[논문]프로바이오틱 유산균으로 제조한 사워도우의 미생물학적 및 이화학적 특성

임은서

doi:10.7845/kjm.2016.6012

프로바이오틱 유산균으로 제조한 사워도우의 미생물학적 및 이화학적 특성
Microbiological and chemical properties of sourdough fermented with probiotic lactic acid bacteria 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.52 no.1, 2016년, pp.84 - 97

초록
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재래식 된장으로부터 분리된 유산균은 형태학적, 생화학적 특성과 당 발효능 및 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 Enterococcus faecium SBP12, Pediococcus halophilus SBP20, Lactobacillus fermentum SBP33, Leuconostoc mesenteroides SBP37, Pediococcus pentosaceus SBP41, Lactobacillus brevis SBP49, Lactobacillus acidophilus SBP55 및 Enterococcus faecalis SBP58로 동정되었다. SBP20, SBP33, SBP49와 SBP55 균주는 인공 위액과 담즙액 내에서 6 log cycle 이상 생균수를 유지하였으나, SBP12와 SBP58은 낮은 pH 하에서 2시간만에 균수가 급격하게 감소되었다. 특히, SBP49와 SBP55는 HT-29 세포에 대한 부착능이 높고, 항생제에 대한 저항성이 크며, Bacillus cereus ATCC 11778과 Staphylococcus aureus ATCC 6538의 식중독균에 대한 항균활성을 나타내었으므로, 이 두 균주는 프로바이오틱 선발 기준에 적합한 것으로 추정된다. 게다가 SBP49와 SBP55를 이용하여 사워도우를 제조한 결과, 발효 직후 도우 내 pH, 산도 및 유산균수에는 유의한 차이가 없었으나, SBP49는 많은 양의 유산을 생산한 반면, SBP55는 과산화수소를 더 많이 생산하였다. SBP49와 SBP55 유산균은 유산과 과산화수소뿐만 아니라 박테리오신 등의 항균물질을 생산하므로 사워도우 내 존재하는 식중독균 저해에 효과적이었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Isolates from Korean fermented soybean paste were identified as Enterococcus faecium SBP12, Pediococcus halophilus SBP20, Lactobacillus fermentum SBP33, Leuconostoc mesenteroides SBP37, Pediococcus pentosaceus SBP41, Lactobacillus brevis SBP49, Lactobacillus acidophilus SBP55, and Enterococcus faecalis SBP58 according to conventional morphological and biochemical characteristics, carbohydrate fermentation profiling, and 16S rRNA sequence comparison. Strain SBP20, SBP33, SBP49, and SBP55 showed very resistance to simulated gastric and intestinal juices with final populations exceeding 6 log CFU/ml, whereas cells of SBP12 and SBP58 after exposure to low pH were dramatically decreased within 2 h. Among 4 strains having good tolerance to gastrointestinal conditions, the high adhesive ability to HT-29 cells, antibiotic resistance, and antimicrobial activity against food-borne pathogens Bacillus cereus ATCC 11778 and Staphylococcus aureus ATCC 6538 were observed with SBP49 and SBP55, therefore, these two strains were confirmed as putative probiotic candidates. There was no significant difference between the sourdoughs fermented with SBP49 and SBP55 with respect to the values of pH, total titratable acidity, and viable cell count. During sourdough fermentation, SBP49 strain produced significantly greater amounts of lactic acid than SBP55 strain, which secreted large quantities of hydrogen peroxide. SBP49 and SBP55 strains producing the antimicrobial substances such as lactic acid, hydrogen peroxide, and bacteriocin effectively inhibited B. cereus and S. aureus inoculated in the sourdough.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 우리나라 전통 발효식품인 된장으로부터 프로바이오틱 선발 기준에 적합한 균주를 검색하고, 빵에서 주로 분리되는 식중독균에 대한 항균작용을 나타내는 유산균을 분리 동정하였다. 또한 선발된 유산균으로 사워도우를 제조한 후 미생물학적 및 이화학적 특성과 항균작용으로 인한 저장성 향상 효과를 알아보고자 한다.
따라서 본 연구에서는 우리나라 전통 발효식품인 된장으로부터 프로바이오틱 선발 기준에 적합한 균주를 검색하고, 빵에서 주로 분리되는 식중독균에 대한 항균작용을 나타내는 유산균을 분리 동정하였다. 또한 선발된 유산균으로 사워도우를 제조한 후 미생물학적 및 이화학적 특성과 항균작용으로 인한 저장성 향상 효과를 알아보고자 한다.

제안 방법

37°C에서 24시간 배양하고 난 후 배양액을 채취하여 희석한 다음 BHI agar 상에서 평판배양법을 이용하여 잔존하는 세포수를 측정하고 초기 균수에 대한 저해율(%)로 환산하였다.
37°C에서 2시간 동안 배양한 후 부착되지 않은 세포는 제거하고 부착된 세포는 trypsin-EDTA 용액으로 탈착시켜 PBS (pH 7.0)로 세척한 다음 MRS agar 평판배지 상에서 배양하여 유산균수를 측정하였다(Tuomola and Salminen, 1998).
4 N HCl (200 μl)를 첨가하여 반응을 종료하고, 흡광도(400 nm)를 측정하여 과산화수소의 함량(μg/ml)은 표준곡선으로부터 계산하였다(Gilliland, 1969).
45°C 정도로 식힌 MRS 반고체 배지(agar 1% 함유) 20 ml에 세포 현탁액 200 μl를 접종한 후 평판에 분주하고 상온에서 약 30분간 방치하여 배지를 응고시켰다.
Aminex HPX-87H (300 × 7.8 mm: Bio-Rad) 컬럼온도 35°C를 유지하였고, 이동상은 H2SO4 (5 mM)을 사용하여 0.5 ml/min의 유속으로 분석하였다.
B. cereus ATCC 11778과 S.aureus ATCC 6538은 BHI broth에 각각 접종하여 37°C, 24시간 배양한 후 배양액을 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)하여 세포만을 모으고 PBS (pH 7.0)로 2회 세척하였다.
0 × 10⁵ CFU/ml)과 일정한 농도로 맞춘 박테리오신 용액을 각각 microtiter plate well (Falcon, Franklin Lakes) 내에 첨가한 후 37°C에서 24시간 배양하였다. Microplate reader (BioTek, Inc.)를 이용하여 흡광도(600 nm)를 측정하고 박테리오신 용액 대신 PBS (pH 7.0)를 처리한 대조구에 비해 배양액의 혼탁도가 50% 저해된 최대 희석배수의 역수를 박테리오신 활성(arbitrary units, AU)으로 계산하였다.
PCR Thermal cycler (Bio-Rad Laboratories Ltd.)를 이용하여 초기 변성(94°C, 5분), 변성(94°C, 30초), 풀림(56℃, 1분), 신장(72℃, 1분) 및 연장(72℃, 5분) 과정을 통해 DNA를 증폭시켰다.
5 ml/min의 유속으로 분석하였다. Refractive index (GBC Scientific Equipement Pty Ltd.) 검출기로 220 nm의 파장에서 측정하여 표준용액의 검량곡선으로부터 유산 함량을 정량하였다(Sgouras et al., 2004). 한편, 유산균의 과산화수소 생성 여부는 Otero와 Nader-Macias (2006)의 방법에 따라 3,3′5,5′-tetramethylbenzidine (TMB)-MRS agar 평판배지 상에서 확인하였다.
0 × 10⁸CFU/ml로 조정한 다음 인공 위액과 인공 담즙액에 각각 접종한 후 37℃에서 2시간 및 3시간 동안 배양하였다. 각각의 조건에서 배양한 후 배양액을 채취하여 MRS agar 평판배지 상에서 37℃, 48시간 동안 배양한 다음 잔존하는 생균수를 측정하였다.
0) 90 ml와 혼합 균질화한 후 적당한 단계로 희석한 다음, 곰팡이와 효모의 증식을 억제하기 위해 cycloheximide 10 ppm (Merck)을 첨가한 MRS agar 배지상에서 37°C, 24시간 배양하여 생균수를 측정하였다. 또한 유산균 배양액을 접종하지 않은 대조구로부터 원료 자체에 함유된 유산균의 생균수를 조사하여 실험구에서 얻어진 균수는 이를 배제한 다음 유산균수를 나타내었다. 한편, 시료 10 g을 증류수 90 ml와 혼합 균질화한 후 pH meter (Fisher Scientific)를 이용하여 pH를 측정하였다.
분리된 균주들은 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology(Mundt, 1986)에서 서술된 방법에 따라 형태학적, 배양학적 및 생화학적 특성을 조사하였고, API 50 CHL system (bioMérieux)을 이용하여 당발효능을 확인하였다. 또한 유전자염기서열 분석을 위해 MRS broth 내에서 배양시킨 배양액으로부터 DNA extraction kit (Qiagen)를 사용하여 균주의 DNA를 추출한 후 정제하였다. DNA 증폭을 위한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 혼합물은 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)와 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) primer 50 pmole/μl, Taq DNA polymerase (5 U/μl) 0.
혼합한 반죽은 유리 용기에 담아서 온도 30°C, 상대습도 80% 하에서 24시간 동안 발효시켜 사워도우를 제조하였다. 발효 종료 후 사워도우의 유산균수, pH, 산도 및 항균물질 함량을 측정하였다. 시료 10 g을 무균적으로 채취한 후 PBS (pH 7.
발효 종료된 사워도우는 4°C에서 7일간 보관하는 동안 식중독균수의 변화를 관찰하였다.
실험균주는 1 mM TMB와 2 U/ml peroxidase가 첨가된 MRS agar 평판배지에 접종하여 혐기적인 조건 하에서 37°C, 48시간 배양하였다. 배양 후 공기 중에 20분 노출시킨 후 집락의 색깔을 관찰하여 과산화수소 생성 정도(청색, +++; 진한 갈색, ++; 연한 갈색, +; 백색, -)를 확인하였다. 실험균주 배양상등액의 항균활성 측정을 위해 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 빵의 부패에 주로 관여하는 지시균주(Bacillus cereus ATCC 11778, Staphylococcus aureus ATCC 6538)를 분양 받은 후 Brain Heart Infusion broth (BHI, Difco)에서 37°C, 24시간 배양하였다.
배양액은 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)하여 세포만을 모으고 PBS (pH 7.0)로 2회 세척한 다음 BHI broth에 세포수 1.0 × 106 CFU/ml로 맞춰 접종한 후 유산균 배양상등액5% (v/v)를 첨가하였다.
분리된 유산균과 Korean Collection for Type Cultures (KCTC)로부터 분양 받은 Saccharomyces cerevisiae KCTC 7246 효모 균주를 이용해서 Choi 등(2012)의 방법을 일부 변형하여 사워도우를 제조하였다. 선발된 유산균은 MRS broth에 접종한 다음 37°C에서 24시간 배양하였고, 효모는 Yeast Mold (YM) broth (Difco)에 접종한 후 30°C에서 24시간 배양하여 얻은 각각의 배양액은 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)하여 세포를 모은 후 PBS (pH 7.
사워도우 발효 직후 시료 10 g을 채취하여 PBS (pH 7.0) 90 ml와 혼합 균질화한 후 적당한 단계로 희석한 다음 B. cereus은 Mannitol Egg Yolk Polymyxin (MYP) agar (Difco), S. aureus는 Staphylococcus 110 medium (Difco)상에서 37°C, 48시간 배양하여 균수를 측정하였다.
사워도우 제조 시 식중독균을 인위적으로 접종하여 발효시킨 후 균수 변화를 조사하였다. B.
사워도우는 밀가루(강력분; 수분 10.5%, 조단백 16.7%, 조지방 0.9%, 조회분 1.5%) 380 g, 물 210 g, 소금 5.3 g, 설탕 11.2 g 및 유산균(1.0 × 108 CFU/g)과 효모(1.0 × 106 CFU/g) 세포 현탁액을 각각 5 g 접종하고 난 후 약 5분간 반죽기(HM3000, Brown)를 이용하여 혼합하였다.
상등액은 0.22 μm membrane filter로 여과 제균한 다음 HPLC의 이온 교환 컬럼(Aminex HPX-87 H, 300 × 7.8 mm, Bio-Rad)을 이용하여 65°C에서 0.01 M H2SO4의 이동상 유속 0.6 ml/min의 조건 하에서 분석하고 유산의 함량은 표준곡선으로부터 구하였다.
선발된 유산균은 MRS broth에 접종한 다음 37°C에서 24시간 배양하였고, 효모는 Yeast Mold (YM) broth (Difco)에 접종한 후 30°C에서 24시간 배양하여 얻은 각각의 배양액은 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)하여 세포를 모은 후 PBS (pH 7.0)로 2회 세척하고 동일한 buffer에 현탁시켰다.
세포수를 1.0 × 106 CFU/g으로 조정하여 세포 현탁액 5 g을 사워도우 원료 혼합물에 각각 접종하였다.
시료 10 g을 무균적으로 채취한 후 PBS (pH 7.0) 90 ml와 혼합 균질화한 후 적당한 단계로 희석한 다음, 곰팡이와 효모의 증식을 억제하기 위해 cycloheximide 10 ppm (Merck)을 첨가한 MRS agar 배지상에서 37°C, 24시간 배양하여 생균수를 측정하였다.
시료(10 g) 내 소수성 항균물질을 추출하기 위해 40% acetonitrite-0.1% (v/v) trifluoroacetic acid (90 ml)를 처리하고 균질화한 다음 15,000 × g, 10분간 원심분리 하였다.
실험균주는 MRS broth의 배양액으로부터 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)하여 배양상등액을 회수하고, HClO4 (1 M)을 첨가하여 단백질을 침전시키고 난 다음 0.22 μm membrane filter (Millipore Corp.)로 여과제균한 후 high-pressure liquid chromatography (HPLC, Shimadzu)로 유산 함량을 측정하였다.
실험균주의 박테리오신 생산능과 항균활성을 측정하고자 배양상등액을 준비한 후 유산의 영향을 제거하기 위해 배양상등액의 pH는 1 N NaOH를 이용하여 6.5로 맞추고 과산화수소의 영향을 배제하기 위해 catalase (1 mg/ml, Sigma-Aldrich)를 처리하였다. 그런 다음 50% (w/v) 황산암모늄을 첨가한 후 4°C에서 overnight 동안 교반하여 단백질을 침전시키고 원심분리(12,000 × g, 30분, 4°C)하여 침전물만을 회수하고 20 mM PBS (pH 6.
1% (v/v) trifluoroacetic acid (90 ml)를 처리하고 균질화한 다음 15,000 × g, 10분간 원심분리 하였다. 얻어진 침전물을 동결 건조시킨 다음 50% (v/v) 알코올(4 ml)에 용해시켜 박테리오신 용액을 제조한 다음 B.cereus ATCC 11778과 S. aureus ATCC 6538을 지시균주로 하여 앞서 언급한 microtiter plate method으로 박테리오신의 활성을 측정하였다. 이때 박테리오신을 생산하지 않는 유산균으로 제조한 사워도우를 대조구로 하여 용매에 의한 항균력은 배제한 다음 항균활성을 나타내었다.
염기배열은 DNA sequencer (ABI Prism® 3730 Avant Genetic Analyzer, Applied Biosystems)로 분석한 다음 미국립보건원 산하 생명공학정보센터(NCBI; The National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLAST(Basic Local Align Search Tool) 프로그램(version 2.0.8.)을 이용하여 염기서열의 상동성(homology)을 조사하였다.
0)로 2회 세척하였다. 인공 위액은 PBS 내에 0.3% (w/v) pepsin (Sigma-Aldrich)을 첨가하고 pH 2.5로 맞춰 제조하였고, 인공 담즙액은 PBS에 NaCl (6.58 g), KH₂PO₄ (0.66 g), KCl (0.043 g), MgCl₂ (0.17 g), CaCl₂ (0.060 g), pancreatin (2.25 g) 및 bile salts (1.5 g)를 첨가하고 난 후 pH 8.0으로 조정하여 제조하였다. 유산균 세포수는 1.
즉, 실험균은 MRS broth 내에서 37°C, 24시간 배양한 후 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)하여 세포만을 회수하고 PBS (pH 7.0)로 2회 세척한 다음 세포수를 1.0 × 107 CFU/ml로 조정하였다.
총산도는 시료에 동량의 증류수를 가하고 1% (w/v) phenolphthalein을 첨가한 다음 0.1 N NaOH 용액으로 적정하여 소비량을 측정한 후 계산[산도 (%) = (0.1 N NaOH 소비량 × 0.1 N NaOH 역가 × 0.9)/ 시료양] 하였다.
평판 위에 올린 paper disk (ø8 mm)에 항생제(ampicillin, erythromycin, kanamycin, penicillin G, streptomycin, tetracycline 및 vancomycin 각각 10 μg/ml, Sigma-Aldrich) 용액 50 μl를 loading하고 난 후 37°C, 24시간 동안 배양한 다음 disc 주변에 생성된 저해환을 관찰하여 항생제에 대한 내성을 resistant (R, 저해환 0 mm), intermediate susceptibility (I, 저해환 1–5 mm) 및 susceptibility (S, 저해환 > 5 mm)로 표시하였다.
현탁액은 4°C, 24시간 동안 동일한 buffer 내에서 투석막(molecular weight cut-off = 1,000 Da, Spectrum Medical Industries, Inc.)을 이용하여 투석시킨 후 조박테리오신 용액을 조제하였다.

대상 데이터

실험균주 배양상등액의 항균활성 측정을 위해 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 빵의 부패에 주로 관여하는 지시균주(Bacillus cereus ATCC 11778, Staphylococcus aureus ATCC 6538)를 분양 받은 후 Brain Heart Infusion broth (BHI, Difco)에서 37°C, 24시간 배양하였다.
인체 상피세포에 대한 분리균의 부착능을 측정하기 위해 Korean Cell Line Bank (KCLB)로부터 분양받은 HT-29 세포는 56°C에서 30분간 가열 처리한 10% (v/v) fetal bovine serum (FSB, Gibco), 2 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate, 100 U/ml penicillin 및 0.1 mg/ml streptomycin을 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle’s minimal essential medium (DMEM, Sigma-Aldrich)에 접종하고 37°C, 5% CO2조건 하에서 배양하였다.

데이터처리

Data are means ± standard deviation from triplicate determinations and means with the different letters in the same column are significantly different (P < 0.05) as determined by Duncan’s multiple range test.
Data are means ± standard deviation from triplicate determinations and means with the different letters in the same row are significantly different (P < 0.05) as determined by Duncan’s multiple range test.
항목별 총 3회 실험하여 얻어진 측정값은 평균±표준편차로 나타내었고, Statistical Package for Social Science (SPSS)을 이용하여 유의수준은 P < 0.05에서 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)의 Duncan's multiple range test를 통해 각 군별 유의성을 검증하였다.

이론/모형

)을 이용하여 투석시킨 후 조박테리오신 용액을 조제하였다. 박테리오신 용액의 항균활성은 Hole 등(1991)에 의한 microtiter plate method로 측정하였다. 즉, 앞서 언급한 지시균주는 BHI broth 내에서 37°C, 24시간 배양 후 원심분리(7,000 × g, 10 분, 4°C)하여 세포만을 모아 PBS (pH 7.
분리된 균주들은 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology(Mundt, 1986)에서 서술된 방법에 따라 형태학적, 배양학적 및 생화학적 특성을 조사하였고, API 50 CHL system (bioMérieux)을 이용하여 당발효능을 확인하였다.
분리된 유산균의 항생제에 대한 내성은 Bauer 등(1966)의 disc diffusion method에 따라 측정하였다. 즉, 실험균은 MRS broth 내에서 37°C, 24시간 배양한 후 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)하여 세포만을 회수하고 PBS (pH 7.
9)/ 시료양] 하였다. 사워도우 내 함유된 유산 함량은 Shah와 Ravula (2002)의 방법에 따라 측정하였다. 시료(1 g)에 15.
4 N HCl (200 μl)를 첨가하여 반응을 종료하고, 흡광도(400 nm)를 측정하여 과산화수소의 함량(μg/ml)은 표준곡선으로부터 계산하였다(Gilliland, 1969). 사워도우 내의 박테리오신 함량은 Settanni 등(2005)의 방법에 따라 측정하였다. 시료(10 g) 내 소수성 항균물질을 추출하기 위해 40% acetonitrite-0.
한편, 유산균의 과산화수소 생성 여부는 Otero와 Nader-Macias (2006)의 방법에 따라 3,3′5,5′-tetramethylbenzidine (TMB)-MRS agar 평판배지 상에서 확인하였다.

성능/효과

재래식 발효 된장으로부터 분리된 유산균의 형태학적 및 배양학적 특성과 당 발효능 및 염기배열분석을 통한 동정 결과는 Table 1과 같다. 1% CaCO₃가 첨가된 MRS agar 평판배지상에서 투명환을 생성하는 균주를 유산균으로 간주하고 그람 염색한 결과 모두 그람양성 세균이었으며, SBP12, SBP20, SBP37, SBP41 및 SBP58은 구균이었으나, SBP33, SBP49 및 SBP55는 간균의 형태를 나타내었다. 한편, SBP20, SBP37 및 SBP41은 catalase를 생성하지 못한 반면, 그 외의 균주들은 catalase 양성반응을 나타내었다.
HT-29 세포에 대한 부착능을 측정한 결과, SBP33, SBP49 및 SBP55의 균수는 10⁷CFU/ml 이상 부착되어 다른 균주들에 비해 유의하게 높은 부착능을 나타내었다. 7종의 항생제에 대한 저항성을 확인한 결과, SBP12와 SBP41 균주는 ampicillin 과 kanamycin을 제외한 비교적 많은 종류들의 항생제에 저해되었다. 반면, SBP20과 SBP33은 공통적으로 erythromycin, kanamycin 및 vancomycin에 대해 저항하였으며, SBP37, SBP55 및 SBP58은 5종 이상의 항생제에 저항성이 높게 나타났다.
SBP20, SBP37 및 SBP49 균주는 bile salts 존재 하에서 3시간 동안 초기 균수를 거의 유지할 수 있었던 반면, SBP12, SBP41 및 SBP58의 생균수는 2 log cycle 이상 감소되었다. HT-29 세포에 대한 부착능을 측정한 결과, SBP33, SBP49 및 SBP55의 균수는 10⁷CFU/ml 이상 부착되어 다른 균주들에 비해 유의하게 높은 부착능을 나타내었다. 7종의 항생제에 대한 저항성을 확인한 결과, SBP12와 SBP41 균주는 ampicillin 과 kanamycin을 제외한 비교적 많은 종류들의 항생제에 저해되었다.
reuteri 등이 있다(Ali, 2010). P. pentosaceus SW01과 P. acidilactici SW05는 HT-29 세포에 65% 이상 부착 되어 SBP20과 SBP41 보다 다소 높은 부착능을 보여준 반면, 오메기술로부터 분리된 총 7종의 유산균 중에서 L. pentosus SW02의 부착능이 53.96%로 가장 낮았다고 하였는데 본 연구 에서 보여준 Lactobacillus속들은 이보다는 높은 부착능을 나타내었다. 이와 같이 Lactobacillus속들의 부착능은 균종과 매트릭스에 의존한다고 보고된 바 있다(Oh and Jung, 2015).
분리 동정된 균주들의 프로바이오틱 유산균으로서의 적합성을 확인하기 위해 인공 위액과 담즙액 내에서의 생존율, HT-29 세포에 대한 부착율 및 항생제에 대한 저항성을 조사한 결과는 Table 2와 같다. Pepsin이 첨가된 pH 2.5 하에서 초기 균수 10⁸CFU/ml을 37^oC, 2시간 배양한 결과, P. halophilus SBP20, L. fermentum SBP33, L. brevis SBP49 및 L. acidophilusSBP55 균주는 10⁶CFU/ml 이상의 균수가 생존하여 위액에 대한 저항성이 높았다. 반면, E.
재래식 된장으로부터 분리된 유산균은 형태학적, 생화학적 특성과 당 발효능 및 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 Enterococcus faecium SBP12, Pediococcus halophilus SBP20, Lactobacillus fermentum SBP33, Leuconostoc mesenteroides SBP37, Pediococcus pentosaceus SBP41, Lactobacillus brevis SBP49, Lactobacillus acidophilus SBP55 및 Enterococcus faecalis SBP58로 동정되었다. SBP20, SBP33, SBP49와 SBP55 균주는 인공 위액과 담즙액 내에서 6 log cycle 이상 생균수를 유지하였으나, SBP12와 SBP58은 낮은 pH 하에서 2시간만에 균수가 급격하게 감소되었다. 특히, SBP49와 SBP55는 HT-29 세포에 대한 부착능이 높고, 항생제에 대한 저항성이 크며, Bacillus cereus ATCC 11778과 Staphylococcus aureus ATCC 6538의 식중독균에 대한 항균활성을 나타내었으므로, 이 두 균주는 프로바이오틱 선발 기준에 적합한 것으로 추정 된다.
faecalis SBP58 균주들은 10⁵CFU/ml 이하의 균수가 검출되어 저항성이 비교적 낮게 나타났다. SBP20, SBP37 및 SBP49 균주는 bile salts 존재 하에서 3시간 동안 초기 균수를 거의 유지할 수 있었던 반면, SBP12, SBP41 및 SBP58의 생균수는 2 log cycle 이상 감소되었다. HT-29 세포에 대한 부착능을 측정한 결과, SBP33, SBP49 및 SBP55의 균수는 10⁷CFU/ml 이상 부착되어 다른 균주들에 비해 유의하게 높은 부착능을 나타내었다.
게다가 SBP49와 SBP55를 이용하여 사워도우를 제조한 결과, 발효 직후 도우 내 pH, 산도 및 유산균수에는 유의한 차이가 없었으나, SBP49는 많은 양의 유산을 생산한 반면, SBP55는 과산화수소를 더 많이 생산하였다. SBP49와 SBP55 유산균은 유산과 과산화수소뿐만 아니라 박테리오신 등의 항균물질을 생산하므로 사워도우 내 존재하는 식중독균 저해에 효과적이었다.
lactis ssp. lactis M30 은 lacticin 3147이라는 박테리오신을 생산하는 것으로 확인되었고, 이 균주를 사워도우 제조 시 이용한 결과, 80 AU/ml의 박테리오신으로 L. plantarum 20의 증식을 억제할 수 있었던 반면, L. lactis Q13의 사워도우 스타터의 증식에는 아무런 영향을 미치지 않았다. 한편, SBP37, SBP49, SBP55 및 SBP58 균주들이 사워도우 내에 생산한 박테리오신은 친수성 용매 보다는 유기 용매에서 활성이 나타났으므로 이들은 소수성 박테리오신으로 추정되며, Kawai 등(1994)도 Lactobacillus gasseri LA39가 소수성이 강한 박테리오신(gassericin A)을 생산한다고 보고한 바 있다.
39로 감소되었고, 산도는 12시간 후부터 급격하게 증가되었다. pH는 20시간 이후부터 거의 일정하게 유지되었으나, 산도는 26 시간까지 꾸준하게 증가되었다. 유산균 초기 균수 6.
특히, SBP49와 SBP55는 HT-29 세포에 대한 부착능이 높고, 항생제에 대한 저항성이 크며, Bacillus cereus ATCC 11778과 Staphylococcus aureus ATCC 6538의 식중독균에 대한 항균활성을 나타내었으므로, 이 두 균주는 프로바이오틱 선발 기준에 적합한 것으로 추정 된다. 게다가 SBP49와 SBP55를 이용하여 사워도우를 제조한 결과, 발효 직후 도우 내 pH, 산도 및 유산균수에는 유의한 차이가 없었으나, SBP49는 많은 양의 유산을 생산한 반면, SBP55는 과산화수소를 더 많이 생산하였다. SBP49와 SBP55 유산균은 유산과 과산화수소뿐만 아니라 박테리오신 등의 항균물질을 생산하므로 사워도우 내 존재하는 식중독균 저해에 효과적이었다.
9%로 측정되었다. 게다가 유산균 단독 배양 시유산의 생산량을 측정한 결과, E. faecium은 0.04 mM/g, L.sanfranciscensis, L. brevis 및 L. paralimentarius는 0.09 mM/g 정도였으며, 효모와의 혼합 배양 시 유산의 생산량은 대부분의 유산균에 의해 유의한 변화가 없었으나, S. cerevisiae와 L.paralimentarius의 혼합 배양 시에는 다소 증가되어 0.11 mM/g으로 나타났다. Torulopsis holmill은 L.
과산화수소의 함량을 측정했을 때 SBP55에 의해 발효시킨 경우 11.9 ± 0.4 μg/ml로 가장 높게 나타났으며, SBP33과 SBP49에 의해 발효된 경우는 이보다 다소 낮게 나타났다.
하지만 SBP41은 erythromycin을 제외하고 대부분의 항생제에 민감한 것으로 나타났다. 따라서 된장에서 분리된 총 8종의 유산균 중 프로바이오틱 균주로서는 L. brevis SBP49와 L. acidophilus SBP55가 선발 기준을 충족하는 것으로 확인되었다.
sanfranciscensis ACA-DC 3366의 증식 속도는 유의하게 증가하였다. 또한 E. faecium ACA-DC 3397 과 Lactobacillus paralimentarius ACA-DC 3414는 혼합 배양시 유산균의 증식이 단독 배양에 비해 다소 감소되었고, W. cibaria ACA-DC 3385와 P. pentosaceus ACA-DC 3391의 증식에는 유의할 만한 변화가 없었다. 한편, 사워도우 원료 혼합후 초기 pH와 산도는 각각 5.
aureus에 대해서 각각 64 AU/g과 16 AU/g으로 나타났고, SBP49에 의해 발효된 경우는 각각 256 AU/g 과 16 AU/g으로 나타났다. 또한 SBP55에 의해 생성된 박테리오신은 지시균주 모두에 대해 128 AU/g의 활성을 나타내었고, SBP58 균주의 박테리오신은 S. aureus에 대해 저해 효과를 나타내지 않았으나, B. cereus에 대해선 32 AU/g의 활성을 나타내었다. 이상과 같은 결과에서 볼 때, 사워도우 발효에 이용한 경우 유산균수가 많을수록 pH는 낮고, 산도는 높았으며, 생성된 항균물질의 양도 유의하게 높았다.
acidophilusSBP55 균주는 10⁶CFU/ml 이상의 균수가 생존하여 위액에 대한 저항성이 높았다. 반면, E. faecium SBP12, L. mesenterodies SBP37, P. pentosaceus SBP41, E. faecalis SBP58 균주들은 10⁵CFU/ml 이하의 균수가 검출되어 저항성이 비교적 낮게 나타났다. SBP20, SBP37 및 SBP49 균주는 bile salts 존재 하에서 3시간 동안 초기 균수를 거의 유지할 수 있었던 반면, SBP12, SBP41 및 SBP58의 생균수는 2 log cycle 이상 감소되었다.
7종의 항생제에 대한 저항성을 확인한 결과, SBP12와 SBP41 균주는 ampicillin 과 kanamycin을 제외한 비교적 많은 종류들의 항생제에 저해되었다. 반면, SBP20과 SBP33은 공통적으로 erythromycin, kanamycin 및 vancomycin에 대해 저항하였으며, SBP37, SBP55 및 SBP58은 5종 이상의 항생제에 저항성이 높게 나타났다. 하지만 SBP41은 erythromycin을 제외하고 대부분의 항생제에 민감한 것으로 나타났다.
발효 전 사워도우의 pH는 6.02–6.28, 산도는 0.25–0.42%이었으나(결과 미제시), 발효 종료 후 균수가 109CFU/g 이상 검출된 균주의 사워도우 pH는 4.00 이하로 나타났고 산도는 1.0% 이상으로 측정되었다.
특히 위산이나 담즙산염 및 항생제에 대한 내성이 강하고 장내 상피세포에 대한 부착능이 높으며 다양한 항균물질 생산으로 인해 광범위한 항균 스펙트럼을 나타내는 프로바이오틱 유산균을 이용한다면 그 이용가치는 더욱 더 높아질 것이다. 본 연구에서는 프로 바이오틱 균주로의 이용 가능성이 높은 L. brevis SBP49와 L.acidophilus SBP55를 스타터로 활용한 경우 사워도우 내 높은 산도와 박테리오신을 생산함으로써 빵에서 주로 유래하는 식중독균인 B. cereus와 S. aureus를 제어하는데 효과적임을 확인하였다.
한편, SBP20, SBP37 및 SBP41은 catalase를 생성하지 못한 반면, 그 외의 균주들은 catalase 양성반응을 나타내었다. 분리된 8균주들의 정확한 동정을 위해 API 50 CHL kit를 이용하여 당 발효능과 16S rRNA sequencing을 조사한 결과, Enterococcus faecium SBP12, Pediococcus halophilus SBP20, Lactobacillus fermentum SBP 33, Leuconostoc mesenteroides SBP37, Pediococcus pentosaceus SBP41, Lactobacillus brevis SBP49, Lactobacillusacidophilus SBP55 및 Enterococcus faecalis SBP58로 동정되었다.
분리된 유산균을 이용하여 사워도우를 제조한 다음 발효 종료 후 도우 내 유산균수, pH, 산도 및 항균물질의 함량을 측정한 결과는 Table 4와 같다. 사워도우 1g당 P. halophilusSBP20, L. fermentum SBP33, L. mesenteroides SBP37, P.pentosaceus SBP41, L. brevis SBP49 및 L. acidophilus SBP55의 균수는 10⁹CFU인 반면, E. faecium SBP12와 E. faecalis SBP58의 균수는 10⁸CFU으로 나타났다. 발효 전 사워도우의 pH는 6.
0% 이상으로 측정되었다. 사워도우 내 유산의 함량은 SBP20 및 SBP49로 발효시킨경우 100 mM 이상 검출되어 다른 균주가 생산한 양보다 유의 하게 높았다. 과산화수소의 함량을 측정했을 때 SBP55에 의해 발효시킨 경우 11.
사워도우 제조 직후 B. cereus 에 대한 항균력은 L. brevis SBP49에 의해 47.2 ± 3.3%로 가장 높게 나타났으며, E. faecalis SBP58에 의해선 30.1 ± 5.1%, L.acidophilus BP55에 의해선 25.8 ± 4.0%로 저해되었다.
실험 균주 중 L. acidophilus SBP55는 가장 많은 양의 유산(134.6±5.8 mM)을 생성하였고, P. halophilus SBP20과 L.brevis SBP49도 120 mM 이상의 유산을 생성하였다.
유산균의 배양액으로부터 얻은 배양상등액 내에 함유된 항균물질에 의한 B. cereus와 S. aureus의 저해율을 조사한 결과, SBP49, SBP55 및 SBP58의 배양상등액 5% 처리에 의해 B. cereus 균수를 16.9–32.1% 감소시켰으나, SBP12, SBP20, SBP33 및 SBP41의 배양상등액에 의해선 10% 이하의 저해율을 나타내었다.
cereus에 대해선 32 AU/g의 활성을 나타내었다. 이상과 같은 결과에서 볼 때, 사워도우 발효에 이용한 경우 유산균수가 많을수록 pH는 낮고, 산도는 높았으며, 생성된 항균물질의 양도 유의하게 높았다. 하지만 항균물질의 생산량과 항균활성은 MRS broth의 배양액으로부터 얻어진 양보다는 다소 적게 나타났으며, 이에 따라 항균활성도 비교적 낮은 것으로 확인되었다.
재래식 된장으로부터 분리된 유산균은 형태학적, 생화학적 특성과 당 발효능 및 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 Enterococcus faecium SBP12, Pediococcus halophilus SBP20, Lactobacillus fermentum SBP33, Leuconostoc mesenteroides SBP37, Pediococcus pentosaceus SBP41, Lactobacillus brevis SBP49, Lactobacillus acidophilus SBP55 및 Enterococcus faecalis SBP58로 동정되었다. SBP20, SBP33, SBP49와 SBP55 균주는 인공 위액과 담즙액 내에서 6 log cycle 이상 생균수를 유지하였으나, SBP12와 SBP58은 낮은 pH 하에서 2시간만에 균수가 급격하게 감소되었다.
aureus 의 증식을 억제할 수 있는 박테리오신을 생성하지 못했으나, SBP37, SBP49 및 SBP55는 이들 지시균주에 대한 항균활성을 나타내는 박테리오신을 생산하였다. 특히 B. cereus에 대하여 SBP49의 박테리오신 활성은 512 AU/ml로 가장 높았고, SBP55와 SBP58의 박테리오신 활성도 각각 128 AU/ml와 256 AU/ml로 나타났다. S.
이상과 같은 결과에서 볼 때, 사워도우 발효에 이용한 경우 유산균수가 많을수록 pH는 낮고, 산도는 높았으며, 생성된 항균물질의 양도 유의하게 높았다. 하지만 항균물질의 생산량과 항균활성은 MRS broth의 배양액으로부터 얻어진 양보다는 다소 적게 나타났으며, 이에 따라 항균활성도 비교적 낮은 것으로 확인되었다.
한편, 4°C에서 7일간 저장하는 동안 B. cereus 와 S. aureus의 균수는 유의한 변화 없이 거의 일정하게 유지되었다.
4 μg/ml로 가장 높게 나타났으며, SBP33과 SBP49에 의해 발효된 경우는 이보다 다소 낮게 나타났다. 한편, SBP37로 발효시킨 사워도우 내 박테리오신의 활성은 B. cereus와 S. aureus에 대해서 각각 64 AU/g과 16 AU/g으로 나타났고, SBP49에 의해 발효된 경우는 각각 256 AU/g 과 16 AU/g으로 나타났다. 또한 SBP55에 의해 생성된 박테리오신은 지시균주 모두에 대해 128 AU/g의 활성을 나타내었고, SBP58 균주의 박테리오신은 S.
, 2008). 한편, 김치로부터 분리된 Leuconostoc citreum HO12와 Weissella koreensis HO20을 이용하여 사워도우를 제조한결과, 발효 초기 pH 6.38에서부터 24시간 발효 직후 pH 4.39로 감소되었고, 산도는 12시간 후부터 급격하게 증가되었다. pH는 20시간 이후부터 거의 일정하게 유지되었으나, 산도는 26 시간까지 꾸준하게 증가되었다.
aureus에 대해선 SBP37의 박테리오신 활성은 32 AU/ml이고 SBP49는 64 AU/ml로 나타났는데 SBP55의 박테리오신 활성(256 AU/ml)은 이들 보다 더 높게 나타났다. 한편, 박테리오신을 생산하는 유산균은 사워도우 제조에 이용되는 S. cerevisiae KCTC 7246에 대해선 항균활성을 나타내지 않았다(결과 미제시).
pentosaceus ACA-DC 3391의 증식에는 유의할 만한 변화가 없었다. 한편, 사워도우 원료 혼합후 초기 pH와 산도는 각각 5.99와 1.4%였고, 효모 단독 배양시의 pH와 산도는 4.86과 2.4%로 나타났다. 하지만 유산균과 혼합 배양 시 pH는 급격하게 감소하여 3.

후속연구

화학적합성품의 보존료를 과량 사용하게 되면 독성 유발 가능성이 높으므로 부패에 관여하는 유해세균을 제어할 수 있는 유산균 으로 사워도우를 제조하여 제빵에 이용할 경우 부패균의 증식을 막아 저장성을 향상시킬 수 있을 것이다. 특히 위산이나 담즙산염 및 항생제에 대한 내성이 강하고 장내 상피세포에 대한 부착능이 높으며 다양한 항균물질 생산으로 인해 광범위한 항균 스펙트럼을 나타내는 프로바이오틱 유산균을 이용한다면 그 이용가치는 더욱 더 높아질 것이다. 본 연구에서는 프로 바이오틱 균주로의 이용 가능성이 높은 L.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	프로바이오틱 유산균이 인체에 주는 효능은?	프로바이오틱 균주로서는 건강에 유익한 것으로 널리 알려진 Lactobacillus, Streptococcus 및 Bifidobacterium 속 유산균 들이 대부분이다. 프로바이오틱 유산균은 장내 유익한 정상 균총으로서 만성복통, 설사 및 변비 완화 등의 정장 작용이 탁월하며, 아토피 피부염이나 알레르기 질환 제어에도 효과적인 것으로 보고되고 있다(Soccol et al., 2010).
	프로바이오틱이란?	프로바이오틱(probiotic)은 우리 몸의 면역기능을 강화하고 항균물질 생산을 통해 대장 내에 염증이나 가스를 생산하는 유해 세균과 세포의 노화를 유발하는 활성산소와 혈관을 좁혀 심혈관계 질환을 유발하는 나쁜 콜레스테롤(Low Density Lipoprotein, LDL) 및 암 세포의 증식을 유발하는 돌연변이원 등을 제거할 수 있는 유익균으로써 장 기능을 개선시켜 건강을 이롭게 하는 살아있는 미생물, 일명 생균제이다(Fuller, 1989). 프로바이오틱 선발기준으로는 균주 자체가 독성이나 병원성을 나타내지 않는 안전성이 가장 우선 확보되어야 하고, 체내에 유입되어 위산이나 담즙 및 항생제에 대해 저항하여 활성을 유지한 채로 장에 도달해야 한다.
	프로바이오틱 균주로 선발되기 위해서는 어떤 조건이 충족되어야 하는가?	프로바이오틱(probiotic)은 우리 몸의 면역기능을 강화하고 항균물질 생산을 통해 대장 내에 염증이나 가스를 생산하는 유해 세균과 세포의 노화를 유발하는 활성산소와 혈관을 좁혀 심혈관계 질환을 유발하는 나쁜 콜레스테롤(Low Density Lipoprotein, LDL) 및 암 세포의 증식을 유발하는 돌연변이원 등을 제거할 수 있는 유익균으로써 장 기능을 개선시켜 건강을 이롭게 하는 살아있는 미생물, 일명 생균제이다(Fuller, 1989). 프로바이오틱 선발기준으로는 균주 자체가 독성이나 병원성을 나타내지 않는 안전성이 가장 우선 확보되어야 하고, 체내에 유입되어 위산이나 담즙 및 항생제에 대해 저항하여 활성을 유지한 채로 장에 도달해야 한다. 또한 대장 상피세포에 부착하여 항균물질을 생산함으로써 유해세균의 부착과 증식을 억제할 수 있어야 하고, 항암, 항콜레스테롤 및 항산화등 건강을 이롭게 하는 각종 생리활성을 발휘할 수 있어야 하며, 발효식품이나 건강보조식품 및 의약품에 적용될 때에도 활성과 기능성이 안정하게 유지될 수 있어야 한다(Saarela et al., 2000).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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