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문제 정의
- 떫은 감과 진피는 뛰어난 항염증 및 항산화 작용이 보고되었고 역류성 식도염의 원인인 痰飮과 氣滯 증상 개선효과에 진피가 두루 통용됨에도 불구하고 이에 대한 연구는 미비하여 본 실험을 수행하게 되었다. 본 연구자는 떫은감 진피 복합추출물을 이용하여 급성 역류성 식도염 개선효과에 대해 실험하였고 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 실험을 수행하게 되었다. 본 연구자는 떫은감 진피 복합추출물을 이용하여 급성 역류성 식도염 개선효과에 대해 실험하였고 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이에 본 연구는 떫은감 진피 복합추출물의 항산화 효과를 통한 역류성 식도염 개선효과를 연구하여 떫은감 진피 복합추출물이 역류성 식도염 치료제로서 가지는 가능성을 평가하고자 실시하였다.
제안 방법
- 1주일 동안 고형사료 (항생제 무첨가, 삼양사료 Co., korea)와 물을 충분히 공급하여 실험실 환경에 적응하였다. 수술 24시간 전 절식하였고, 8일차에 역류성 식도염 유발 수술을 진행하였다.
- 얻었다. ROS 측정은 혈청과 25mM DCFH-DA를 혼합한 후, 형광 광도계를 이용하여 0분부터 매 10분씩 emission wavelength of 530nm와 excitation wavelength of 485 nm를 이용하여 30분간 측정한 산출 값을 계산하였다. ONOO-는 DHR123 buffer (rodamin buffer, 5mM DTPA, 10mM DHR123)와 혈청을 혼합한 후, 37℃에서 5 분간 교반하였다.
- pH 측정 전 정확한 측정을 위하여 pH 4와 pH 7의 완충액 (buffer solution)의 순서로 교정한 후 수집한 위 내용물의 pH를 pH 측정기 (Istek Product, Korea)를 활용하여 측정하였다.
- 준비된 membrane에 각각의 1 차 anti body를 처리하여 4℃에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체 (PBS-T로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBS-T로 6분마다 5회 세척하였다. 그리고 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액을 GE Healthcare (Arlington Heights, IL, USA)에 노출시킨 후, Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co, Ltd, Seoul, Korea)에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 band를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 정량하였다.
- 급성 역류성 식도염 동물모델에 떫은감 진피 복합 추출물을 단회 투여한 후 부검하여 얻은 혈청 및 식도를 분석하여 그 개선 효과를 평가하였다. 부검 후 적출한 위 및 식도를 촬영하고 이미지 분석 프로그램을 통해 식도의 전체 면적 및 염증, 발적, 출혈 부위를 측정한 결과 정상군에서는 손상부위가 없었으며, 대조군에서는 식도 점막 손상도가 매우 높게 나타났다.
- 수술 당일 떫은감 진피 복합 추출물을 각 50, 100㎎/㎏ 용량으로 단회 경구투여 하고 2시간 후 Zoletile mixture (Vibrac, France) 25㎎/㎏를 복강 주사하여 마취하였다. 복부를 2cm 정도 개복을 하여, 위조직의 대만 부위 및 인접한 날문부위를 실크실로 묶은 후 복막과 피부를 봉합하였다. 수술 후 회복 챔버에 머무르게 한 뒤 케이지로 이동시켰다14).
- 부검 후 위를 대만부를 따라 절개하여 위 내용물을 수집하였다. pH 측정 전 정확한 측정을 위하여 pH 4와 pH 7의 완충액 (buffer solution)의 순서로 교정한 후 수집한 위 내용물의 pH를 pH 측정기 (Istek Product, Korea)를 활용하여 측정하였다.
- , korea)와 물을 충분히 공급하여 실험실 환경에 적응하였다. 수술 24시간 전 절식하였고, 8일차에 역류성 식도염 유발 수술을 진행하였다. 수술 당일 떫은감 진피 복합 추출물을 각 50, 100㎎/㎏ 용량으로 단회 경구투여 하고 2시간 후 Zoletile mixture (Vibrac, France) 25㎎/㎏를 복강 주사하여 마취하였다.
- 수술 6시간 후, 식도 및 위를 분리하였고 수술용 가위를 이용하여 식도를 세로로 절단하였다. 절단된 식도 내부는 0.
- 수술 24시간 전 절식하였고, 8일차에 역류성 식도염 유발 수술을 진행하였다. 수술 당일 떫은감 진피 복합 추출물을 각 50, 100㎎/㎏ 용량으로 단회 경구투여 하고 2시간 후 Zoletile mixture (Vibrac, France) 25㎎/㎏를 복강 주사하여 마취하였다. 복부를 2cm 정도 개복을 하여, 위조직의 대만 부위 및 인접한 날문부위를 실크실로 묶은 후 복막과 피부를 봉합하였다.
- 식도 조직에서 western bolt을 실시하여 항산화 관련 단백질인 SOD, Catalase와 GPx를 측정하였다. 그 결과 SOD는 정상군 (1.
- 식도의 세포질을 얻기 위해 100mM Tris-HCl (pH 7.4), 5mMTris–HCl (pH 7.5), 2mM MgCl2, 15mM CaCl2, and 1.5M sucrose, and then 0.1M DTT and protease inhibitor cocktail을 첨가한 buffer A를 넣고 tissue grinder (Bio Spec Product, USA)로 분쇄한 후 10% NP-40 용액을 첨가하였다. 아이스 위에서 20분간 정치시킨 후 12, 000rpm으로 2분간 원심분리 하여 세포질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다.
- 식도조직에서 염증성 매개인자인 p-IκBα 및 NFκB를 측정하였다. 정상군에서 p-IκBα는 1.
- 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암주기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다. 실험군은 총 4개의 군으로 정상군 (Normal rat; Nor), 급성 역류성 식도염을 유발하고 증류수를 처리한 대조군 (reflux esophagitis rat; Con), 역류성 식도염을 유발하고 떫은감, 진피 복합 추출물을 50㎎/㎏으로 처리한 약물투여군 (reflux esophagitis rat treated with PCM 50㎎/㎏ body weight; PCM50), 100㎎/㎏으로 처리한 약물투여군 (reflux esophagitis rat treated with PCM 100㎎/㎏ body weight; PCM100) 으로 각각 6마리씩 나누어서 사용하였다.
- 식도를 세로로 절단하였다. 절단된 식도 내부는 0.9 % NaCl로 세척한 후 깨끗한 부직포 위에 전개했으며 이를 광학 디지털 카메라 (Sony, Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였다. 손상된 식도점막 측정은 I-Solution lite (Innerview Co.
- 식도조직의 세포질의 p-I κBα, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6, SOD, Catalase, GPx, β-actin 및 핵의 NFκB, Histone 단백질의 발현을 측정하기 위해 10㎍의 단백질을 8~15% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기연동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 준비된 membrane에 각각의 1 차 anti body를 처리하여 4℃에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체 (PBS-T로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBS-T로 6분마다 5회 세척하였다. 그리고 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액을 GE Healthcare (Arlington Heights, IL, USA)에 노출시킨 후, Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co, Ltd, Seoul, Korea)에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 band를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 정량하였다.
- 아이스 위에서 20분간 정치시킨 후 12, 000rpm으로 2분간 원심분리 하여 세포질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다. 핵을 얻기 위해 10% NP-40가 더해진 buffer A에 두 번 헹구고 100㎕의 buffer C (50mM HEPES, 50 mM KCl, 0.3mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1 mM PMSF and 10% glycerol)를 첨가해 재부유 시킨 뒤 10분마다 voltex을 3번 하였다. 4℃에서 12, 000rpm으로 10분간 원심 분리한 후 핵을 포함하고 있는 상층액을 얻어 – 80℃에서 각각 냉동 보관하였다.
대상 데이터
- Nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare (Little. Chalfont, UK)에서 구입하였고, Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), phosphorylation NFκB inhibitor alpha (p-IκBα), nuclear factor-kappa B (NFκB), inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase2 (COX2), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), SOD, Catalase, GPx, Histone, β-actin과 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였으며, Protease inhibitor mixture, DMSO, Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka. Japan)에서 구입하였다. 또한, 2', 7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)와 Dihydrorhodamine 123는 Molecular Probes (Eugene, OR, U.
- Sprague-Dawley (SD) 흰쥐 7주령 수컷 24마리를 대한 바이오(충북, 한국)에서 구입하여 1주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암주기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다.
- 떫은 감은 착색 후 15일이 경과한 것을 경상북도 농업기술원 (상주, 한국)에서 구입하였으며, 진피는 (주) MSC (양산, 한국) 에서 구입하였다.
- Japan)에서 구입하였다. 또한, 2', 7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)와 Dihydrorhodamine 123는 Molecular Probes (Eugene, OR, U.S.A.)에서 ECL Western Blotting Detection Reagents는 GE Healthcare로부터 구입하여 사용하였다. 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit는 Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다.
- 본 실험은 떫은 감, 진피 복합 추출물을 사용하였다. 떫은 감은 착색 후 15일이 경과한 것을 경상북도 농업기술원 (상주, 한국)에서 구입하였으며, 진피는 (주) MSC (양산, 한국) 에서 구입하였다.
데이터처리
- 모든 수치는 평균±표준오차 (Mean±S.E.M)로 표시하였으며, SPSS (22.0 for Windows program)을 사용하여 oneway analysis of variance (ANOVA)로 유의수준 p-value <0.05에서 검정하였다.
이론/모형
- 9 % NaCl로 세척한 후 깨끗한 부직포 위에 전개했으며 이를 광학 디지털 카메라 (Sony, Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였다. 손상된 식도점막 측정은 I-Solution lite (Innerview Co., 한국) 프로그램을 이용하여 실제 손상 부위의 면적을 측정하였다.
성능/효과
- Ⅱ.-6의 발현을 확인한 결과, COX-2의 발현은 정상군 (1.00±0.18 (p<0.05))에 비해 대조군 (1.35±0.08)은 유의성 있게 증가하였으며, 떫은감 진피 복합추출물을 50㎎/㎏으로 처리한 약물투여군 (1.13±0.11) 및 떫은감 진피 복합추출물을 100 ㎎/㎏으로 처리한 약물투여군 (0.90±0.08 (p<0.01))은 농도 의존적으로 감소되었고, 떫은감 진피 복합추출물을 100㎎/ ㎏으로 처리한 약물투여군에서 유의성이 나타났다(Fig. 7A).
- 1. 떫은감 진피 복합추출물의 투여는 역류성 식도염 유발 흰쥐에서 식도 조직의 육안적인 손상을 유의적으로 감소시켰다.
- 2. 떫은감 진피 복합추출물의 투여는 위 분비물의 pH 변화에 영향을 주지 않았다.
- 3. 떫은감 진피 복합추출물의 투여는 역류성 식도염 유발 흰쥐에서 혈청의 산화스트레스 바이오마커인 ROS 및 ONOO를 유의하게 감소시켰다.
- 4. 떫은감 진피 복합추출물의 투여는 역류성 식도염 유발 흰쥐에서 식도 조직 내에서 항산화와 관련하여 SOD, Catalase 및 GPx 단백질 발현을 유의하게 증가시켰다.
- 5. 떫은감 진피 복합추출물의 투여는 역류성 식도염 유발 흰쥐에서 식도 조직 내에서 p-IκBα와 NFκB의 발현을 유의하게 감소시켰다.
- 6. 떫은감 진피 복합추출물의 투여는 역류성 식도염 유발 흰쥐에서 식도 조직 내에서 COX-2와 iNOS, TNF-α, IL-6의 발현을 유의하게 감소시켰다.
- GPx에서는 정상군 (1.00±0.11)에 비하여 대조군 (0.58 ±0.02 (p<0.01))은 단백질 발현이 크게 감소하였고, 대조군에 비하여 떫은감 진피 복합추출물을 50㎎/㎏으로 처리한 약물투여군 (0.64±0.05)은 증가하는 경향을 보였으며 떫은 감 진피 복합추출물을 100㎎/㎏으로 처리한 약물투여군 (0.86 ±0.12 (p<0.05)) 또한 유의하게 증가하였다(Fig. 5D).
- 기존 연구 결과, 진피 추출물의 경구투여가 역류성 식도염 모델에서 개선 효과를 보이는 것으로 보고 되었고22) 떫은감의탄닌 성분이 뛰어난 항염증 효과가 있는 것으로 보고 되었으나 떫은감 진피 복합 추출물의 역류성 식도염 모델 적용 연구는 미비하여 본 실험을 진행하게 되었고 이상의 결과들로 역류성 식도염 동물 모델에서 떫은감 진피 복합추출물의 경구투여가 항산화효과를 통해 유의하게 염증을 억제함을 확인하였다. 이는 떫은감 진피 복합추출물이 역류성 식도염 예방 및 개선 한약제제로서의 개발 가능성이 있음을 보여준다.
- 03) 은 단백질 발현이 유의성 있게 감소하였다. 대조군에 비하여 떫은감 진피 복합추출물을 50㎎/㎏으로 처리한 약물투여군 (0.82±0.04)은 증가하는 경향을 보였으며 떫은감 진피 복합추출물을 100㎎/㎏으로 처리한 약물투여군 (0.84±0.06 (p<0.05))은 유의성 있게 높은 발현을 보였다(Fig. 5B).
- 따라서 떫은감 진피 복합추출물의 투여가 산화스트레스를 억제하여 식도를 보호함으로서 역류성 식도염의 개선에 효과를 보인다고 사료된다.
- 부검 후 적출한 위 및 식도를 촬영하고 이미지 분석 프로그램을 통해 식도의 전체 면적 및 염증, 발적, 출혈 부위를 측정한 결과 정상군에서는 손상부위가 없었으며, 대조군에서는 식도 점막 손상도가 매우 높게 나타났다. 떫은감 진피 복합추출물 투여군에서는 식도 점막 손상 도가 농도 의존적으로 감소하였고, 특히 떫은감 진피 복합추출물 100㎎/㎏로 처리한 약물투여군은 유의한 개선효과를 나타내었다.
- 16로유의하게 증가하였다. 떫은감 진피 복합추출물을 50㎎/㎏으로 처리한 약물투여군 및 100㎎/㎏으로 처리한 약물 투여군은 각각 1.38±0.18, 1.16±0.24 (p<0.05)로 단백질 발현이 나타나 감소되었으며, 떫은감 진피 복합추출물을 100㎎/ ㎏으로 처리한 약물투여군에서 유의성이 나타났다(Fig. 6A).
- 05))은 발현이 유의성있게 감소하였다. 또한 ONOO- 측정 결과, 정상군 (208±12.67 (p< 0.001) 보다 대조군 (612±43.89) 은 크게 증가하였으며 떫은감 진피 복합추출물을 50㎎/㎏으로 처리한 약물투여군 (540±43.87)은 감소하는 경향이 있었으며 100㎎/㎏으로 처리한 약물투여군 (369±46.28 (p<0.001))은 유의성 있게 감소하였다(Fig. 4).
- 36%로서 대조군에 비하여 감소하는 경향을 보였다. 또한 떫은감 진피 복합추출물을 100 ㎎/㎏으로 처리한 약물투여군은 49.16±9.61 (p<0.01)%의식도 손상도를 보여 뛰어난 역류성 식도염 개선효과를 보였다 (Fig. 1, 2).
- 또한 식도 손상 억제 기전을 밝히기 위하여 수집한 위 내용물의 pH를 측정한 결과 떫은감 진피 복합추출물 투여군은 대조군 보다 pH가 증가되었지만 유의한 효과를 얻을 수 없었다. 이는 떫은감 진피 복합 추출물이 위액 분비에 영향을 주지 않고 위산에 변화가 없다는 것을 의미한다.
- 평가하였다. 부검 후 적출한 위 및 식도를 촬영하고 이미지 분석 프로그램을 통해 식도의 전체 면적 및 염증, 발적, 출혈 부위를 측정한 결과 정상군에서는 손상부위가 없었으며, 대조군에서는 식도 점막 손상도가 매우 높게 나타났다. 떫은감 진피 복합추출물 투여군에서는 식도 점막 손상 도가 농도 의존적으로 감소하였고, 특히 떫은감 진피 복합추출물 100㎎/㎏로 처리한 약물투여군은 유의한 개선효과를 나타내었다.
- 부검 후 정상군의 위 분비물의 pH를 측정한 결과, 3.30± 0.20 으로 측정되었고, 대조군은 2.13±0.05, 떫은감 진피복합추출물을 50㎎/㎏, 100㎎/㎏ 으로 처리한 약물투여 군은 각각 2.93±0.24, 2.94±0.25의 pH를 나타내어 pH가 증가하는 경향은 있었으나 유의성 있는 변화는 없었다(Fig. 3).
- 분리한 혈청에서 항산화 관련 바이오 마커인 ROS 및 ONOO-를 측정한 결과 대조군에서는 높은 산화 스트레스를 보였고 떫은감 진피 복합추출물 투여군에서는 유의하게 감소하였다. ROS의 생성은 세포의 손상을 야기하고 이는 염증 발현으로 이어지게 된다17).
- 일반적인 자유라디칼의 생성은 여러 효소 반응을 통하여 제거되는데 세포 내의 증가하는 O2 -를 SOD가 수거하는 역할을 하고 이 반응에서 생성된 H2O2를 Catalase와 GPx가 H2O로 중화한다18). 식도조직을 분쇄하여 항산화 효소 단백질인 SOD, Catalase와 GPx의 발현을 측정한 결과, 전체적으로 대조군은 낮은 발현을 보였고 떫은감 진피 복합추출물 투여군은 유의하게 높은 단백질 발현을 보였다. 이는 떫은감 진피 복합추출물의 투여가 위산의 pH를 증가 시켜 식도의 손상을 억제한다는 것보다 산화 스트레스를억제함으로서 식도 조직을 보호하는 것으로 유추할 수 있다.
- 아무런 처치를 하지 않은 정상군에 비하여 역류성 식도염을 유발한 대조군의 경우 84.04±8.07%의 높은 식도 점막 손상 도를 보였고, 떫은감 진피 복합추출물을 50㎎/㎏으로 처리한 약물투여군은 65.90±8.36%로서 대조군에 비하여 감소하는 경향을 보였다. 또한 떫은감 진피 복합추출물을 100 ㎎/㎏으로 처리한 약물투여군은 49.
- 염증성 사이토카인의 발현을 분석한 결과 COX-2, iNOS, TNF-α, IL-6의 발현이 현저히 감소되었고, 이로 인하여 NFκB의 발현 또한 억제하여 염증이 감소됨을 확인하였으며 p-IκBα의 발현 또한 양상이 일치함을 확인하였다. NF-κB는 면역기능19)과 세포사20) 등 세포활동을 조절하는 전사인자이며, 염증성 질환에 있어 매우 중요한 역할을 한다.
- 혈청을 이용하여 산화적 스트레스 바이오 마커인 ROS를 측정한 결과, 정상군 (232±15.06 fluorescence/min/ml (p<0.01)에 비하여 대조군 (377±34.80)은 유의하게 증가하였고, 떫은감 진피 복합추출물을 50㎎/㎏으로 처리한 약물투여군 (334±31.02) 및 100㎎/㎏으로 처리한 약물투여군 (279±12.90 (p<0.05))은 발현이 유의성있게 감소하였다. 또한 ONOO- 측정 결과, 정상군 (208±12.
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