이상발효유산균과 내산성 효모와의 혼합배양이 사워도우의 저장성에 미치는 영향 Effect of the mixed culture of heterofermentative lactic acid bacteria and acid-tolerant yeast on the shelf-life of sourdough원문보기
본 연구에서는 묵은지로부터 분리된 박테리오신을 생산하는 이상발효 유산균 및 내산성 효모가 사워도우의 저장 기간 연장과 품질 개선에 미치는 영향을 조사하였다. 유전자 염기서열 분석 결과 빵 부패세균인 Bacillus 속에 대한 항균활성을 나타낸 이상발효 유산균은 Leuconostoc mesenteroides LAS112, Lactobacillus brevis LAS129 및 L. mesenteroides subsp. dextranicum LAB137으로 동정되었고, 산성 pH 하에서 증식 가능한 효모는 Pichia membranifaciens YS05, Pichia fermentans YS19 및 Pichia anomala YS26으로 확인되었다. 사워도우 발효에 사용된 L. brevis LAS129는 L. mesenteroides LAS112 및 L. mesenteroides subsp. dextranicum LAS 137 보다 더많은 양의 초산과 박테리오신 활성을 나타내었으나, LAS112는 가장 많은 양의 유산을 생산하였다. Bacillus subtilis ATCC 35421에 대한 최대의 박테리오신 활성(640 AU/g)은 L. brevis LAS129와 P. membranifaciens YS05 혹은 P. anomala YS26으로 혼합 발효시킨 사워도우 내에서 관찰되었다. $30^{\circ}C$에서 24시간 발효 후 사워도우 내 LAS129의 균수($10^9CFU/g$)는 YS05 혹은 YS26의 효모 균수($10^7CFU/g$)보다 높게 검출되었다. 한편, 이들 균주들을 이용하여 발효시킨 사워도우 내에 존재하는 빵 부패균의 균수는 대조구 보다 유의하게(P < 0.05) 낮은 수준으로 나타났다.
본 연구에서는 묵은지로부터 분리된 박테리오신을 생산하는 이상발효 유산균 및 내산성 효모가 사워도우의 저장 기간 연장과 품질 개선에 미치는 영향을 조사하였다. 유전자 염기서열 분석 결과 빵 부패세균인 Bacillus 속에 대한 항균활성을 나타낸 이상발효 유산균은 Leuconostoc mesenteroides LAS112, Lactobacillus brevis LAS129 및 L. mesenteroides subsp. dextranicum LAB137으로 동정되었고, 산성 pH 하에서 증식 가능한 효모는 Pichia membranifaciens YS05, Pichia fermentans YS19 및 Pichia anomala YS26으로 확인되었다. 사워도우 발효에 사용된 L. brevis LAS129는 L. mesenteroides LAS112 및 L. mesenteroides subsp. dextranicum LAS 137 보다 더많은 양의 초산과 박테리오신 활성을 나타내었으나, LAS112는 가장 많은 양의 유산을 생산하였다. Bacillus subtilis ATCC 35421에 대한 최대의 박테리오신 활성(640 AU/g)은 L. brevis LAS129와 P. membranifaciens YS05 혹은 P. anomala YS26으로 혼합 발효시킨 사워도우 내에서 관찰되었다. $30^{\circ}C$에서 24시간 발효 후 사워도우 내 LAS129의 균수($10^9CFU/g$)는 YS05 혹은 YS26의 효모 균수($10^7CFU/g$)보다 높게 검출되었다. 한편, 이들 균주들을 이용하여 발효시킨 사워도우 내에 존재하는 빵 부패균의 균수는 대조구 보다 유의하게(P < 0.05) 낮은 수준으로 나타났다.
The primary objective of this study was to investigate the effects of the bacteriocin-producing heterofermentative lactic acid bacteria (LAB) and acid-resistant yeast isolated from Mukeunji, a Korean ripened kimchi on shelf-life extension and quality improvement of sourdough. According to gene seque...
The primary objective of this study was to investigate the effects of the bacteriocin-producing heterofermentative lactic acid bacteria (LAB) and acid-resistant yeast isolated from Mukeunji, a Korean ripened kimchi on shelf-life extension and quality improvement of sourdough. According to gene sequence analysis the heterofermentative LAB that showed the antimicrobial activity against bread-spoilage Bacillus strains were identified as Leuconostoc mesenteroides LAS112, Lactobacillus brevis LAS129, and L. mesenteroides subsp. dextranicum LAB137. In addition, the yeasts that were able to grow at acidic pH were identified as Pichia membranifaciens YS05, Pichia fermentans YS19, and Pichia anomala YS26. During sourdough fermentation the levels of acetic acid and bacteriocin produced by L. brevis LAS129 strain were higher than those of L. mesenteroides LAS112 and L. mesenteroides subsp. dextranicum LAS 137 strains, whereas LAS112 strain produced the highest levels of lactic acid. The maximum bacteriocin activity (640 AU/g) against Bacillus subtilis ATCC 35421 was obtained in sourdough fermented by mixed culture of L. brevis LAS129 and P. membranifaciens YS05 or P. anomala YS26. After 24 h of fermentation at $30^{\circ}C$, the viable cell counts of LAS129 ($10^9CFU/g$) in sourdough were higher than those of the YS05 or YS26 ($10^7CFU/g$). Meanwhile, the viable cells of bread-spoilage strain in sourdough fermented with these strains were significantly (P < 0.05) lower than the control group.
The primary objective of this study was to investigate the effects of the bacteriocin-producing heterofermentative lactic acid bacteria (LAB) and acid-resistant yeast isolated from Mukeunji, a Korean ripened kimchi on shelf-life extension and quality improvement of sourdough. According to gene sequence analysis the heterofermentative LAB that showed the antimicrobial activity against bread-spoilage Bacillus strains were identified as Leuconostoc mesenteroides LAS112, Lactobacillus brevis LAS129, and L. mesenteroides subsp. dextranicum LAB137. In addition, the yeasts that were able to grow at acidic pH were identified as Pichia membranifaciens YS05, Pichia fermentans YS19, and Pichia anomala YS26. During sourdough fermentation the levels of acetic acid and bacteriocin produced by L. brevis LAS129 strain were higher than those of L. mesenteroides LAS112 and L. mesenteroides subsp. dextranicum LAS 137 strains, whereas LAS112 strain produced the highest levels of lactic acid. The maximum bacteriocin activity (640 AU/g) against Bacillus subtilis ATCC 35421 was obtained in sourdough fermented by mixed culture of L. brevis LAS129 and P. membranifaciens YS05 or P. anomala YS26. After 24 h of fermentation at $30^{\circ}C$, the viable cell counts of LAS129 ($10^9CFU/g$) in sourdough were higher than those of the YS05 or YS26 ($10^7CFU/g$). Meanwhile, the viable cells of bread-spoilage strain in sourdough fermented with these strains were significantly (P < 0.05) lower than the control group.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 묵은지로부터 유산균을 분리하고 빵의 주요 부패균인 Bacillus 속에 대한 항균 활성이 있는 유산, 초산 및 박테리오신을 생산하는 이상발효유산균만을 선발 동정하였다. 분리된 유산균과의 혼합 배양으로 사워도우를 제조하기 위해 낮은 pH 환경하에서 증식 가능한 내산성 효모를 분리 동정하였고, 선발된 유산균과 효모를 이용하여 사워도우를 발효시킨 후 일정한 저장기간 동안 유산균, 효모 및 Bacillus속의 균수 변화와 pH, 총산도 및 유기산 함량과 박테리오신의 활성 변화를 측정하였다.
본 연구에서는 묵은지로부터 분리된 박테리오신을 생산 하는 이상발효 유산균 및 내산성 효모가 사워도우의 저장 기간 연장과 품질 개선에 미치는 영향을 조사하였다. 유전자 염기서열 분석 결과 빵 부패세균인 Bacillus 속에 대한 항균활성을 나타낸 이상발효 유산균은 Leuconostoc mesenteroides LAS112, Lactobacillus brevis LAS129 및 L.
제안 방법
Microtiter plate well (Falcon)에 멸균된 BHI broth (900 μl), Bacillus 속 세포 현 탁액(50 μl) 및 일정한 농도에 맞춘 박테리오신 용액(50 μl)을 가한 후 37°C에서 24시간 동안 배양하였다.
)로 반응(초기 변성은 94°C에서 3분, 변성은 94°C에서 2분, 풀림은 42°C에서 1분, 신장은 72°C에서 2분, 연장은 72°C에서 7분, 36회 반복)시켰다. PCR 산물은 purification kit (Qiagen)로 정제한 후 DNA 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST search (http:/www.
dextranicum LAS137도B. cereus, B. licheniformis및 B. subtilis에 대한 항균활성을 나타낸 박테리오신을 생산하였다. 한편, LAS112 유산균의 박테리오신은 pepsin 및 protease의 처리에 의해 항균활성이 일부 소실되었고, LAS129 유산균의 박테리오신은 pepsin 처리에 의해 항균활성이 완전히 소실되었으며, LAS137 유산균의 박테리오신은 protease와 proteinase K처리에 의해 항균활성이 감소되었음을 확인하여 이들 박테리오신은 단백질 성분임을 확인하였다(결과 미제시).
게다가 유산균과 효모로 발효시킨 사워도우 내 B. subtilis의 균수 변화를 조사하기 위해 BHI broth에서 30°C, 24시간 배양한 후 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)하고 침전물은 PBS (pH 7.0)에 현탁시켜 세포수를 5.0 × 105 CFU/g으로 조정하여 접종하였다(Juodeikiene et al., 2011).
묵은지로부터 효모를 분리하기 위해 PBS (pH 7.0)를 가하여 균질화한 시료 1 ml를 채취하여 yeast glucose chloramphenicaol (YGC) agar 평판배지 위에 도말 접종하여 25°C에서 72시간 배양하였다.
밀가루(강력분; 수분 10.5%, 조단백 16.7%, 조지방0.9%, 조회분 1.5%) 380 g, 물 210 g, 소금5.3 g, 설탕11.2 g 및 유산균(5.0 × 106 CFU/g)과 효모(5.0 × 105 CFU/g) 세포 현탁액 각각 5 g씩 접종한 후 약 5분간 반죽기(HM3000, Brown)를 이용하여 혼합하였다.
박테리오신 함량 측정을 위해 시료(10 g)에 40% acetonitrite-0.1% (v/v) trifluoroacetic acid (90 ml)를 가하여 균질화하여 소수성 물질을 추출한 다음 원심분리(15,000 × g, 10분) 하였다.
subtilis ATCC 35421에 대한 항균활성을 앞서 언급한 microtiter plate method에 따라 측정하였다. 박테리오신을 생산하지 않는 유산균을 대조구로 하여 용매에 의한 항균 활성을 배제하였다(Settanni et al., 2005).
반죽한 시료는 멸균된 비이커에 담아 온도 30°C, 상대습도 80% 하에서 24시간 동안 발효시켜 사워도우를 제조하였다.
발효 종료 후 저장하는 동안 일정 시간별 채취한 사워도우(10 g)는 PBS (pH 7.0) 로 적당하게 희석한 후 Nutrient Agar (NA)상에서 37°C, 48시간 배양하여 표준한천평판배양법으로 잔존하는 균수를 측정하였다.
따라서 본 연구에서는 묵은지로부터 유산균을 분리하고 빵의 주요 부패균인 Bacillus 속에 대한 항균 활성이 있는 유산, 초산 및 박테리오신을 생산하는 이상발효유산균만을 선발 동정하였다. 분리된 유산균과의 혼합 배양으로 사워도우를 제조하기 위해 낮은 pH 환경하에서 증식 가능한 내산성 효모를 분리 동정하였고, 선발된 유산균과 효모를 이용하여 사워도우를 발효시킨 후 일정한 저장기간 동안 유산균, 효모 및 Bacillus속의 균수 변화와 pH, 총산도 및 유기산 함량과 박테리오신의 활성 변화를 측정하였다.
사워도우 제조 직후부터 30°C에서 5일간 보관하는 동안 pH, 총산도 및 항균물질(유산, 초산, 박테리오신) 함량 변화를 조사하였다.
사워도우 제조 직후부터 30°C에서 5일간 보관하는 동안 pH, 총산도 및 항균물질(유산, 초산, 박테리오신) 함량 변화를 조사하였다. 사워도우의 pH는 시료(10 g)와 증류수(90 ml)를 혼합한 후 pH meter (Fisher Scientific)를 이용하여 측정하였다. 한편, 시료와 동량의 증류수를 혼합한 후 1% (w/v) phenolphthalein 을 첨가한 다음 0.
세포 현탁액은 pH 3.5에 맞춘 YM broth에 가하여 30°C에서 24시간 배양한 후 YEPD agar 상에서 균수를 측정하여 산성 하에서 증식이 가능한 내산성 효모를 선발하였다.
시료 용액을 약 30분간 냉각시킨 다음 여과 제균(0.22 μm membrane filter)하고 High-pressure liquid chromatography (HPLC, Shimadzu)의 이온 교환 컬럼(Aminex HPX-87 H, 300 × 7.8 mm, Bio-Rad Life Science Group) 온도 60°C에서 이동상(8 mM H2SO4)의 유속 0.7 ml/min의 조건 하에서 210 nm에서 UV detector로 분석하고 표준용액의 검량곡선으로부터 유기산 함량을 정량하였다.
시료(10 g)를 무균적으로 채취하고 PBS (pH 7.0, 90 ml)를 가하여 균질화한 후 곰팡이 및 효모의 증식을 억제하기 위해 cycloheximide (10 mg/L, Merck)를 첨가한 MRS agar 배지 상에서 37°C, 24시간 동안 배양하여 유산균수를 측정하였다.
PCR 산물은 purification kit (Qiagen)로 정제한 후 DNA 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST search (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)를 사용하여 26S rRNA 단편의 유전자염기 서열 상동성을 확인하고 동정하였다(Min et al., 2012).
유기산과 과산화수소의 영향을 배제하기 위해 1 N NaOH를 사용하여 배양 상등액의 pH를 6.5로 조정한 다음 catalase (1 mg/ml, Sigma-Aldrich)를 처리하고 단백질을 침전시키기 위해 황산암모늄(60%, w/v)을 가하여 교반(4°C, overnight)하였다.
유산균은 MRS broth에 접종하여 37°C에서 24시간 호기적인 조건 하에서 배양 후 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)하여 배양상등액을 회수하였다.
유전자 염기서열 분석을 위해 전보(Lim, 2016)에 따라 DNA extraction kit (Qiagen)로 균주의 DNA를 추출 정제한 후 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 와 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) primer를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymeraase chain reaction, PCR)으로 DNA를 증폭하였다.
제조 직후부터 4°C에서 5일간 저장하는 동안 사워도우 내에 함유된 유산균, 효모 및 B. subtilis의 균수 변화를 측정하였다.
중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 시 26S rDNA의 D1/D2 domain을 증폭시키기 위해 NL-1 (5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)과 NL-4 (5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′) primer, ITS1/5.8S rDNA/ITS2 domain은 ITS-1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3′) 과 ITS-4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) primer를 사용하여 PCR Thermal cycler (Bio-Rad Laboratories Ltd.)로 반응(초기 변성은 94°C에서 3분, 변성은 94°C에서 2분, 풀림은 42°C에서 1분, 신장은 72°C에서 2분, 연장은 72°C에서 7분, 36회 반복)시켰다.
즉, 분리된 유산균과 효모는 각각 MRS broth와 YM broth에 접종한 다음 37°C (유산균)와 30°C (효모)에서 각각24시간 배양한 후 배양액을 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)하여 회수한 세포를 PBS(pH 7.0)로 2회 세척 및 현탁시켜 준비하였다.
한편, 시료와 동량의 증류수를 혼합한 후 1% (w/v) phenolphthalein 을 첨가한 다음 0.1 N NaOH 용액으로 적정 소비량을 계산하여 공식[산도 (%) = (0.1 N NaOH 소비량 × 0.1 N NaOH 역가 × 0.9)/ 시료양]에 대입한 후 총산도를 측정하였다.
대상 데이터
반응 후 DNA sequencer (ABI Prism®3730 Avant Genetic Analyzer, Applied Biosystems)로 동정하여 이상발효 유산균주를 실험에 사용하였다.
데이터처리
실험구와 대조구의 유의적 차이는 Student’s t-test를 통해 유의수준P < 0.05에서 그룹 간 유의성을 검증하였다.
항목별 모든 실험은 총 3회 실시하였고, 측정값은 평균±표준편차로 나타내었고, 통계분석을 위해 Statistical Package for Social Science 12.0 software (SPSS) 프로그램을 이용하였다.
이론/모형
B. cereus ATCC 11778, B. licheniformis KCTC 1918, Bacillus stearothermophilus ATCC 10149 및 B. subtilis ATCC 35421균주에 대한 분리된 유산균이 생산한 박테리오신의 항균활성은 microplate plate method (Hole et al., 1991)로 측정하였다. 유산균은 MRS broth에 접종하여 37°C에서 24시간 호기적인 조건 하에서 배양 후 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)하여 배양상등액을 회수하였다.
유기산 함량은 Alfonzo 등(2013)의 방법에 따라 시료(10 g)에 증류수(90 ml)를 가하여 균질기로 혼합한 시료 용액 10 ml를 취한 뒤 1 mM HClO4 (5 ml)를 가하고 원심분리(4,000 × g, 15분) 하였다.
1% (v/v) trifluoroacetic acid (90 ml)를 가하여 균질화하여 소수성 물질을 추출한 다음 원심분리(15,000 × g, 10분) 하였다. 침전물을 모아 동결 건조시키고 50% (v/v) 알코올에 용해시킨 용액으로 B. subtilis ATCC 35421에 대한 항균활성을 앞서 언급한 microtiter plate method에 따라 측정하였다. 박테리오신을 생산하지 않는 유산균을 대조구로 하여 용매에 의한 항균 활성을 배제하였다(Settanni et al.
한편, 효모수는 균질화한 시료로부터 1 ml 취하여 YGC agar 배지 상에서 30°C, 24시간 동안 배양하여 표준한천평판배양법으로 측정하였다.
성능/효과
30°C에서 24시간 발효 후 사워도우 내 LAS129의 균수(109 CFU/g)는 YS05 혹은 YS26의 효모 균수(107 CFU/g)보다 높게 검출되었다.
묵은지로부터 분리된 균주 중 염기서열 분석을 통해 이상발효유산균주만을 선발하여 Bacillus 속에 대한 박테리오신의 항균활성을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 9종의 시료로부터 분리된 유산균 총 23종 중에서 편성(obligately) 이상발효유산균은 7종으로 확인되었으며, 염기서열 분석 결과 Lactobacillus fermentum LAS105, Leuconostoc mesenteroides LAS112, Lactobacillus brevis LAS129, Leuconostoc citreum LAS134, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum LAS137, Leuconostoc inhae LAS148 및 Weissella koreensis LAS152로 동정되었고 이들은 NCBI에 등재된 균주들과 98–100%의 상동성을 나타내었다.
4 정도로 나타났다. L. sanfranciscensis, L. brevis, W. cibaria, P. pentosaceus, Enterococcus faecium, L. paralimentarius 등의 유산균 단독으로 제조한 경우 pH는 3.46~3.87이었고, 적정 산도는 6.4~10.9 정도였으나, 효모와 유산균의 혼합 배양 시 pH는 3.46~3.99, 적정 산도는 6.2~10.9 정도로 나타났다. 또한 유산균 단독 배양 시 유기산 생산량은 0.
8 mM, 박테리오신 활성은 320 AU/ml 으로 나타났다. LAS112 단독으로 발효시킨 경우 물리화학적 특성은 YS05와 혼합 배양 시에는 유의한 차이가 없었으나, YS19 및 YS26과 혼합 배양한 경우에는 pH가 유의하게 높았고 총산도, 유기산 생성량 및 박테리오신 활성은 낮았다. LAS129 단독으로 발효시킨 사워도우의 pH는 3.
LAS112 단독으로 발효시킨 사워도우의 pH는 4.19±0.10, 총산도는 1.30±0.20%, 유산량은 69.5±5.5 mM, 초산량은 43.8±5.8 mM, 박테리오신 활성은 320 AU/ml 으로 나타났다.
LAS129 단독으로 발효시킨 사워도우의 pH는 3.60±0.09, 총 산도는 1.60±0.20, 유산량은 61.4±3.3 mM, 초산량은 89.2±2.0 mM, 박테리오신 활성은 640 AU/ml으로 나타나 LAS112 단독 배양일 때보다 많은 양의 초산을 생산하고 박테리오신 활성도 높게 나타났다.
0 mM, 박테리오신 활성은 640 AU/ml으로 나타나 LAS112 단독 배양일 때보다 많은 양의 초산을 생산하고 박테리오신 활성도 높게 나타났다. LAS129 단독으로 발효시킨 사워도우의 물리화학적 특성은 YS05및 YS26과 혼합 배양에 의해선 유의한 수치 변화가 없었으나, YS19와 혼합 배양 시에는 박테리오신 활성이 50% 수준으로 나타났다. LAS137 단독으로 발효시킨 사워도우의 pH는 4.
subtilis 균수가 낮게 나타났다. LAS129 유산균은 LAS112와 LAS137 보다 더 높은 B. subtilis에 대한 항균 효과를 나타내었고 대조구보다 약 4 log cycle 이상 낮은 균수를 유지하였다. 특히 LAS129 유산균은 YS19와 혼합 배양했을 때YS05나 YS26 효모와의 혼합 배양보다 항균활성이 다소 낮았으나, LAS137은 단독 및 효모와의 혼합 배양 시 비슷한 수준의 항균활성을 나타내었다.
LAS137 단독으로 발효시킨 사워도우의 pH는 4.00±0.22, 총산도는 1.46±0.30, 유산량은 55.1±3.1 mM, 초산량은 60.4±4.4 mM, 박테리오신 활성은 80 AU/ml으로 나타나 LAS112 혹은 LAS129 단독 배양일 때보다 박테리오신 활성은 매우 낮게 나타났으며, YS05, YS19 및 YS26 효모와 혼합 배양했을 때의 물리화학적 특성과는 큰 차이가 없었다.
4 mM)로 발효 시킨 사워도우에서 높게 나타났다. S. cerevisiae 단독 배양으로 제조한 사워도우의 pH는 4.86으로 감소되었고 이에 적정산도는 2.4 정도로 나타났다. L.
묵은지로부터 분리된 효모의 내산성과 염기서열 분석을 통한 동정 결과는 Table 2와 같다. YEPD 배지의 pH를 조정하지 않은 상태에서 24시간 배양 후 분리된 효모들의 균수는 108~109 CFU/ml에 이르렀으나, pH 3.5로 조정한 배지 내에서 YS05, YS26 균주는 107 CFU/ml, YS19는 106 CFU/ml 및 YS14와 YS21 균주는 105 CFU/ml로 측정되었다. 분리 효모중 YEPD 배지에 초기 균수 1.
mesenteroides subsp. dextranicum LAB137으로 동정되었고, 산성 pH 하에서 증식 가능한 효모는 Pichia membranifaciens YS05, Pichia fermentans YS19 및 Pichia anomala YS26으로 확인되었다. 사워도우 발효에 사용된 L.
mesenteroides subsp. dextranicum LAS 137 보다 더많은 양의 초산과 박테리오신 활성을 나타내었으나, LAS112는 가장 많은 양의 유산을 생산하였다. Bacillus subtilis ATCC 35421에 대한 최대의 박테리오신 활성(640 AU/g)은 L.
dextranicum LAS137, Leuconostoc inhae LAS148 및 Weissella koreensis LAS152로 동정되었고 이들은 NCBI에 등재된 균주들과 98–100%의 상동성을 나타내었다.
mesenteroides subsp. dextranicum LAS137이 B. subtilis에 대해 항균활성을 나타내는 박테리오신을 생산하여 기존의 결과에서 밝혀진 유산균종과는 다소 차이가 있었다. Corsetti 등(1996)은 사워도우로 부터 분리된 총 232종의 유산균 중에서 33% 정도가 B.
mesenteroides subsp. dextranicum 및 L. brevis가 생산하는 박테리오신의 항균활성은 액체 배지 내에서보다 사워도우 내에서 더 낮게 나타났다. 기존 연구 결과에 따르면, In vitro 상에서 Bacillus 속에 대한 박테리오신의 항균활성이 탁월해도 사워도우 내에서 활성이 감소하거나 나타나지 않는 경우, 이는 도우의 입자와 표면에 박테리오신이 결합하거나, 제어 대상 미생물의 수가 많을수록 박테리오신의 활성이 감소되는 것으로 보고된 바 있다(Rosenquist and Hansen, 1998).
, 2006). 기존의 보고된 결과와 본 연구 결과에서 볼 때 사워도우의 pH, 총산도 및 유기산 생산량은 유산균과 효모의 종류 및 발효조건에 따라 상이한 것을 알 수 있었다.
, 2015). 김치로부터 분리된 L. citreum HO12와 W. koreensis HO20으로 발효시킨 사워도우 내 유산균의 초기 균수는 약 6.4 Log CFU/g 정도였으나, 24시간 발효 후에는 각각9.2 및 9.4 CFU/g으로 증가되었다고 하였는데 본 연구에 사용된 LAS112, LAS129 및 LAS137 균주는 이들보다는 다소 낮은 균수가 검출되었다. 한편, 이들 유산균은 빵의 부패 미생물인 B.
subtilis에 대한 항균 효과가 높게 나타난 것으로 추정된다. 따라서 박테리오신이나 유기산 등의 항균물질을 생산하는 유산균을 사워도우 제조에 이용하면 빵의 부패균으로 잘 알려진 B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium 및 B. cereus 등을 제어하여 빵의 부패지연으로 인한 품질 향상 및 식중독 발생 위험을 억제할 수 있으며, 화학 합성보존료의 사용을 감소시켜 독성 발생 위험을 줄일 수 있을 것으로 판단된다.
또한 4°C에서 5일간 저장하는 동안 유산균, 효모 및 B. subtilis의 균수는 유의할 만한 변화가 없었다.
9 정도로 나타났다. 또한 유산균 단독 배양 시 유기산 생산량은 0.04~0.09 mM/g이었으나, S. cerevisiae와 L. paralimentarius의 혼합 배양한 경우는 다른 유산균에 비해 약간 높은 0.11 mM/g의 유산을 생산하였다. 게다가 이들 유산균 단독으로 배양했을 때 초산은 극히 소량생산하였으나, 효모와 혼합 배양한 경우 L.
exiguous 효모를 혼합 배양한 결과, 단독 배양에 비해 효모의 수율에는 유의한 변화가 없었으나, 유산균의 증식 속도와 유산이나 초산 등 최종 대사산물의 수율은 더 높게 나타났다고 보고하였다. 또한 유산균의 증식에 필수적인 발린(valine)이나 루신(leucine)이 첨가 되지 않은 배지 내에서 유산균이 증식 가능한 것은 효모가 이들 아미노산을 생성하기 때문인 것으로 추정하였으나, 본 연구에 사용된 효모는 사워도우 내에서 유산균의 증식에 유의할 만한 영향을 주지 않았고, 특히 YS19와 YS26은 LAS112의 증식을 오히려 방해하였다. Paramithiotis 등(2006)에 따르면, L.
박테리오신 용액에 pepsin, protease 및 proteinase K (l mg/ml, Sigma-Aldrich)를 가하여 37°C에서 3시간 배양한 후 80°C에서 약 2분간 가열하여 효소 반응을 정지시킨 다음 잔존하는 박테리오신 활성을 측정하여 단백질 성분임을 확인하였다.
dextranicum LAS137, Leuconostoc inhae LAS148 및 Weissella koreensis LAS152로 동정되었고 이들은 NCBI에 등재된 균주들과 98–100%의 상동성을 나타내었다. 분리 동정된 이상발효유산균 7종을 대상으로 Bacillus 속에 대한 박테리오신 생성능을 확인한 결과, LAS105, LAS134, LAS148 및 LAS152는 Bacillus 속에 대한 항균활성이 있는 박테리오신을 생산하지 않았으나, L. mesenteroides LAS112가 생산한 박테리오신의 항균활성은 B. sterothermophilus와 B. subtilis에 대해 각각 2,560 및 640 AU/ml으로 나타났다. 또한 L.
사워도우에 B. subtilis (5.0 × 106 CFU/g)만을 접종하여 배양한 경우 24시간 만에 8.5±2.1×107 CFU/g에 이르렀으나, LAS112로 발효시킨 사워도우 제조 직후 유산균수는 108 CFU/g, B. subtilis 의 균수는 대조구보다 3 log cycle 이상 적은 균수가 검출되었고 이는 YS05와 혼합 배양한 경우도 이와 유사한 수준이었다.
유산균은 영양요구성이 까다로운 균으로서 발효과정 동안사워도우 내에 존재하는 효모가 아미노산, 펩타이드 및 비타민 등을 공급함으로써 유산균의 증식이 촉진되는 것으로 밝혀졌다. 반면 유산균의 유기산 생성에 영향을 주는 탄수화물을 두고 효모와 유산균은 서로 경쟁하므로 주요 당 성분에 대해 비경쟁적 환경을 조성하는 것이 미생물의 증식을 위해 필요하다(Gobbetti, 1998).
koreensis HO20보다 높게 나타났으나 16시간 이후부터는 거의 비슷한 수준을 유지하였다. 이들 유산균으로 제조한 사워도우의 pH와 총 산도는 유의적인 차이가 없었으나 유산과 초산의 비율과 양에는 현저한 차이를 보였다. 특히 유산의 함량은 W.
이상의 결과를 요약하면, 빵의 부패균에 대하여 항균 활성을 나타내는 유산균과 효모를 이용하여 사워도우를 발효시키는 동안 미생물의 당 이용능, 혼합 배양에 따른두 균주간의 편리 혹은 상호 공생이나 경합 등에 따라 발효 종료직후 최종 균수에 유의한 차이가 있었으며, 유산균의 균수가 증가할수록 박테리오신 생산량이 증가되어 B. subtilis에 대한 항균 효과가 높게 나타난 것으로 추정된다. 따라서 박테리오신이나 유기산 등의 항균물질을 생산하는 유산균을 사워도우 제조에 이용하면 빵의 부패균으로 잘 알려진 B.
특히 유산의 함량은 W. koreensis HO20 (63.0±0.2 mM)으로 제조한 사워도우에서 더 높게 검출된 반면, 초산의 양은 L. citreum HO12 (32.0±0.4 mM)로 발효 시킨 사워도우에서 높게 나타났다.
39로 급격하게 감소됨에 따라 총산도는 증가되었다. 특히, L. citreum HO12로 발효시킨 사워도우의 총산도는 12시간 후 W. koreensis HO20보다 높게 나타났으나 16시간 이후부터는 거의 비슷한 수준을 유지하였다. 이들 유산균으로 제조한 사워도우의 pH와 총 산도는 유의적인 차이가 없었으나 유산과 초산의 비율과 양에는 현저한 차이를 보였다.
subtilis 의 균수는 대조구보다 3 log cycle 이상 적은 균수가 검출되었고 이는 YS05와 혼합 배양한 경우도 이와 유사한 수준이었다. 하지만 효모와 혼합 발효시킨 사워도우 내 효모수는 107CFU/g에 이르렀고, YS05 효모와 혼합 배양했을 때는 YS19 혹은 YS26와 혼합 발효한 사워도우보다 B. subtilis 균수가 낮게 나타났다. LAS129 유산균은 LAS112와 LAS137 보다 더 높은 B.
Rosenquist와 Hansen (1995)은 nisin을 생산하는 유산균은 well diffusion assay에 의해 Bacillus 속의 증식을 억제하였으나, 4,000 IU/ml 농도의 nisin을 빵에 첨가한 경우 로프를 형성하는 Bacillus 속의 발아와 증식 억제에는 유의한 효과가 없었다고 하였다. 한편, B. subtilis와 B. licheniformis 의 증식을 효과적으로 저해하는 유기산으로는 프로피온산과 초산이었으며, 빵에 첨가한 경우에도 6일 동안 Bacillus 속의 증식을 억제하였다고 하였다. Voysey와 Hammond (1993)는 초산 0.
subtilis에 대한 항균활성을 나타낸 박테리오신을 생산하였다. 한편, LAS112 유산균의 박테리오신은 pepsin 및 protease의 처리에 의해 항균활성이 일부 소실되었고, LAS129 유산균의 박테리오신은 pepsin 처리에 의해 항균활성이 완전히 소실되었으며, LAS137 유산균의 박테리오신은 protease와 proteinase K처리에 의해 항균활성이 감소되었음을 확인하여 이들 박테리오신은 단백질 성분임을 확인하였다(결과 미제시).
한편, 선발된 3종의 유산균은 과산화수소를 생성하지 않는 것으로 확인되었으며, LAS112, LAS129 및 LAS137 유산균의 배양 상등액(10%)을 처리하여 24시간 배양 후 B. subtilis의 균수 변화를 관찰한 결과, LAS129는 초기 균수(5.0 × 106CFU/g)를 약 0.4 log cycle 감소시켰고, LAS112및 LAS137에 의해선 증식 속도 지연 효과가 나타났으므로(결과 미제시) 이들 유산균의 항균활성은 유기산과 박테리오신에 기인하는 것으로 추정되었다.
30°C에서 24시간 발효 후 사워도우 내 LAS129의 균수(109 CFU/g)는 YS05 혹은 YS26의 효모 균수(107 CFU/g)보다 높게 검출되었다. 한편, 이들 균주들을 이용하여 발효시킨 사워도우 내에 존재하는 빵 부패균의 균수는 대조구 보다 유의하게(P < 0.05) 낮은 수준으로 나타났다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
빵의 부패와 관련된 대표적인 미생물은 무엇이 있는가?
빵의 부패와 관련된 대표적인 미생물로는 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis 및 Bacillus cereus 등이 있으며, 이와 같은 Bacillus속의 일부 균종은 식중독을 유발하는 병원성균으로 알려져 있다(Collins et al., 1991).
Bacillus 속 세균이 영양 세포로 전환되면 빵에 어떠한 변화를 일으키는가?
95 이상이면 포자가 발아 하여 점질물을 생성하게 된다. 영양세포로 전환된 세균은 빵에 이미와 이취 및 변색을 유발하고, 끈적임과 부스러짐 현상이 발생하며, Bacillus균이 생성하는 전분이나 단백질 분해효소에 의한 유기물 분해와 세포 외(extracellular) 점질성 다당류의 생성에 의한 조직의 변화가 나타난다(Thompson et al., 1993).
빵 제조 시, Bacillus 속 세균은 어디서부터 오염되는가?
, 1991). Bacillus 속 세균은 원료 (밀가루), 식품첨가물(밀가루 개량제, 팽창제) 및 제조 과정 중 환경으로부터 오염된다(Bailey and Von Holy, 1993). 이들의 포자는 내열성이므로 빵을 굽는 과정 중에도 생존 가능하며, 25~30°C 온도 하에서 수분활성도 0.
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