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문제 정의
- 만성적 염증 반응은 지속적인 항원에 대한 노출에 의해 발생할 수 있으며 관절염이나 2형 당뇨와 같은 여러 염증성 질환의 가장 큰 발병 원인이 된다. 본 연구에서는 아위 느타리 버섯 (Pleurotus ferulae)의 새로운 육종 균주인 GW10-45의 추출물(헥산, 클로로포름, 메탄올, 메탄올/물, 물)이 가지는 RAW264.7 대식세포에 대한 항염증 활성을 연구하였다. 먼저, 각각의 추출물은 RAW264.
제안 방법
- RAW264.7 세포중의 산화질소 생성을 측정하기 위해, 세포를 24-well plate에 5 × 104 cells/well씩 분주하고 24시간 배양한 후, 각 추출물(100 μg/ml)을 2시간 전처리하였다.
- 각 추출물의 RAW264.7 세포주에 대한 독성을 확인하기 위해 WST-1 시약을 이용해 세포의 생존률을 측정하였다. 세포에 각 추출물(100 μg/ml)을 처리하고 24시간 동안 배양한 결과, 대조군과 비교하였을 때 클로로포름, 메탄올, 메탄올/물 추출물에서는 세포 생존률의 변화가 없었다.
- 각 추출물이 RAW264.7 세포주에서 산화질소의 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 추출물(100 μg/ml)을 처리한 후 2시간 배양하고 LPS를 이용해 24시간 세포를 자극하였다.
- 5% Tween-20) buffer로 세척 후 anti-iNOS, -COX2, -p-NF-κB (ser536), -NF-κB, -pIκBα (ser32), -GAPDH rabbit antibody (Cell Signaling Technology, Denver, MA, USA)를 반응시켰다. 그리고 PBST로 세척하고 HRP-conjugated anti-rabbit antibody를 반응시켰다. 이후 ECL detection system (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 항원-항체 반응 밴드를 가시화하였다.
- 본 연구에서는 아위느타리버섯의 신균주인 GW10-45의 클로로포름 추출물 (chloroform extract of GW10-45; 이하 CG45)의 항염 활성을 마우스 RAW264.7 대식세포를 이용하여 확인하였고, LPS 자극에 의해 활성화되는 세포내 단백질들에 CG45가 어떤 영향을 미치는지를 확인하였다.
- 아위느타리버섯 교잡종 GW10-45를 동결 건조한 후, 분쇄기 (Hanil, Seoul, Korea)로 분쇄하고 냉장 저장하면서 실험에 이용하였다. 분말로부터 추출물을 얻기 위하여 hexane 및 chloroform (CHCl3), methanol (MeOH), H2O를 차례로 이용한 순차적 용매추출법으로 분말의 중량 기준 10배량의 용매를 넣고 100 ~ 250 rpm으로 3시간, 3회 반복 진탕 추출하였다. 추출액은 filter paper로 여과한 다음, 진공회전농축기 (EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하고 각 추출용매로 용해시켜 추출물을 얻었다.
- 이러한 NF-κB와 IκBα의 인산화를 확인하기 위해 RAW264.7 세포에 CG45 (100 μg/ml)를 처리하고 LPS로 24시간 자극시킨 후 이들 단백질들의 발현에 대한 Western blot을 시행하였다.
- 7 세포주에서 NO 생성을 가장 효과적으로 억제하였다(Kim and Kim, 2015). 이를 통해 염증에 효과가 있는 물질이 CG45에 많이 포함되어 있을 것이라고 생각되며 이후의 실험은 억제효과가 뛰어난 CG45만을 이용하여 진행하였다.
- 그리고 PBST로 세척하고 HRP-conjugated anti-rabbit antibody를 반응시켰다. 이후 ECL detection system (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 항원-항체 반응 밴드를 가시화하였다.
- 이후 용매별 버섯 추출물을 100 μg/ml 농도로 24시간 동안 처리하였다.
대상 데이터
- 추출액은 filter paper로 여과한 다음, 진공회전농축기 (EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하고 각 추출용매로 용해시켜 추출물을 얻었다. MeOH추출물은 농축 후 MeOH 용해물과 MeOH에 불용성인 성분은 H2O로 녹여 MeOH/H2O 용해물로 구분하여 실험에 이용하였다(Fig. 1).
- Western blot을 시행하기 위하여 RAW264.7 세포를 CG45 (100 μg/ml)로 2시간 동안 전처리하고 24시간 동안 LPS(1 μg/ml)로 자극시킨 후, 세포를 수집하였다.
- 세포는 37ºC에서 습한 조건으로 CO2(5%) incubator에서 배양되었다.
- 실험에 사용한 아위느타리버섯 GW10-45는 ASI 2803 자실체에서 분리한 이핵균사와 아위느타리버섯 균주 ASI 2778의 자실체에서 분리한 일핵균사를 di-mono 교배한 것으로 농업진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부 버섯과로부터 제공받았다.
- 아위느타리버섯 교잡종 GW10-45를 동결 건조한 후, 분쇄기 (Hanil, Seoul, Korea)로 분쇄하고 냉장 저장하면서 실험에 이용하였다. 분말로부터 추출물을 얻기 위하여 hexane 및 chloroform (CHCl3), methanol (MeOH), H2O를 차례로 이용한 순차적 용매추출법으로 분말의 중량 기준 10배량의 용매를 넣고 100 ~ 250 rpm으로 3시간, 3회 반복 진탕 추출하였다.
- 쥐의 대식세포인 RAW264.7 세포주는 ATCC (American Tissue Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구매하였고, DMEM 배지에 10% FBS와 1% penicillin (100 U/ml)/streptomycin (100 μg/ml)을 첨가하여 세포배양에 사용하였다.
이론/모형
- 그 중, 클로로포름 추출물(CG45)을 처리한 실험군에서 가장 높은 산화질소 생성 억제효과가 나타남을 확인하였다. 또한 주요한 염증성 인자들의 단백질 발현 및 인산화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Western blot 분석을 시행하였다. 그 결과, LPS로 유도된 염증 모델에 CG45를 처리하였을 때 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현이 급격히 감소함을 확인하였다.
성능/효과
- 그 결과 Fig. 4(B)와 같이, IκBα의 인산화가 LPS만 처리 시 증가하였고, CG45와 같이 배양하였을 때 감소함을 확인하였다.
- 7 세포주에서 산화질소의 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 추출물(100 μg/ml)을 처리한 후 2시간 배양하고 LPS를 이용해 24시간 세포를 자극하였다. 그 결과, Fig. 3과 같이 LPS만 처리한 군에서는 산화질소가 비처리군과 비교하여 급격히 증가하는 것을 확인하였다. 이에 비해, LPS와 헥산, 클로로포름, 물 추출물이 각각 같이 처리된 군에서는 LPS 처리군과 비교하여 산화질소의 생성량이 감소함을 보였으며, 특히, 클로로포름 추출물(CG45)에서 가장 높은 억제효과를 확인할 수 있었다.
- 또한 주요한 염증성 인자들의 단백질 발현 및 인산화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Western blot 분석을 시행하였다. 그 결과, LPS로 유도된 염증 모델에 CG45를 처리하였을 때 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현이 급격히 감소함을 확인하였다. 또한 NF-κB 신호전달에서 NF-κB와 이의 억제 단백질인 IκBα의 인산화가 LPS만을 처리한 군과 비교하여 CG45를 함께 처리한 실험군에서 크게 감소함을 확인 하였다.
- 7 세포주에 대하여 세포독성을 가지지 않았으며, 헥산 및 클로로포름, 물 추출물이 산화질소의 생성을 억제하였다. 그 중, 클로로포름 추출물(CG45)을 처리한 실험군에서 가장 높은 산화질소 생성 억제효과가 나타남을 확인하였다. 또한 주요한 염증성 인자들의 단백질 발현 및 인산화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Western blot 분석을 시행하였다.
- 또한 NF-κB 신호전달에서 NF-κB와 이의 억제 단백질인 IκBα의 인산화가 LPS만을 처리한 군과 비교하여 CG45를 함께 처리한 실험군에서 크게 감소함을 확인 하였다.
- 또한, NF-κB의 경우도 LPS만을 처리한 세포에서는 그 인산화가 증가하였지만 CG45를 함께 처리한 경우에는 인산화가 급격히 감소함을 확인하였다.
- 7 대식세포에 대한 항염증 활성을 연구하였다. 먼저, 각각의 추출물은 RAW264.7 세포주에 대하여 세포독성을 가지지 않았으며, 헥산 및 클로로포름, 물 추출물이 산화질소의 생성을 억제하였다. 그 중, 클로로포름 추출물(CG45)을 처리한 실험군에서 가장 높은 산화질소 생성 억제효과가 나타남을 확인하였다.
- 세포에 CG45 (100 μg/ml)를 처리한 후 LPS로 자극시켜 iNOS와 COX-2의 발현량을 Western blot을 통해 비교한 결과 Fig. 4(A)와 같이 iNOS와 COX-2 두 단백질 모두 LPS만 처리한 세포에서는 급격하게 발현량이 증가하는 것으로 나타났고, CG45와 LPS를 모두 처리한 군에서는 iNOS와 COX-2의 세포 내 발현이 급격히 감소하는 것을 확인하였다.
- 세포에 각 추출물(100 μg/ml)을 처리하고 24시간 동안 배양한 결과, 대조군과 비교하였을 때 클로로포름, 메탄올, 메탄올/물 추출물에서는 세포 생존률의 변화가 없었다.
- 실험을 통하여 아위느타리 버섯의 새로운 육종균주 GW10-45의 추출물 CG45는 NF-κB 신호전달 과정에서 인산화 정도를 억제함으로써 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현을 억제하여 LPS로 유도된 RAW264.7 세포주의 염증 모델에서 그 염증 반응을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.
- 위의 결과들을 통하여 CG45가 RAW264.7 세포에서 염증의 주요한 전사인자인 NF-κB의 신호전달을 억제함으로써 염증성 단백질의 발현과 산화질소의 생성을 억제하여 염증을 완화하는 효과를 가진다는 것을 알 수 있었다.
- 이에 비해, LPS와 헥산, 클로로포름, 물 추출물이 각각 같이 처리된 군에서는 LPS 처리군과 비교하여 산화질소의 생성량이 감소함을 보였으며, 특히, 클로로포름 추출물(CG45)에서 가장 높은 억제효과를 확인할 수 있었다. 이 실험을 통하여 GW10-45의 여러 추출물 중 클로로포름 추출물이 RAW264.7 세포주에서 산화질소의 생성을 가장 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.
- 4(A)와 같이 iNOS와 COX-2 두 단백질 모두 LPS만 처리한 세포에서는 급격하게 발현량이 증가하는 것으로 나타났고, CG45와 LPS를 모두 처리한 군에서는 iNOS와 COX-2의 세포 내 발현이 급격히 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, CG45가 LPS로 유도된 RAW264.7 세포주에서 염증성 단백질인 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하는 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.
- 2). 이를 통해 모든 추출물이 RAW264.7 세포주에 대해 세포독성을 가지지 않음을 확인하였다.
- 3과 같이 LPS만 처리한 군에서는 산화질소가 비처리군과 비교하여 급격히 증가하는 것을 확인하였다. 이에 비해, LPS와 헥산, 클로로포름, 물 추출물이 각각 같이 처리된 군에서는 LPS 처리군과 비교하여 산화질소의 생성량이 감소함을 보였으며, 특히, 클로로포름 추출물(CG45)에서 가장 높은 억제효과를 확인할 수 있었다. 이 실험을 통하여 GW10-45의 여러 추출물 중 클로로포름 추출물이 RAW264.
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