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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 혈관신생 억제 효능을 갖는 닥나무 추출물을 다양한 대사성 질환 관련 기능성 식품으로 개발하기 위해 닥나무 추출물의 marmesin을 지표 및 유효성분으로 선정하고 이 성분을 이용한 원료 표준화를 위한 효과적인 분석법을 확립하고 그에 대한 분석법 validation을 실시하였다.
- 본 연구는 HPLC를 이용하여 닥나무 추출물을 건강기능식품 원료로 개발하기 위하여 지표성분인 marmesin의 분석법 설정과 분석법에 대한 검증을 하고자 하였다. 표준액과 닥나무 추출물은 다른 물질의 간섭 없이 분리되었으며, 표준액과 추출물의 피크 유지시간이 일치한 spectrum을 나타내었다.
제안 방법
- 건강기능식품 기능성 원료로 등록하기 위한 지표성분으로서 ‘의약품 등 시험방법 밸리데이션 가이드라인(19)’을 근거로 하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정밀성 (precision), 정확성(accuracy), 검출한계(limit of detection, LOD, S/N=3.3) 및 정량한계(limit of quantitation, LOQ, S/N=10)를 분석하여 분석방법을 검증하였다.
- 검출한계 및 정량한계: 시료의 직선성 시험용액 3개의 그룹에 대한 검량선을 작성하여 각각의 검량선의 기울기와 y 절편을 구하였다. 검량선에서 기울기의 평균값과 y절편에 대한 표준편차를 구하여 아래의 식으로 검출한계 및 정량한계를 계산하였다.
- ) 값을 이용하여 직선성을 확인하였다. 닥나무 추출물을 1.04, 1.82, 2.6, 3.38, 4.16 mg/mL의 농도로 각각 조제하여 HPLC로 분석한 값으로 검량선을 작성하였다(Fig. 4). Marmesin의 상관계수(R2) 값은 0.
- 닥나무 추출물의 marmesin을 분석하기 위하여 HPLC 1100 및 HPLC 1200(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) 시스템을 사용하여 측정하였다. 분석에 사용된 칼럼은 Kromasil C18(4.
- 검출한계는 검체 중에 존재하는 분석대상물질의 검출 가능한 최소량을 말하며 정량한계는 적절한 정밀성과 정확성을 가진 정량값으로 표현할 수 있는 검체 중 분석대상물질의 최소량을 나타낸다. 닥나무 추출물의 직선성 시험용액 3개의 그룹에 대한 각각의 검량선을 작성하여 검량선의 기울기와 y절편을 구하였다. 각각의 검량선에서 기울기의 평균값과 y절편에 대한 표준편차를 구하여 반응의 표준편차와 검정곡선의 기울기에 근거하는 방법(standard deviation of the response and the slope)으로 검출한계 및 정량한계를 계산하였다(Table 7).
- 실험방법이 일정 범위에 있는 검체 중 분석대상물질의 양 (또는 농도)에 대하여 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력으로 크로마토그램에 대한 면적과 닥나무 추출물의 농도를 변수로 하여 검량선을 작성하고 작성한 검량선의 상관 계수(R2) 값을 이용하여 직선성을 확인하였다. 닥나무 추출물을 1.
- 실험실 내 정밀성(intermediate precision)은 균일한 검체로부터 여러 번 채취하여 얻은 시료를 같은 실험실 내에서 각각 서로 다른 실험일자, 기구 또는 장비 등을 이용하여 얻은 측정값들 사이의 근접성으로 상대표준편차(RSD)로 판단하였다. 완건성(robustness)은 일내분석(intra-day)는 1일 3구간 진행하였고 일간분석 (inter-day)는 1일 1구간으로 3일간으로 나누어 진행하여 변이성을 측정하였다.
- 정밀성: 반복성(repeatability)은 피크면적과 머무름 시간의 재현성은 표준용액을 가지고 시간의 변화에 따른 기계의 변화 정도를 보기 위하여 6회 주입하여 면적과 머무름 시간의 재현성을 확인하였다. 실험실 내 정밀성(intermediate precision)은 균일한 검체로부터 여러 번 채취하여 얻은 시료를 같은 실험실 내에서 각각 서로 다른 실험일자, 기구 또는 장비 등을 이용하여 얻은 측정값들 사이의 근접성으로 상대표준편차(RSD)로 판단하였다.
- 직선성: 분석대상물질의 농도에 대해 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력을 말하는 것으로 닥나무 추출물을 1.04, 1.82, 2.6, 3.38, 4.16 mg/mL의 농도로 각각 조제하여 3회 반복 측정하였으며 피크면적과 시료 농도를 변수로 하여 검량선을 작성하고 작성한 검량선의 상관계수(R2) 값을 이용하여 직선성을 확인하였다.
- 특이성: 불순물, 분해물, 배합성분 등의 혼합 상태에서 분석대상물질을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력을 말하는 것으로 확립된 분석법을 통하여 분리된 각각의 피크가 추출물 내의 다른 화합물과 분리가 되었는지 피크를 검토하여 확인하였으며 Photo diode array(PDA) spectrum을 측정하여 동일한 spectrum을 나타내는지도 확인하였다.
대상 데이터
- 닥나무 추출물의 분석에 사용한 표준품 marmesin(Fig. 1)은 Chengdu Biopurify Phytochemicals(Chengdu, China)에서 구입하여 사용하였다. 검량선 작성은 marmesin 5.
- 본 실험에 사용한 닥나무(B. kazinoki)는 2014년 10월 전주 농가에서 재배한 가지를 채취하여 분쇄한 다음 60% 에탄올을 이용하여 상온에서 48시간 동안 침지하여 2회 추출하였다. 추출물은 여과 및 감압 농축한 후 동결 건조하여 분말(수율: 7.
- 분석에 사용된 칼럼은 Kromasil C18(4.6×250 mm, 5 μm, Eka Chemicals, Bohus, Sweden)을 사용하여 Table 1과 같은 조건으로 marmesin 성분이 분리되도록 흘려주었으며 검출파장은 330 nm에서 검출하였다.
- kazinoki)는 2014년 10월 전주 농가에서 재배한 가지를 채취하여 분쇄한 다음 60% 에탄올을 이용하여 상온에서 48시간 동안 침지하여 2회 추출하였다. 추출물은 여과 및 감압 농축한 후 동결 건조하여 분말(수율: 7.8%)로 제조한 것을 사용하였다. 추출물은 60 % 에탄올에 녹여 0.
데이터처리
- 닥나무 추출물의 직선성 시험용액 3개의 그룹에 대한 각각의 검량선을 작성하여 검량선의 기울기와 y절편을 구하였다. 각각의 검량선에서 기울기의 평균값과 y절편에 대한 표준편차를 구하여 반응의 표준편차와 검정곡선의 기울기에 근거하는 방법(standard deviation of the response and the slope)으로 검출한계 및 정량한계를 계산하였다(Table 7). 직선상의 검출한계(LOD)는 2.
- 정밀성: 반복성(repeatability)은 피크면적과 머무름 시간의 재현성은 표준용액을 가지고 시간의 변화에 따른 기계의 변화 정도를 보기 위하여 6회 주입하여 면적과 머무름 시간의 재현성을 확인하였다. 실험실 내 정밀성(intermediate precision)은 균일한 검체로부터 여러 번 채취하여 얻은 시료를 같은 실험실 내에서 각각 서로 다른 실험일자, 기구 또는 장비 등을 이용하여 얻은 측정값들 사이의 근접성으로 상대표준편차(RSD)로 판단하였다. 완건성(robustness)은 일내분석(intra-day)는 1일 3구간 진행하였고 일간분석 (inter-day)는 1일 1구간으로 3일간으로 나누어 진행하여 변이성을 측정하였다.
성능/효과
- 6 μg/mL로 나타났다. 닥나무 추출물 1.3, 2.6, 3.9 mg/mL의 세 농도의 회수율은 100.35~101.18%였으며 정밀도는 0.27~0.30%로 나타나 정밀도 2.0% 이하로서 정확성이 있음을 알 수 있었다. 정밀성은 0.
- 닥나무 추출물을 1.3, 2.6, 3.9 mg/mL의 세 농도로 조제하고 같은 HPLC 조건으로 6회 반복 주입하고 시험하여 얻은 결과 각 성분 3가지 농도의 회수율은 100.35~101.18% 였으며 RSD는 0.27~0.30%로 나타나 RSD 2.0% 이하로서 정확성이 있음을 알 수 있었다(Table 6).
- 불순물, 분해물, 배합성분 등의 공존하는 상태에서 다른 성분의 영향을 받지 않고 분석대상물질을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력으로 표준액과 닥나무 추출물의 HPLC 크로마토그램을 비교하여 피크가 분리됨을 확인한 결과 다른 물질의 간섭 없이 분리되었으며 표준액의 피크 유지시간(retention time, RT)과 추출물의 피크 RT가 일치하였다. 또한, blank에서는 표준액과 겹치는 피크가 없었으며 닥나무 추출물에 표준액을 스파이킹하여 시험한 결과 회수율은 100.53%로서 양호한 결과를 얻었다(Fig. 2). 또한, 표준용액과 닥나무 추출물의 PDA spectrum 측정에서도 같은 spectrum을 확인하였다(Fig.
- 반복성: 균질한 검체로부터 다수의 시료를 취해 반복적으로 시험을 시행할 때 각 시험 결과의 일치 정도를 나타내는 것으로 닥나무 추출물 1.3, 2.6, 3.9 mg/mL의 세 농도로 조제하고 동일한 HPCL 조건으로 6회 반복 주입하고 시험하여 얻은 결과 성분별 3가지 농도의 피크의 RT 및 피크면적의 RSD는 0.04~0.30%로 나타나 RSD 2% 이하로서 반복성이 있음을 확인하였다(Table 2).
- 불순물, 분해물, 배합성분 등의 공존하는 상태에서 다른 성분의 영향을 받지 않고 분석대상물질을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력으로 표준액과 닥나무 추출물의 HPLC 크로마토그램을 비교하여 피크가 분리됨을 확인한 결과 다른 물질의 간섭 없이 분리되었으며 표준액의 피크 유지시간(retention time, RT)과 추출물의 피크 RT가 일치하였다. 또한, blank에서는 표준액과 겹치는 피크가 없었으며 닥나무 추출물에 표준액을 스파이킹하여 시험한 결과 회수율은 100.
- 실험실 내 정밀성: 같은 실험실 내에서 각각 서로 다른 실험일, 시험자, 기구 또는 장비 등을 이용하여 분석 실험하여 얻은 측정값들 사이의 근접성을 나타내는 것으로 칼럼과 HPLC 및 시험 일자를 다르게 하여 실시한 실험실 내 정밀성은 각 성분 3가지 농도의 피크의 유지시간 및 피크면적의 RSD는 0.03~0.30%로 나타나 RSD 2% 이하로서 실험실내 정밀성이 있음을 확인하였다(Table 3, 4).
- 3). 위의 결과를 종합했을 때 본 분석방법은 특이성이 있음을 확인할 수 있다.
- 0% 이하로서 정확성이 있음을 알 수 있었다. 정밀성은 0.04~0.30%의 정밀도를, 실험실 내 정밀성에서는 0.03~0.30%의 정밀도를 나타내었고 intra-day에서의 정밀도는 0.25~0.42%, inter-day에서는 0.32~0.70%의 정밀도를 나타내어 닥나무 추출물의 지표성분 marmesin의 분석법은 적합한 시험법임이 검증되었다. 본 분석법은 닥나무 추출물의 건강기능식품 원료 개발을 위한 기초자료로 활용될 것으로 생각한다.
- 정확성: 시료를 3가지 농도(1.3, 2.6, 3.9 mg/mL)로 조제하고 동일한 분석조건으로 6회 반복 주입하여 얻은 결과를 회수율(recovery)로 나타내어 정확성을 확인하였다.
- 본 연구는 HPLC를 이용하여 닥나무 추출물을 건강기능식품 원료로 개발하기 위하여 지표성분인 marmesin의 분석법 설정과 분석법에 대한 검증을 하고자 하였다. 표준액과 닥나무 추출물은 다른 물질의 간섭 없이 분리되었으며, 표준액과 추출물의 피크 유지시간이 일치한 spectrum을 나타내었다. 또한, blank에서 표준액과 겹치는 피크가 없는 것으로 특이성을 확인하였다.
후속연구
- 70%의 정밀도를 나타내어 닥나무 추출물의 지표성분 marmesin의 분석법은 적합한 시험법임이 검증되었다. 본 분석법은 닥나무 추출물의 건강기능식품 원료 개발을 위한 기초자료로 활용될 것으로 생각한다.
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