Streptomyces sp. A75 and A501 inhibited the mycelial growth of pathogenic Rhizoctonia solani and Pythium sp., which cause the ginseng disease known as damping-off. Three methods were evaluated for the control of these pathogens, using a mixture of the culture broths from Streptomyces sp. A75 and A50...
Streptomyces sp. A75 and A501 inhibited the mycelial growth of pathogenic Rhizoctonia solani and Pythium sp., which cause the ginseng disease known as damping-off. Three methods were evaluated for the control of these pathogens, using a mixture of the culture broths from Streptomyces sp. A75 and A501. The methods tested were seed dipping with 50-fold diluted broth, drenching of soil with 100-fold diluted broth after sowing, and combined seed dipping and drenching. These methods reduced the incidence of ginseng damping-off caused by R. solani by 81.3%, 84.8%, and 32.2% and that caused by Pythium sp. by 51.0%, 52.1%, and 75.3%, respectively. Based on these results, the combination of seed dipping and soil drenching after sowing using a mixture of the culture broths from Streptomyces sp. A75 and A501 effectively reduced the incidence of damping-off in ginseng.
Streptomyces sp. A75 and A501 inhibited the mycelial growth of pathogenic Rhizoctonia solani and Pythium sp., which cause the ginseng disease known as damping-off. Three methods were evaluated for the control of these pathogens, using a mixture of the culture broths from Streptomyces sp. A75 and A501. The methods tested were seed dipping with 50-fold diluted broth, drenching of soil with 100-fold diluted broth after sowing, and combined seed dipping and drenching. These methods reduced the incidence of ginseng damping-off caused by R. solani by 81.3%, 84.8%, and 32.2% and that caused by Pythium sp. by 51.0%, 52.1%, and 75.3%, respectively. Based on these results, the combination of seed dipping and soil drenching after sowing using a mixture of the culture broths from Streptomyces sp. A75 and A501 effectively reduced the incidence of damping-off in ginseng.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 환경친화적 안전 인삼모를 생산하기 위하여 사용한 방선균 균주가 인삼에 발생하는 잘록병균에 대한 생육억제 효과와 인삼 잘록병에 대한 방제 효과 검정을 실시하였다.
제안 방법
QIAamp DNA mini kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 16S rRNA 유전자는 범용 프라이머인 27F와 1492R을 사용 하여 PCR한 후 각각 유전자의 증폭산물을 얻었다[20]. 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석은 3개의 프라이머(518F; CCAGCAGCCGCGGTAATACG, 800R; TACCAGGGTATCTAATCC, 984F; ACGCGARGAACCTTAC)를 이용하여 분석하도록 제노텍(Geno-Tech, Daejeon, Korea)에 의뢰하였다.
16S rRNA 유전자는 범용 프라이머인 27F와 1492R을 사용 하여 PCR한 후 각각 유전자의 증폭산물을 얻었다[20]. 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석은 3개의 프라이머(518F; CCAGCAGCCGCGGTAATACG, 800R; TACCAGGGTATCTAATCC, 984F; ACGCGARGAACCTTAC)를 이용하여 분석하도록 제노텍(Geno-Tech, Daejeon, Korea)에 의뢰하였다. 얻어진 염기서열은 SeqMan (DNASTAR, Madison, WI, USA)을 이용하여 직접 오류를 검정하고 연결하였다.
선발 균주는 GYM (glucose 4 g, yeast extract 4 g, malt extract 10 g, CaCO3 2 g, agar 12 g/L) 배지에 치상하여 28ºC에서 48시간 이상 배양한 후 원심분리하여 균체를 수확하였다. QIAamp DNA mini kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 16S rRNA 유전자는 범용 프라이머인 27F와 1492R을 사용 하여 PCR한 후 각각 유전자의 증폭산물을 얻었다[20].
계통분석을 하기 위해서 표준균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 EzTaxon-e 서버를 통해서 얻었다[21]. 계통도의 작성을 위해 MEGA 5.0 프로그램의 Clustal W 프로그램으로 염기서열을 정렬하였으며, Neighbor-joining 알고리즘을 사용하고 1,000회 반복 bootstraping을 통해 계통도의 신뢰성을 확인하였다[22].
균주는 방제 효과 검정을 위하여 PDA에서 25ºC에서 5일간 배양한 후에 각 균주의 균총을 떼어내어 2회 멸균한 보리배지에 접종하여 25ºC에서 2주간 배양 후 접종원으로 사용하였다.
균주를 PDA 배지에 이식 후 28ºC에서 5일간 배양하여 직경 5 mm인 코르크보러를 이용하여 병원균의 균총을 PDA 배지가 분주된 일회용 페트리디쉬 중앙에 치상하였다.
균총을 직경 5 mm인 코르크보러를 이용하여 균총을 PDA 배지가 분주된 I 플레이트에 치상하여 25ºC에서 3일간 배양한 후 조사하였다.
종자 침지처리는 방선균 A75와 A501 균주를 GSS 배지에서 7일간 배양한 각각의 배양액을 10배와 20배로 희석하여 인삼 개갑종자를 1시간 침지한 후 파종하였다. 그리고 관주처리는 인삼 개갑종자를 파종 직후 균주별 배양액을 10배와 20배로 희석하여 주당 10 mL씩 7일 간격 3회 관주처리하였다. 모든 처리에서 병원균의 접종은 병원균 R.
또한 관주 처리구는 인삼 개갑종자를 어상자에 파종한 직후 2균주의 배양한 혼합액을 100배로 희석하여 주당 10 mL씩 처리하였고, 20일후에 7일 간격 3회 관주처리하였다. 그리고 종자 침지처리와 관주처리한 혼합 처리구는 종자를 배양한 혼합액 50배로 침지처리하여 파종한 직후에 배양한 혼합액을 100배로 희석하여 주당 10 mL씩 관주처리하였으며, 20일 후에 7일 간격 3회 관주처리하였다. 병원균의 접종은 병원균을 각각 배양한 보리를 인삼종자 파종 20일 후에 상자당 0.
종자침지 처리구는 방선균 A75와 A501 균주의 혼합한 배양액을 50배로 희석하여 개갑종자를 1시간 침지하여 어상자에 파종하였다. 또한 관주 처리구는 인삼 개갑종자를 어상자에 파종한 직후 2균주의 배양한 혼합액을 100배로 희석하여 주당 10 mL씩 처리하였고, 20일후에 7일 간격 3회 관주처리하였다. 그리고 종자 침지처리와 관주처리한 혼합 처리구는 종자를 배양한 혼합액 50배로 침지처리하여 파종한 직후에 배양한 혼합액을 100배로 희석하여 주당 10 mL씩 관주처리하였으며, 20일 후에 7일 간격 3회 관주처리하였다.
방선균 A75와 A501 균주를 MBA 평판배지에 배양하여 루프를 이용하여 방선균을 떼어내어 PDA 배지가 분주된 일회용 페트리디쉬에 3개소에 치상하여 28ºC 항온기에서 7일간 배양 후 저지원의 직경을 조사하였다.
방선균 동정을 위해 16S rRNA 유전자를 바탕으로 MEGA5 프로그램을 이용하여 분자유전학적인 계통도를 작성하였다(Fig. 3). 16S rRNA 유전자를 바탕으로 작성한 계통도에서 A75 균주는 Streptomyces yatensis NBRC 101000(T)와 99.
그리고 종자 침지처리와 관주처리한 혼합 처리구는 종자를 배양한 혼합액 50배로 침지처리하여 파종한 직후에 배양한 혼합액을 100배로 희석하여 주당 10 mL씩 관주처리하였으며, 20일 후에 7일 간격 3회 관주처리하였다. 병원균의 접종은 병원균을 각각 배양한 보리를 인삼종자 파종 20일 후에 상자당 0.5 g/상자씩 접종하여, 인삼종자의 발아와 잘록병 발생은 병원균 접종 42일 후에 조사하였다.
선발 균주는 GYM (glucose 4 g, yeast extract 4 g, malt extract 10 g, CaCO3 2 g, agar 12 g/L) 배지에 치상하여 28ºC에서 48시간 이상 배양한 후 원심분리하여 균체를 수확하였다.
선발 균주의 동정은 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 선발 균주는 GYM (glucose 4 g, yeast extract 4 g, malt extract 10 g, CaCO3 2 g, agar 12 g/L) 배지에 치상하여 28ºC에서 48시간 이상 배양한 후 원심분리하여 균체를 수확하였다.
16S rRNA 유전자의 염기서열 분석은 3개의 프라이머(518F; CCAGCAGCCGCGGTAATACG, 800R; TACCAGGGTATCTAATCC, 984F; ACGCGARGAACCTTAC)를 이용하여 분석하도록 제노텍(Geno-Tech, Daejeon, Korea)에 의뢰하였다. 얻어진 염기서열은 SeqMan (DNASTAR, Madison, WI, USA)을 이용하여 직접 오류를 검정하고 연결하였다. 계통분석을 하기 위해서 표준균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 EzTaxon-e 서버를 통해서 얻었다[21].
solani 와 Pythium sp.을 각각 배양한 보리를 상자당 0.5 g/상자 접종하였고, 접종 4주 후에 이병주를 조사하였다.
종자 침지처리는 방선균 A75와 A501 균주를 GSS 배지에서 7일간 배양한 각각의 배양액을 10배와 20배로 희석하여 인삼 개갑종자를 1시간 침지한 후 파종하였다. 그리고 관주처리는 인삼 개갑종자를 파종 직후 균주별 배양액을 10배와 20배로 희석하여 주당 10 mL씩 7일 간격 3회 관주처리하였다.
방선균 A75와 A501 균주를 GSS배지에서 7일간 배양한 각각의 배양액을 1:1 (v/v)로 혼합하여 사용하였다. 종자침지 처리구는 방선균 A75와 A501 균주의 혼합한 배양액을 50배로 희석하여 개갑종자를 1시간 침지하여 어상자에 파종하였다. 또한 관주 처리구는 인삼 개갑종자를 어상자에 파종한 직후 2균주의 배양한 혼합액을 100배로 희석하여 주당 10 mL씩 처리하였고, 20일후에 7일 간격 3회 관주처리하였다.
대상 데이터
균주는 원예특작과학원 인삼과로부터 분양받아서 10ºC 항온기에 potato dextrose agar (PDA) 사면배지로 보관하면서 사용하였다.
균주의 배양은 PDA 배지에 배양한 후 보리배지에 균총을 이식하여 25ºC에서 15일간 배양하여 접종원으로 사용하였다. 방선균 A75와 A501 균주를 GSS 배지에서 7일간 배양한 배양액을 사용하였다.
방선균 A75와 A501 균주를 GSS배지에서 7일간 배양한 각각의 배양액을 1:1 (v/v)로 혼합하여 사용하였다. 종자침지 처리구는 방선균 A75와 A501 균주의 혼합한 배양액을 50배로 희석하여 개갑종자를 1시간 침지하여 어상자에 파종하였다.
충남 계룡산의 토양에서 분리하여 식물병원균에 항균력 있는 방선균 A75와 A501 균주는 전북대로부터 분양받았으며, modified Bennett’s agar (MBA, glucose 5 g, soluble starch 5 g, malt extract 1 g, yeast extract 1 g, N-Z amine 1 g, agar 15 g/L) 배지에서 배양한 다음 10ºC에 보관하면서 계대배양하여 사용하였다.
데이터처리
a)In a column, means followed by a common letter are not significantly different at the 5% level by Duncan’s multiple range test.
이론/모형
얻어진 염기서열은 SeqMan (DNASTAR, Madison, WI, USA)을 이용하여 직접 오류를 검정하고 연결하였다. 계통분석을 하기 위해서 표준균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 EzTaxon-e 서버를 통해서 얻었다[21]. 계통도의 작성을 위해 MEGA 5.
성능/효과
3). 16S rRNA 유전자를 바탕으로 작성한 계통도에서 A75 균주는 Streptomyces yatensis NBRC 101000(T)와 99.9% 높은 상동성을 보였다(Fig. 3A) [23]. 계통도의 신뢰성을 확보하기 위한 Bootstrap 값도 99%로 높은 값을 나타내어 S.
에 대하여 Streptomyces sp. A75와 A501 균주의 배양액을 혼합한 50배 희석액에 종자 침지처리, 100배 희석액의 관주처리와 종자 침지처리 (50배) + 관주처리(100배)는 51.0%, 52.1%, 75.3%의 방제 효과를 각각 나타내었다. 이들 결과에서 Streptomyces sp.
이들 결과에서 Streptomyces sp. A75와 A501 균주의 배양한 혼합액으로 종자 침지한 후 관주처리가 인삼 잘록병 발생을 효과적으로 감소시켰다.
solani에 대하여 Streptomyces sp. A75와 A501균주의 배양액을 혼합한 50배 희석액에 종자 침지처리, 100배 희석액의 관주처리와 종자 침지처리(50배) + 관주처리(100배)는 81.3%, 84.8%와 32.2%의 방제 효과를 각각 나타내었다. 인삼 잘록병 Pythium sp.
3A) [23]. 계통도의 신뢰성을 확보하기 위한 Bootstrap 값도 99%로 높은 값을 나타내어 S. yatensis인 것으로 추정되었다. A501 균주는 S.
solani, Pythium spp.로 보고되어 있어 한번에 두 잘록병균을 방제하기 위하여 2개 균주의 방선균의 배양액을 같은 비율(1:1, v/v)로 혼합하여 R. solani에 대하여 처리한 결과, 방선균처리는 종자발아에 영향을 미치지 않았으며, 2균주의 배양액을 혼합한 50배 희석액을 인삼 종자 침지처리가 81.3%, 100배 희석액의 관주처리가 84.8%로 높은 방제효과를 보였으나, 종자 침지처리와 토양 관주처리를 같이 처리한 구에서는 32.3%로 방제효과가 저조하였다(Table 4, Fig. 4). Pythium sp.
에는 높은 방제 효과를 나타내었다. 미생물제 Serenade (Bacillus subtillis QST713)는 R. solani에 의한 고추와 오이의 잘록병 방제에 9배 희석하여 관주처리로 58%와 54% 방제 효과를 각각 나타내었으며, P. ultimum에 의한 고추와 오이의 잘록병을 9배 희석액으로 관주처리하여 각각 57%와 7.7% 방제 효과를 나타내었지만[15], A501균주와 A75 균주가 잘록병 방제효과가 높아서 우수한 균주라 생각되었다.
방선균주의 배양액을 희석하여 Rhizoctonia solani에 처리한 결과, A75 균주가 A501 균주보다 처리 효과가 높았으며, 인삼 종자의 침지처리가 토양에 관주처리구보다 효과적이었다. A75 균주의 배양액을 20배로 희석하여 종자침지처리가 80.
Pythium sp.에 대하여 A501 균주가 A75 균주보다 처리 효과가 높았으며, 관주처리가 종자 침지처리보다 효과적이었다. A501 균주의 배양액을 10배로 희석하여 토양 관주처리가 85.
Pythium sp.에 대해서는 종자 침지처리와 토양 관주처리가 각각 51.0%와 52.1%의 방제 효과를 나타내었고, 종자 침지처리와 토양 관주처리한 혼합 처리구에서는 75.3%로 방제효과를 보였다(Table 5, Fig. 5). 이상의 결과를 요약하면, 방선균 2균주의 배양액을 혼합액은 R.
solani에 의한 잘록병은 종자 침지 또는 토양 관주, Pythium sp.에 의한 잘록병은 종자 침지와 토양 관주 처리를 혼합 처리한 것이 75~84.8%의 방제효과를 나타내어 Woo 등[16]의 방선균 A3265의 배양액에 종자 침지처리하여 음건한 종자를 파종한 시기에 따라서 인삼 잘록병이 1.0~6.3%, 무처리가 4.5~19.2% 발병하여 67.2~77.8% 방제 효과로 이 방선균주보다 방제효과가 높았다. 또한 Cho 등[15]에 의하면 R.
후속연구
계통도의 신뢰성을 확보하기 위한 Bootstrap 값도 100%로 높은 값을 나타내며, 높은 항균활성을 나타내는 것을 볼 때 항선충 및 항균 활성을 가진 것으로 알려진 S. costaricanus일 것으로 추정되나 정확한 동정을 하기 위해서 높은 염기서열의 상동성을 보이는 4균주와의 생리 · 생화학적인 분석이 추후 필요하다고 판단된다[24].
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
인삼에 발생하는 잘록병의 병원균은 무엇인가?
인삼은 두릅나무과에 속하는 다년생작물로서 약용으로 사포닌 성분인 진세노사이드에 관련된 약리 성분이 있어 원기를 보하고 신체허약, 권태, 피로, 식욕부진, 구토, 설사에 쓰이며, 면역력 증강이나 노화예방 등으로 사용되고 있다[1-5]. 인삼에 발생하는 잘록병은 병원균이 Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, P. debaryanum으로 보고되어 있다[6].
인삼에 발생하는 잘록병 병원균은 어떤 조건의 장소에서 발생하는가?
이들 병원균은 토양에 존재하는 토양전염성으로 온도가 낮고 수분이 많은 토양에서 다발생한다[7]. Rhizoctonia solani에 의한 잘록병은 4월 중하순에 시작하여 5월 상순에 걸쳐 발생하며 땅에 접한 줄기부위에 암갈색으로 마르면서 쓰러지며, 주변으로 진전은 둥글게 퍼져 나가는 발병 특징을 보이며 종자 발아 직후 어린 줄기를 침입하여 출아되지 못하는 출아전 잘록병과 출아후 마르면서 쓰러지는 증상이며, P.
인삼이란 무엇이며 약용으로 어떻게 사용되고 있는가?
인삼은 두릅나무과에 속하는 다년생작물로서 약용으로 사포닌 성분인 진세노사이드에 관련된 약리 성분이 있어 원기를 보하고 신체허약, 권태, 피로, 식욕부진, 구토, 설사에 쓰이며, 면역력 증강이나 노화예방 등으로 사용되고 있다[1-5]. 인삼에 발생하는 잘록병은 병원균이 Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, P.
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