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문제 정의
- 섬바디는 청열, 해독, 산풍, 소담 등에 효능이 있으며, 뿌리를 약초로써 풍열두통, 담열천, 구역, 홍경만민을 치료하는데 사용하였다[9, 16]. 이에 본 연구에서는 섬바디나물 추출물을 이용하여 LPS로 활성화된 대식세포에서 염증매개물질들의 생성 억제 효과를 확인함으로써, 항염증 활성을 갖는 천연 소재로의 활용 가능성을 검토하고자 하였다.
- 본 연구에서는 활성산소 중 하나이며 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생성에 대한 섬바디나물 추출물의 효과를 알아보았다. 그 결과 Fig.
- 본 연구에서는 섬바디 나물의 항염증 효과를 알아보기 위하여 LPS로 염증을 유도한 Raw 264.7 세포에 대한 섬바디나물 80% 에탄올 추출물의 효과를 살펴보았다. 섬바디 나물추출물을 LPS로 유도된 Raw 264.
제안 방법
- iNOS, COX-2의 활성을 확인하기 위하여 cell line Raw 264.7을 100 mm tissue culture dish에 1 × 106 cells/well로 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화시켰다.
- 실험에 사용된 섬바디나물은 울릉도에서 채취하였으며, 열풍건조 후 분쇄하였다. 분쇄한 시료에 시료 중량의 10배 양의 80% 에탄올을 가하여 실온에서 24시간 침지한 후 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 시료 추출물은 여과지(Whatman No.
- DEPC를 처리한 증류수를 50 μl씩 분주하여 녹인 후 96 well plate에 RNA 5 μl와 멸균수 195 μl를 첨가하여 260 nm, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다.
- PCR로 합성시킨 후 0.002% ethidium bromide를 첨가한 1.5% agarose gel을 100 V에서 40분간 전기영동한 후 LAS 4,000을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.
- Oligo (dT) 15 primer (500 μg/ml) 1 μl, 추출한 RNA (2 μg)와 nuclease free water로 10 μl를 맞추고 75℃에서 5분간 반응시킨 후 5× reaction buffer, MgCl2, PCR nucleotide mix, rnasin inhibitor, reverse transcriptase, nuclease free water를 첨가하여 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
- iNOS, COX-2의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과 같다.
- 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과 같다. PCR tube에 5X green GoTaq flexi buffer, MgCl2, PCR nucleotide mix (10 mM), primer, GoTaq DNA polymerase, nuclease free water, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. GAPDH, iNOS는 96℃에서 2분, 96℃에서 10초, 64℃에서 30초, 72℃에서 1분, 72℃에서 10분(40 cycles), COX-2는 96℃에서 2분, 94℃에서 10초, 51℃에서 30초, 72℃에서 1분, 72℃에서 10분(40 cycles)을 실행하였다.
- PCR tube에 5X green GoTaq flexi buffer, MgCl2, PCR nucleotide mix (10 mM), primer, GoTaq DNA polymerase, nuclease free water, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. GAPDH, iNOS는 96℃에서 2분, 96℃에서 10초, 64℃에서 30초, 72℃에서 1분, 72℃에서 10분(40 cycles), COX-2는 96℃에서 2분, 94℃에서 10초, 51℃에서 30초, 72℃에서 1분, 72℃에서 10분(40 cycles)을 실행하였다. PCR로 합성시킨 후 0.
- C에서 80% 이상의 세포 생존율을 보인 50, 100, 500 μg/ml의 농도에서 실험을 진행하였다.
- 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 β-actin을 positive control로 사용하였다.
- 섬바디 나물 추출물의 50, 100, 500 μg/ml 농도에서 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 억제 효과를 측정하기 위해 western blot을 통해 측정하였고, 양성대조군으로는 β-actin을 사용하였다.
- 염증유발 인자인 iNOS, COX-2 mRNA 발현 억제 효과를 측정하기 위하여 RT-PCR을 이용하여 실험하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는house keeping gene인 GAPDH을 positive control로 사용하였다.
- 염증유발 인자인 iNOS, COX-2 mRNA 발현 억제 효과를 측정하기 위하여 RT-PCR을 이용하여 실험하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는house keeping gene인 GAPDH을 positive control로 사용하였다. 그 결과 Fig.
- 7 세포에 대한 섬바디나물 80% 에탄올 추출물의 효과를 살펴보았다. 섬바디 나물추출물을 LPS로 유도된 Raw 264.7 대식세포에서 전염증성인자(iNOS, COX-2)들을 생성하여 측정하였다. 섬바디 나물추출물의 대식세포에서의 세포 독성 측정을 MTT를 수행하였다.
- 7 대식세포에서 전염증성인자(iNOS, COX-2)들을 생성하여 측정하였다. 섬바디 나물추출물의 대식세포에서의 세포 독성 측정을 MTT를 수행하였다. 섬바디 나물 추출물의 세포 독성을 측정한 결과, 1,000 μg/ml의 농도에서 100% 이상의 세포 생존율을 보였다.
- 섬바디나물 추출물의 50, 100, 500 μg/ml 농도에서 iNOS, COX-2의 mRNA의 발현 억제 효과를 측정하기 위해 RT-PCR을 통해 측정하였으며, 양성 대조군으로 GAPDH를 사용하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 섬바디나물은 울릉도에서 채취하였으며, 열풍건조 후 분쇄하였다. 분쇄한 시료에 시료 중량의 10배 양의 80% 에탄올을 가하여 실온에서 24시간 침지한 후 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복으로 행하여 평균치와 표준편차로 나타내었고, 결과 통계처리는 SPSS10.0 (Evanston, USA) software를 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석(analysisof variance ANOVA)을 한 후 α = 0.05 수준에서 Turkey’s HSD test에 의해 유의성을 분석하였다.
이론/모형
- 세포 생존율 측정은 Carmichae [1]의 방법에 따라 측정하였다. Raw 264.
- RAW264.7 cell로부터 생성된 NO의 양은 Green 등의 방법[3]에 따라 griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2의 형태로 측정하였다. 6 well plate에 Raw 264.
- 염증유발 인자인 iNOS, COX-2 단백질 발현 억제 효과를 측정하기 위하여 western blot을 이용하여 실험하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 β-actin을 positive control로 사용하였다.
성능/효과
- 가장 높은 농도인 1,000 μg/ml에서 31.4%의 저해율을 나타낸 것을 확인하였으며, 대식 세포주에서의 염증발현을 억제시키는 것에 섬바디나물 추출물이 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서는 활성산소 중 하나이며 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생성에 대한 섬바디나물 추출물의 효과를 알아보았다. 그 결과 Fig. 2와 같이 LPS 처리군은 LPS 무처리군에 비해 높은 NO 발현량을 나타내었으며, 섬바디나물 추출물을 처리한 군은 NO 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 가장 높은 농도인 1,000 μg/ml에서 31.
- C와 비교하였을 때 대조군 Vit. C보다 섬바디 나물 추출물에서 iNOS와 COX-2 단백질 발현이 더 억제되었음을 확인할 수 있었다.
- 섬바디 나물 추출물의 세포 독성을 측정한 결과, 1,000 μg/ml의 농도에서 100% 이상의 세포 생존율을 보였다.
- 그 결과, 섬바디 나물 추출물을 western blot을 통해 측정한 iNOS, COX-2의 단백질 발현 억제 효과는 500 μg/ml 농도에서 각각 56%, 61.6%로 감소하였다.
- C와 비교하였을 때 대조군 Vit. C보다 섬바디나물 추출물에서 iNOS와 COX-2 mRNA 발현이 유사하거나 억제되었음을 확인할 수 있었다.
- iNOS 억제 활성을 가진 천연물질 탐색을 위한 과거 연구에서 섬바디나물 추출물은 LPS로 유도된 NO의 생성을 억제한 바 있으며[7, 10], Kim 등은 섬바디나물 뿌리 메탄올 추출물의 헥산 분획물과 에틸 아세테이트 분획물에서 분리한 쿠마린 및 플라보노이드가 COX-2와 5-lipoxygenase (5-LOX) 이중억제 활성을 가지며, 섬바디나물의 소염 작용은 eicosanoid의 생성 억제를 통해 부분적으로 일어날 수 있다고 보고한 바 있다[8]. 이러한 사실을 종합하였을 때 섬바디나물은 항염증 소재로서의 가능성이 있다고 판단된다.
- 그 결과, 섬바디 나물 추출물을 RT-PCR을 통해 iNOS, COX-2의 mRNA 발현 억제 효과를 측정한 결과는 500 μg/ml에서 각각 77.9%, 83.3%로 감소하였다.
- 3%로 감소하였다. 이를 통해, 섬바디 나물 추출물은 염증을 억제시켜 주는 가능성이 있는 항염증 물질로써의 효과가 있을 것으로 보여진다.
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