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문제 정의
- 따라서 본 실험은 한방의료기관에서 처방하는 다빈도 처방 중 하나인 십전대보탕에 대하여 대한민국약전외한약(생약)규격집7) 중 “십전대보탕액”의 성상, pH, 비중, 순도시험(중금속), 미생물한도 및 함량에 대해 물리·화학적 시험을 실시하여 이 결과를 근거로 보관온도 및 보관기간에 따른 품질변화를 평가하여 십전대보탕의 복약지도에 대한 기초자료로 제공하고자 한다.
제안 방법
- Glycyrrhizic acid와 paeoniflorin의 함량 분석을 위한 HPLC 기기조건은 Table IV와 같으며, Glycyrrhizic acid와 paeoniflorin의 표준편차와 검량선 기울기에 근거하여 다음과 같은 방법에 따라 검출한계(Limit of detection, LOD)와 정량한계(Limit of quantitation, LOQ)를 구하였다.
- 실험재료 − 본 실험은 2014년 6월 십전대보탕 원료 한약재인 12품목을 서울약령시장에서 구입하여 실험재료로 사용하였으며, 십전대보탕은 태평혜민화제국방에 수록된 방법에 따라 조제하였으며 십전대보탕의 1첩 구성은 Table I과 같다. 각 재료들의 기원은 감별검사를 통해 입증받았으며, 실험에 필요한 십전대보탕은 약 5제의 분량(3.75 kg)을 약재 무게의 10배수에 해당하는 약 37.5 L의 물을 넣어 100℃에서 3시간을 유지하여 전탕하였다. 십전대보탕 전탕팩은 5℃, 25℃로 차광, 보관 후 각각 0, 1, 3, 6, 9 및 12개월에 측정항목을 분석하였다.
- 납과 카드뮴 및 비소의 검량선은 혼합표준액 10.0 μg/mL를 5% 질산에 희석하여 0.5~1,000 μg/L의 농도별 표준용액으로 조제하여 ICP-MS로 측정하여 작성하였다.
- 055 mg/mL가 되도록 분석시료와 동일하게 처리한 후 HPLC로 분석하여 회수율(%) 및 변동계수(Coefficient of variation, %)를 구하여 분석법을 검증하고 분석결과의 신뢰성을 확인하였다. 또한 납과 카드뮴, 비소, 수은의 유효성 검증을 위하여 미국 표준과학기술원(National Institute of Standard Technology,NIST)에서 구입한 표준인증물질(CRM)인 Peach Leaves(NIST CRM 1547), tomato leaves(NIST 1573a), Rice flour Certified Reference Material(NIST 1568b)를 사용하여 분석 시료와 동일하게 처리하고 ICP-MS와 Mercury Analyzer를 이용하여 측정한 뒤 회수율 및 변동계수(Coefficient of variation, %)를 구하였다.
- 미생물한도 시험 − 조제된 십전대보탕 전탕액에 대하여 대한민국약전 일반시험법8) 중 미생물한도시험법에 따라 시험하였으며, 호기성미생물수, 진균수, 대장균, 녹농균, 황색포도상구균 및 살모넬라균에 대하여 미생물시험을 실시하였다.
- 성상 − 조제된 십전대보탕 전탕팩에 대하여 보관온도 및 보관기간에 따라 육안으로 관찰하였다.
- 수은의 검량선은 수은 표준액을 0.001% L-cysteine으로 0~20 μg/kg로 표준용액을 조제하여 Mercury Analyzer로 측정하였다.
- 십전대보탕 전탕액에 각각 glycyrrhizic acid와 paeoniflorin 표준용액을 spike하여 최종농도가 각각 0.055 mg/mL가 되도록 분석시료와 동일하게 처리한 후 HPLC로 분석하여 회수율(%) 및 변동계수(Coefficient of variation, %)를 구하여 분석법을 검증하고 분석결과의 신뢰성을 확인하였다. 또한 납과 카드뮴, 비소, 수은의 유효성 검증을 위하여 미국 표준과학기술원(National Institute of Standard Technology,NIST)에서 구입한 표준인증물질(CRM)인 Peach Leaves(NIST CRM 1547), tomato leaves(NIST 1573a), Rice flour Certified Reference Material(NIST 1568b)를 사용하여 분석 시료와 동일하게 처리하고 ICP-MS와 Mercury Analyzer를 이용하여 측정한 뒤 회수율 및 변동계수(Coefficient of variation, %)를 구하였다.
- 5 L의 물을 넣어 100℃에서 3시간을 유지하여 전탕하였다. 십전대보탕 전탕팩은 5℃, 25℃로 차광, 보관 후 각각 0, 1, 3, 6, 9 및 12개월에 측정항목을 분석하였다.
- 은 십전대보탕에 총중금속을 측정한 결과 30 ppm을 초과하지 않았다고 보고하였다. 이전의 연구에서는 중금속을 비색법으로 분석하였으나 본 연구에서는 각각의 중금속에 대하여 기기분석을 수행한 후 유효성을 검증하였다.
- 중금속 실험초자는 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌 재질을 사용하였으며, PTFE(polytetrafluoroethylene) vessel은 10%(v/v) 질산에 24시간 보관한 후 초순수로 세척하여 사용하였으며, Micro-wave Digestion System(MARS 5, CEM,Matthews, NC, USA)을 이용하여 분해하고 ICP-MS(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, Agilent 7500ce, Agilent, Tokyo, Japan)를 이용하여 시료 중 납과 카드뮴을 측정하였으며, 수은 함량은 Mercury Analyzer(MA2, Nippon Instrument Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다.
- 한방의료기관에서 조제한 십전대보탕 전탕액에 대하여 보관온도(5℃, 25℃), 보관기간 (12개월)에 따른 품질변화를 평가하고자 성상, pH, 비중, 중금속, 미생물한도시험, 글리시리진산 및 페오니플로린 함량을 실험하였다.
- 함량시험은 Agilent 1200 series HPLC(Agilent Technologies, Waidbronn, Germany)를 사용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 시약 및 기기 − 표준물질인 Glycyrrhizin과 Paeoniflorin은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)를 사용하였으며, 추출 및 정량분석에 사용된 Methanol과 Acetonitrile은 HPLC grade용으로 J. T. Baker(Phillipsburg, USA)를 사용하였다.
- 실험재료 − 본 실험은 2014년 6월 십전대보탕 원료 한약재인 12품목을 서울약령시장에서 구입하여 실험재료로 사용하였으며, 십전대보탕은 태평혜민화제국방에 수록된 방법에 따라 조제하였으며 십전대보탕의 1첩 구성은 Table I과 같다.
- 십전대보탕의 전탕 및 포장은 무압력약탕기(일광기계,Korea)와 스탠딩파우치용 포장기(SAVER, 경희상사)를 사용하였으며, 실험에 사용한 포장지는 폴리에스테르 PET 25 + 폴리프로필렌 CPP 80의 재질로 이루어진 포장지를 사용하였다.
- 중금속 분석 시 시료의 분해에 사용한 질산은 EP-S(Electronic grade, Dong Woo Fine Chem., Seoul, Korea)를 사용하였으며, 표준액은 혼합표준액(Multi-element Calibration Standard 2A) 10.0 μg/mL(Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 5% 질산에 희석하여 사용하였고, 수은 표준품(994 mg/L, Kanto Soka, Japan)을 0.001% L-cysteine에 희석하여 사용하였다.
데이터처리
- t-test를 이용하여 p<0.05에서 유의성을 검증하였다.
- 통계 분석 − 실험의 결과들은 3반복 평균 수치와 표준편차로 나타내었으며, 통계처리는 SPSS(Statistical Package for the Social Science, 2.0 K, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하였다.
이론/모형
- pH 및 비중 − pH는 대한민국약전 일반시험법8)의 pH측정법, 비중은 비중 및 밀도측정법 제3법에 부칭에 의한 시험법에 따라 실험하였다.
- 글리시리진산 및 페오니플로린 함량 − 글리시리진산과 페오니플로린 함량은 대한민국 약전시험법8)에 따라 분석하였다.
- Microwave Digestion System으로 190℃까지 15분 동안 상승시켜 분해한 후 vessel을 -20℃의 냉동실에서 2시간 방냉·탈기하고 초순수를 가하여 여과 후 50 mL로 정용하여 시험용액으로 사용하였다. 분석은 ICPMS를 이용하여 측정하였으며, 기기분석 조건은 Table II와 같다. 수은은 분쇄한 시료 약 50 mg을 자동시료주입기가 부착된 Mercury Analyzer를 사용하여 가열기화금아말감법(Combustion gold amalgamation method)으로 측정하였고 기기조건은 Table III과 같다.
- 분석은 ICPMS를 이용하여 측정하였으며, 기기분석 조건은 Table II와 같다. 수은은 분쇄한 시료 약 50 mg을 자동시료주입기가 부착된 Mercury Analyzer를 사용하여 가열기화금아말감법(Combustion gold amalgamation method)으로 측정하였고 기기조건은 Table III과 같다.
성능/효과
- 전통적으로는 옹기 약탕기에 약한 불로 오랜시간 달여서 복용하는 방법을 사용했으나, 현대에 이르러 사용상의 편리성이나 인력수요 감소 등의 이유로 인해 전기식 가열추출기를 이용하여 한약을 전탕하는 방법이 널리 보급되고 있다.3) 십전대보탕은 예부터 음양기혈을 함께 보하면서 속을 덥혀주는 효능이 있어 기혈부족으로 허약하고 기운이 없고 소화가 잘 안되며 식은 땀이 나고 기침이 잦을 때, 해산 후, 수술전 후, 빈혈증, 출혈성 질병, 심장쇠약, 만성소화 기병, 월경부조, 폐결핵 등에 쓰였다.4) 십전대보탕이 처음 등장한 이후로 시대별, 문헌별로 구성약물의 용량에는 변동이 있었지만, 조선시대에 들어와 대부분 이들 10 종류의 약재가 동일 용량으로 구성되는 경향을 보였다.
- 3) 십전대보탕은 예부터 음양기혈을 함께 보하면서 속을 덥혀주는 효능이 있어 기혈부족으로 허약하고 기운이 없고 소화가 잘 안되며 식은 땀이 나고 기침이 잦을 때, 해산 후, 수술전 후, 빈혈증, 출혈성 질병, 심장쇠약, 만성소화 기병, 월경부조, 폐결핵 등에 쓰였다.4) 십전대보탕이 처음 등장한 이후로 시대별, 문헌별로 구성약물의 용량에는 변동이 있었지만, 조선시대에 들어와 대부분 이들 10 종류의 약재가 동일 용량으로 구성되는 경향을 보였다.5) 한편, 한방의료기관에서 처방 조제한 십전대보탕은 별도의 품질 규격이 없으며 탕액 파우치의 보관기간에 대한 과학적인 근거는 설정되어 있지 않아6) 서늘한 곳에 보관하도록 복약지도하고 있는 실정이다.
- Glycyrrhizic acid와 paeoniflorin의 검출한계(Limit of detection, LOD)는 0.10 μg/L, 0.70 μg/L이었고, 정량한계(Limit of quantitation, LOQ)는 0.50 μg/L, 0.30 μg/L이었으며, 실험방법의 유효성을 검증하기 위하여 회수율에 따른 정확성 및 정밀도를 살펴본 결과 glycyrrhizic acid의 회수율은 99.8, paeoniflorin의 회수율은 108.9%였다.
- pH − 십전대보탕 전탕액의 조제시 pH는 4.9였으며, 5℃에서는 1개월 후 4.9로 변화가 없었고, 3, 6, 9, 12개월에서는 모두 4.8로 다소 감소하는 경향을 보였다.
- 글리시리진산, 페오니플로린 함량 − 보관온도(5℃, 25℃)및 보관기간에 따른 글리시리진산의 함량을 분석한 결과 조제시 0.24±0.007 mg/mL이였다.
- 글리시리진산과 페오니플로린의 함량변화를 바탕으로 선형회귀방정식을 이용하여 조제 시 함량 결과를 100%로 하여 초기 농도 대비 90% 수준으로 함량기준을 설정하여 유통기한을 예측한 결과 5℃, 25℃에서 모두 글리시리진산은 약 6개월, 페오니플로린은 3개월이었다. 따라서 두가지 약효성분을 고려한다면 실온과 냉장 보관에 관계없이 3개월 안에 복용하는 것이 좋을 것으로 판단된다.
- 납, 카드뮴, 비소 및 수은의 유효성 검증을 한 결과 검출한계(Limit of detection, LOD)는 0.079, 0.003, 0.004 μg/kg,수은은 0.017 mg/kg이었고, 정량한계(Limit of quantitation,LOQ)는 0.264, 0.009, 0.014 μg/kg, 수은은 0.057 mg/kg이었다.
- 글리시리진산과 페오니플로린의 함량변화를 바탕으로 선형회귀방정식을 이용하여 조제 시 함량 결과를 100%로 하여 초기 농도 대비 90% 수준으로 함량기준을 설정하여 유통기한을 예측한 결과 5℃, 25℃에서 모두 글리시리진산은 약 6개월, 페오니플로린은 3개월이었다. 따라서 두가지 약효성분을 고려한다면 실온과 냉장 보관에 관계없이 3개월 안에 복용하는 것이 좋을 것으로 판단된다.
- 9%였다. 또한 정밀도를 파악하기 위하여 변동계수(Coefficient of variation, %)를 구한 결과, glycyrrhizic acid와 paeoniflorin은 각각 1.0,1.1%였다(Table IX).
- 7%이었다. 또한 정밀도를 파악하기 위하여 변동계수(Coefficient of variation,%)를 구한 결과, 카드뮴과 수은이 각각 0.3, 4.7%, 납이 2.9%, 비소가 2.5%였다(Table VII).
- 또한 페오니플로린은 조제시 0.45±0.022 mg/mL이었으며,5 ℃에서는 저장기간이 경과함에 따라 0.45±0.022 mg/mL에서 12개월 후 0.30±0.010 mg/mL로, 25℃에서 0.31±0.027mg/mL로 감소하는 경향을 보였으나(Fig. 2).
- 미생물한도시험 − 십전대보탕 전탕액 10 mL을 이용하여 총호기성미생물수, 진균수, 대장균, 녹농균, 황색포도상구균 및 살모넬라균을 실험 한 결과 총호기성미생물과 진균은 검출되지 않았으며, 특정세균인 대장균, 녹농균, 황색포도상구균, 살모넬라균도 모두 검출되지 않았다(Table VIII).
- 보관기간 3개월부터 보관 기간이 경과함에 따라 보관온도(5℃, 25℃)간의 유의적인 차이를 보였으나(p<0.05) 대한민국약전외한약(생약)규격집7)“십전대보탕액”의 pH 기준 3.0~5.0 이내로 나타나 안전한 수준이었다.
- 05). 선형회귀 방정식을 이용하여 글리시리진산과 페오니플로린의 조제 시 함량을 100%로 하여 초기 농도 대비 90% 수준으로 함량기준을 설정하여 유통 기한을 예측한 결과 5℃, 25℃에서 모두 글리시리진산은 약 6개월, 페오니플로린은 약 3개월이었다. 따라서 두가지 약효성분을 고려한다면 실온과 냉장 보관에 관계없이 3개월안에 복용하는 것이 좋을 것으로 판단되며, 일반적으로 한방 의료기관에서 3개월안에 복약지도 하는 것과 유사한 결과로 십전대보탕의 복약지도에 대한 기초자료로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
- 십전대보탕 전탕액의 품질 안전성에 대하여 평가한 결과 12개월동안 성상, 비중, 미생물 한도시험은 유의적인 차이를 보이지 않았으며(p<0.05), 대한민국약전외(생약) 규격집“십전대보탕액”의 기준이내로 안전한 수준이었다.
- 약효 안정성 평가를 위해 실시한 글리시리진산과 페오니플로린의 함량은 보관기간이 경과함에 따라 감소하는 경향을 보였으나 보관온도(5℃, 25℃)에 따른 유의적인 차이는 나타나지 않았다(p<0.05).
- 이후 1, 3, 6, 9, 12개월에서도 모두 같은 결과를 보여 대한민국약전외생약규격집7) “십전대보탕액”의 기준 이내로 12개월의 보관기간 동안 안전한 수준이었다.
- 중금속 − 십전대보탕 전탕액을 조제 시 납, 카드뮴, 비소 및 수은을 측정한 결과 납 0.003±0.003 mg/kg, 비소 0.01±0.002 mg/kg, 카드뮴과 수은은 검출되지 않았으며, 대한민국약전외생약규격집7) “십전대보탕액”의 납(5 ppm 이하), 비소(3 ppm 이하) 기준 이내로 안전한 수준이었다.
후속연구
- 선형회귀 방정식을 이용하여 글리시리진산과 페오니플로린의 조제 시 함량을 100%로 하여 초기 농도 대비 90% 수준으로 함량기준을 설정하여 유통 기한을 예측한 결과 5℃, 25℃에서 모두 글리시리진산은 약 6개월, 페오니플로린은 약 3개월이었다. 따라서 두가지 약효성분을 고려한다면 실온과 냉장 보관에 관계없이 3개월안에 복용하는 것이 좋을 것으로 판단되며, 일반적으로 한방 의료기관에서 3개월안에 복약지도 하는 것과 유사한 결과로 십전대보탕의 복약지도에 대한 기초자료로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
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