를 사용하여 추출 용매를 제거한 후 극성 차이에 따라 분리를 행하여 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(butanol) 및 물(aqueous) 분획물 순서로 다섯 가지 분획물을 제조하였다.
- 잔대, 도라지 및 더덕의 70% 에탄올 추출물들의 DPPH 라디칼 소거작용을 비교하여 본 결과, 잔대 70% 에탄올 추출물이 도라지 및 더덕 추출물들보다 높은 DPPH 라디칼 소거작용이 있었고, 3가지 추출물들 모두 400 μg/mL까지 세포 독성은 없었지만 산화적 스트레스 조건에서 세 추출물들을 각각 0, 50, 100, 200, 400 μg/mL를 처리한 결과 잔대 70% 에탄올 추출물 처리가 도라지 및 더덕 추출물들보다 높은 뇌신경세포 사멸 억제 효과가 있었고 그 효과는 농도의존적이었다(결과 미제시). 따라서 본 연구에서는 산화적스트레스 조건을 완화시켜 줄 수 있는 항산화 효과가 뛰어나고 산화적 스트레스에 대항하여 뇌신경세포 사멸 억제 효과가 뛰어난 잔대 추출물을 본 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 05 수준에서 유의성의 여부를 검증하였다. 모든 통계 분석은 SPSS (Statistical Package for the Social Science) version 12.0 프로그램(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분석하였다.
- 본 실험 결과들은 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였고 실험군 간 평균의 차이는 oneway ANOVA로 유의성을 확인한 후 Duncan's multiple range test를 이용하여 사후 검정하였으며 P<0.05 수준에서 유의성의 여부를 검증하였다.
이론/모형
- Mass spectrometry(MS) 분석을 통하여 화합물의 기본 구조를 예측한 후 정확한 화학 구조를 동정하기 위하여 nuclear magnetic resonance(NMR) spectroscopy(Bruker, Germany)를 이용하였다. 수소 간 상관관계를 규명하기 위하여 1H-NMR spectrum(900 MHz)을 측정하였고, 탄소의 위치 및 치환체와의 상관관계를 위해 13C-NMR spectrum (500 MHz)을 측정하였다(10).
- Silica gel이 입혀진 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography; TLC Silica gel 60 F254, Merck Co., Darmstadt, Germany)를 이용하여 Chung 등(10)의 방법에 의해 수행하였다.
- 배양이 끝난 SK-N-SH 세포의 생존율은 Chung 등(1)이 사용한 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 환원 방법을 이용하여 측정하였다.
- 잔대 클로로포름 분획(4.5 g)을 medium-pressure liquid chromatography(MPLC) 분석법을 통하여 물질 분리를 수행하였다(9). 분리 조건을 위한 용매조성은 헥산 : 에틸아세테이트(100:0 → 0:100)로 하였으며, 이로부터 14개의 subfraction을 분리하였다.
- 잔대 클로로포름 분획(5.3g)을 칼럼 크로마토그래피 분석법을 통하여 물질 분리를 수행하였다(9). 분리조건을 위한 용매조성은 헥산 : 에틸아세테이트(100:0 → 0:100)로 하였다.
성능/효과
- 0, 25, 50 그리고 100 μg/mL의 에틸아세테이트, 헥산, 물, 클로로포름 그리고 부탄올 분획물들(AT-EA, AT-HE, AT-AQ, AT-CH 그리고 AT-BU)을 SK-N-SH 세포에 24시간 처리한 결과 AT-EA와 AT-HE 25, 50 그리고 100 μg/mL 처리 및 ATBU 100 μg/mL 처리에 의해 유의적으로 세포 생존율이 감소하였으나(Fig. 2A) 생존율이 80% 이상인 약한 독성이었기에 계속되는 실험에서는 50과 100 μg/mL를 사용하였다.
- 200μg/mL의 AT 처리는 500 μM H2O2 처리에 의해 생성된 세포 내 ROS를 완전하게 저해할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
- 500 μM H2O2를 단독 처리하였을 경우 세포 생존율이 61.7%였고 500 μM H2O2와 잔대 분획물을 동시에 처리한결과 50 μg/mL 농도에서는 에틸아세테이트 분획물(ATEA; 77.7%)과 클로로포름 분획물(AT-CH; 83.6%)이 다른 분획물보다 더 효과적으로 산화적 스트레스에 대항하여 세포 생존율을 증가시켰고, 100 μg/mL AT-CH 처리에 의해서 세포 생존율(101.3%)은 500 μM H2O2를 처리 전 수준으로 회복되었다(Fig. 2B).
- 잔대의 70% 에탄올 추출물은 강한 항산화 효과 및 산화적 스트레스 조건에서 뇌신경세포 사멸 억제 효과가 있었다. 6개의 분획물 중에 잔대 추출물의 클로로포름 분획물(ATCH)은 높은 DPPH 라디칼 소거작용 및 세포 내 활성산소종 (ROS) 소거작용을 가지고 있었고 H2O2에 대항하여 뇌신경 세포(SK-N-SH) 보호 효과가 가장 뛰어났다. 활성이 가장 우수한 클로로포름 분획물을 대상으로 주요 물질을 순수분리한 후 1H-NMR, 13C-NMR 그리고 EI mass spectra를 이용하여 화학구조를 분석한 결과 phytosterols(β-sitosterol과 daucosterol)이라는 것을 알 수 있었다.
- AT-EA와 AT-CH가 다른 분획물보다 높은 DPPH 라디칼 소거작용을 나타내었고(Fig. 2C), SK-N-SH에 500 μM H2O2의 처리에 의해 증가한 세포 내 ROS 함량을 다른 추출물보다 더 효과적으로 제거하여 주었다(Fig. 2D).
- EI-MS를 통하여 분자량이 m/z 414라는 것을 확인할 수 있었고(Fig. 3A), Chung 등(10)의 연구 보고의 β-sitosterol의 1H-NMR,13C-NMR 그리고 EI-MS 결과와 일치하였으므로 최종적으로 β-sitosterol로 동정되었다(Fig. 4A).
- 특히 glucose에 해당하는 signal이 확인되었다(Table 1). EI-MS를 통하여 분자량이 m/z 576임을 확인하였으며(Fig. 3B), 칼럼크로마토그래피의 subfraction-136과 MPLC에서 얻은 subfraction-6은 같은 물질이었고, Chung 등(10)의 연구 보고의 daucosterol의 1 H-NMR, 13C-NMR 그리고 EI-MS 결과가 일치하여 daucosterol로 동정하였다(Fig. 4B).
- 곤드레, 누룩치 그리고 산마늘 70% 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 모두 농도 의존적으로 증가하는 경향이 있었고, 곤드레 추출물은 125 μg/mL 농도부터, 누룩치 추출물은 60 μg/mL 농도부터, 산마늘 추출물는 500 μg/mL 농도부터 90% 이상의 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 보여주었는데(1), 본 연구에서 잔대의 70% 에탄올 추출물은 3 mg/mL 이상에서 90% 이상 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었으므로 곤드레, 누룩치 및 산마늘보다는 낮은 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었다.
- 곤드레의 에틸아세테이트 분획물이 헥산, 클로로포름, 에틸아세티이트, 부탄올 및 물 분획물들 중 가장 뛰어난 항산화력 및 산화적 스트레스에 방어하여 뇌신경세포 사멸 억제 효과가 있었고(1), 누룩치 추출물, 산초 및 씀바귀의 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 보였다는 연구 결과들과 비교해 보면 DPPH 라디칼 소거 활성 결과와는 일치하지만(13-15), 곤드레 에틸아세테이트가 뇌신경세포 사멸 억제 효과가 가장 뛰어났는데 본 연구에서는 잔대의 클로로포름 분획물이 가장 뛰어났으므로 다른 결과를 나타내었다(1). 계속되는 연구에서는 항산화 효과가 뛰어나고 산화적 스트레스에 대항하여 뇌신경세포 보호 효과가 가장 뛰어난 잔대의 클로로포름 분획물에 함유된 주요 생리활성물질을 분리 및 동정하였다.
- 그러나 농도가 증가함에 따라 강한 항산화력이 산화적 스트레스에 의한 세포 사멸을 억제함으로써 세포 자체에 낮은 독성을 가지고 있지만 500 μM H2O2를 단독 처리한 것과 유사한 세포 생존율을 보여주었다(Fig. 2B).
- 8% DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었다(결과 미제시). 따라서 잔대 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거작용은 양성 대조군보다는 낮았다.
- 또한, 세포 내 ROS 소거에 의해 산화적 스트레스로부터 뇌신경세포를 보호할 수 있다고 하였다. 본 연구에서도 잔대의 에탄올 추출물(AT) 처리에 의해 세포내 ROS를 100% 가까이 소거한 것은 AT가 강한 항산화 효과에 의한 것으로 추정되며, 이는 산화적인 스트레스에 의한 뇌신경세포 사멸 억제 효과를 나타내었을 것이라 추정된다.
- 잔대, 도라지 및 더덕의 70% 에탄올 추출물들의 DPPH 라디칼 소거작용을 비교하여 본 결과, 잔대 70% 에탄올 추출물이 도라지 및 더덕 추출물들보다 높은 DPPH 라디칼 소거작용이 있었고, 3가지 추출물들 모두 400 μg/mL까지 세포 독성은 없었지만 산화적 스트레스 조건에서 세 추출물들을 각각 0, 50, 100, 200, 400 μg/mL를 처리한 결과 잔대 70% 에탄올 추출물 처리가 도라지 및 더덕 추출물들보다 높은 뇌신경세포 사멸 억제 효과가 있었고 그 효과는 농도의존적이었다(결과 미제시).
- 잔대의 70% 에탄올 추출물은 강한 항산화 효과 및 산화적 스트레스 조건에서 뇌신경세포 사멸 억제 효과가 있었다. 6개의 분획물 중에 잔대 추출물의 클로로포름 분획물(ATCH)은 높은 DPPH 라디칼 소거작용 및 세포 내 활성산소종 (ROS) 소거작용을 가지고 있었고 H2O2에 대항하여 뇌신경 세포(SK-N-SH) 보호 효과가 가장 뛰어났다.
- 즉 β-sitosterol과 마찬가지로 전형적인 angular methyl signal이 NMR 고자장 영역에서 확인되었으며, 특징적인 C-5와 C-6의 signal도 확인되었다.
- H-NMR, 13C-NMR 그리고 EI-MS로 구조를 분석한 결과는 MPLC를 이용하여 얻은 subfraction 2와 같았다. 즉 MPLC를 이용하여 얻은 subfraction 2와 칼럼 크로마토그래프로 얻은 subfraction 33이 같은 물질이었으며, 이 물질은 전형적인 angular methyl signal이 NMR 고자장 영역에서 확인되었으며, 특징적인 C-5와 C-6의 signal도 확인되었다(Table 1). EI-MS를 통하여 분자량이 m/z 414라는 것을 확인할 수 있었고(Fig.
- 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 214의 subfraction을 얻었고(결과 미제시), subfraction 33을 1 H-NMR, 13C-NMR 그리고 EI-MS로 구조를 분석한 결과는 MPLC를 이용하여 얻은 subfraction 2와 같았다. 즉 MPLC를 이용하여 얻은 subfraction 2와 칼럼 크로마토그래프로 얻은 subfraction 33이 같은 물질이었으며, 이 물질은 전형적인 angular methyl signal이 NMR 고자장 영역에서 확인되었으며, 특징적인 C-5와 C-6의 signal도 확인되었다(Table 1).
- 칼럼크로마토그래피에서 얻은 subfractions 214개 중에서 subfraction-136을 1H-NMR, 13C-NMR 그리고 EI-MS로 구조를 분석한 결과는 MPLC에서 얻은 subfraction 6과 일치하였다. 즉 β-sitosterol과 마찬가지로 전형적인 angular methyl signal이 NMR 고자장 영역에서 확인되었으며, 특징적인 C-5와 C-6의 signal도 확인되었다.
- 6개의 분획물 중에 잔대 추출물의 클로로포름 분획물(ATCH)은 높은 DPPH 라디칼 소거작용 및 세포 내 활성산소종 (ROS) 소거작용을 가지고 있었고 H2O2에 대항하여 뇌신경 세포(SK-N-SH) 보호 효과가 가장 뛰어났다. 활성이 가장 우수한 클로로포름 분획물을 대상으로 주요 물질을 순수분리한 후 1H-NMR, 13C-NMR 그리고 EI mass spectra를 이용하여 화학구조를 분석한 결과 phytosterols(β-sitosterol과 daucosterol)이라는 것을 알 수 있었다. β-Sitosterol 과 daucosterol 역시 산화적 스트레스에 대항하여 SK-NSH 세포를 보호하는 작용이 있었다.
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