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문제 정의
- 6). WS-E가 NO의 분비를 억제하는 활성을 보임에도 불구하고 TNF-α의 분비를 억제하지 않는 이유를 분석하기 위하여 WS-E가 대식세포에 대해 TNF-α의 생성을 유도하는가를 조사하였다. 그 결과 비교적 높은 농도인 100 μg/ml의 농도에서부터 WS-E는 대식세포로부터 TNF-α의 분비를 유도하는 것으로 관찰되었다(data not shown).
- 따라서 본 연구에서 저자들은 병꽃나무 꽃을 에탄올로 추출하여 총 플라보이드와 폴리페놀 함량을 조사하고, 항산화 및 항염증 효과를 확인하여 기능성 화장품 소재로의 적용 가능성을 타진하였다.
- 주로 단핵세포와 대식세포에서 생산되는 TNF-α는 면역반 응과 염증반응을 유도하는 염증 유도 매개cytokine으로 세포의 성장과 분화, apoptosis, necrosis 등의 기능에 관여하며, 또한 대식세포와 T-세포에 의해서 생산되는 IL-6는 inflamma- tory와 pro-inflammatory cytokine으로 알려져 있다 [27]. 본 연구에서는 염증 반응에서 대식세포로부터 분비되는 중요한 in- flammatory cytokine으로 알려진 TNF-α와 IL-6의 분비에 대한 WS-E의 억제 활성을 조사하였다. 그 결과 LPS로 자극된 대식세포로부터 분비되는 TNF-α에 대해서는 WS-E 전처리에 의한 억제 효과가 관찰되지 않았다 (Fig.
가설 설정
- 1)Total polyphenol content (ug/ml) was equivalent as tannic acid as standard.
- 2)Total flavonoid content (ug/ml) was equivalent as quercetin as standard.
제안 방법
- 5 ml를 넣어 잘 섞어주었다. 5분간 방치한 후, 10% Na2CO3 1 ml를 가한 후, 725 nm에서 1시간 이내에 흡광도(UV/Vis spectrophotometer, Thermo Scientific, G10S, MA, USA)를 측정하였다. Tannic acid를 표준물질로 사용하였으며 총 폴리페놀 함량은 시료 1 ml 중의 μg tannic acid로 나타내었다.
- DPPH 라디칼에 대한 소거 활성은 Blois의 방법[2]을변형하여 측정하였다. 각 시료 20 μl에 0.
- 7 세포(1×106 cells/well)에 LPS (100 ng/ml)로 자극한 후 세포를 회수하여 RIPA buffer (protease and phosphatase inhibitor cocktail; Thermo Scien- tific, Waltham, MA, USA)로 4℃에서 30분간 처리하였다. LPS 자극은 iNOS 분석에는 6시간, mitogen-activated protein kin- ase (MAPK)와 nuclear factor (NF)-κB 분석에는 15분간 처리하였다. 원심분리한 후 상층액을 얻고 BCA protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 단백질 양을 정량하였다.
- 그 후 10% sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacryl- amide gel electrophoresis (PAGE) gel에 각 lane 당 30 μg의 세포 단백질을 넣어 전기 영동 하고, gel 내의 단백질을 poly- vinylidene fluoride membrane filter (PVDF, Bio-Rad) 막에 transfer 하였다. PVDF 막을 5% skim milk 용액으로 blocking 하고, IκB, p38, extracellular signal regulated kinase (ERK), c-Jun-N-terminal kinase (JNK), phosphorylated IκB (p-IκB), phosphorylated p38 (p-p38), phosphorylated ERK (p-ERK), phosphorylated JNK (p-JNK) 각각에 대한 항체(R&D Systems)를 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후각 항체에 대한 2차 항체인 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti- body (R&D Systems)를 반응시킨 후 ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 각 band를 발현시켜 관찰하였다.
- NO 생성량 측정은 Lee 등[14] 의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. RAW 264.7 세포(5×104 cells/well)를 96-well plate에 분주한 후 시료를 농도별(0.16, 0.8, 4, 20, 100 μg/ml)로 12시간 전 처리한 다음, LPS로 24시간 자극하여 염증을 유발하였다. 배양액 중에 분비된 NO의 농도는 NO 정량 kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 측정하였다.
- Superoxide 음이 온 라디칼 소거 활성은 Nishikimi의 방법[19]을 변형하여 각 시료의 xanthine-xanthine oxidase system 에 의해 생성된 supreroxide 음이 온 라디칼을 소거하는 효과를 측정하였다. 3 mM xanthine, 0.
- [1]. WS-E의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거능과 super- oxide 음이 온 라디칼 소거능을 가지고 측정하였다.
- NO는 L-arginine을 기질로 하여 NO 합성효소에 의해 생성되는 무기 유리체로 지속적인 염증의 진행에 의한 종양형성 촉진, 면역반응, 혈관이완 등 여러 생물학적인 과정에 관여하는 인자 중의 하나로 인식되고 있다 [10]. WS-E의 항염증 활성을 측정하기 위하여 먼저 LPS로 전처리한 RAW 264.7 대식 세 포에 WS-E를 농도별로 처리한 후 염증매 개인자인 NO 생성 정도를 정량하였다. 그 결과 Fig.
- 그 후각 항체에 대한 2차 항체인 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti- body (R&D Systems)를 반응시킨 후 ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 각 band를 발현시켜 관찰하였다. 각 band의 발현은 densitometer를 이용하여 분석하였다.
- PVDF 막을 5% skim milk 용액으로 blocking 하고, IκB, p38, extracellular signal regulated kinase (ERK), c-Jun-N-terminal kinase (JNK), phosphorylated IκB (p-IκB), phosphorylated p38 (p-p38), phosphorylated ERK (p-ERK), phosphorylated JNK (p-JNK) 각각에 대한 항체(R&D Systems)를 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후각 항체에 대한 2차 항체인 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti- body (R&D Systems)를 반응시킨 후 ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 각 band를 발현시켜 관찰하였다. 각 band의 발현은 densitometer를 이용하여 분석하였다.
- 평상시 NF-κB는 세포질에서 IκB와 결합되어 핵 내 전위가 불가능한 불활성화 상태로 존재하나 염증성 자극에 의하여 IκB kinase가 활성화되어 IκB가 인산화될 경우 IκB로부터 유리되어 핵내로 이동하여 iNOS, COX-2 및 inflammatory cytokine의 합성을 촉진한다고 알려져 있다 [22]. 따라서 WS-E 의 항염증 활성이 NF-κB 활성화 억제에 의한 것인지를 알아보기 위하여 WS-E를 전처리 하고, LPS로 자극한 대식세포에서 IκB의 인산화에 대한 영향을 측정하였다. 그 결과 Fig.
- 3). 따라서 전혀 독성을 나타내지 않는 안전한 농도인 100 μg/ml이하의 농도로 WS-E를 처리하여 다음 실험을 수행하였다.
- 배양액 중에 분비된 NO의 농도는 NO 정량 kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 측정하였다. 또한 세포배양액 중에 분비된 cytokine의 생성량은 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 05). 또한 염증 반응의 자극에 의해 유도되는 NO를 생합성하는 효소로 알려진 iNOS의 세포 내 발현량을 Western blot으로 측정하여 NO 분비 억제에 관한 작용기전을 확인하였다. 그 결과 WS-E를 전처리한 경우에 있어서 iNOS의 세포 내 발현이 현저하게 억제되었으며, 이 억제 효과 는 WS-E의 농도에 의존하는 것으로 나타났다(Fig.
- 8, 4, 20, 100 μg/ml)로 12시간 전 처리한 다음, LPS로 24시간 자극하여 염증을 유발하였다. 배양액 중에 분비된 NO의 농도는 NO 정량 kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 측정하였다. 또한 세포배양액 중에 분비된 cytokine의 생성량은 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 본 연구에 사용한 병꽃나무 꽃에 탄올 추출물은 묘목에서 꽃잎만 채취하여 음건한 후 무게의 10배량(w/v)의 70%에 탄 올을 가하여 3시간씩 3회 환류추출 후 냉침하여 Whatman 여과지(No. 5)로 여과하였다. 여과된 추출물을 40℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조한 후 DMSO에 녹여 시료(WS-E)로 사용하였다.
- 04 N HCl in isopropanol)을 첨가한 후, 생성된 formazan이 용출되도록 하여 microplate reader (Tecan)로 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생존율은 대조군에 대한 흡광도의 차를 백분율로 표시하여 비교 분석하였다.
- 세포독성은 MTT 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 Mosmann의 방법[17]을 변형하여 실시하였다. RAW 264.
- 1 mM DPPH 180 μl를 넣고 vortex한 후, 30분 동안 방치한 다음 microplate reader (Tecan, Sunrise, NC, USA)를 사용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 시료의 DPPH 라디칼 소거능을 구하였다.
- 반응이 끝난 후 microplate reader (Tecan)을 사용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 시료의 superoxide 음이 온 라디칼 소거능을 구하였다.
- LPS 자극은 iNOS 분석에는 6시간, mitogen-activated protein kin- ase (MAPK)와 nuclear factor (NF)-κB 분석에는 15분간 처리하였다. 원심분리한 후 상층액을 얻고 BCA protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 단백질 양을 정량하였다. 그 후 10% sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacryl- amide gel electrophoresis (PAGE) gel에 각 lane 당 30 μg의 세포 단백질을 넣어 전기 영동 하고, gel 내의 단백질을 poly- vinylidene fluoride membrane filter (PVDF, Bio-Rad) 막에 transfer 하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법[5]을변형하여 측정하였다. 즉, 적당하게 희석된 시료 1 ml에 95% ethanol 1 ml와 증류수 5 ml를 첨가하고 1 N Folin-Ciocalteu’s reagent 0.
대상 데이터
- 3 ml를 가하여 혼합하고 실온에서 40분 동안 정치한 뒤 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin을 표준물질로 사용하였으며 총 플라보노이드 함량은 시료 1 ml 중의 μg quercetin으로 나타내었다.
- WS-E에 존재하는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정하기 위하여 표준물질로 각각 tannic acid와 quercetin을 사용하였다. 그 결과 Table 1에서와 같이 WS-E의 총 폴리페놀 함량은 719.
- 본 연구에 사용된 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포는 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% antibiotics (penicil- lin-streptomycin)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 그 외 실험에 사용된 모든 시약들은 일급 및 특급시약을 구입하여 사용하였다. 본 연구에 사용한 병꽃나무 꽃은 소망농원(Seoul, Korea)에서 묘목을 구입하여 심고 키워 개화기에 채집하여 사용하였다.
- 시약으로 사용된 1, 1-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), xanthine, xanthine oxidase, nitro blue tetrazolium (NBT), po- tassium persulfate, 3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl- tetrazolium bromide (MTT) 등은 Sigma-Aldrich Chemical 사 (St. Louis, MO, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 그 외 실험에 사용된 모든 시약들은 일급 및 특급시약을 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- , Chicago, USA)를 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였다. 대조군에 대한 시료처리 군의 통계적 유의성은 Duncan's multiple range test로 검증하였다.
- 모든 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 유의성 검사 는 SPSS TM version 20.0 (SPSS Inc., Chicago, USA)를 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였다. 대조군에 대한 시료처리 군의 통계적 유의성은 Duncan's multiple range test로 검증하였다.
이론/모형
- NO 생성량 측정은 Lee 등[14] 의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. RAW 264.
- iNOS의 세포 내 발현은 Western blot으로 분석하였다. 시료를 농도별로 전처리한 RAW 264.
- 총 플라보노이드 함량은 Moreno 등[16] 의 방법에 의해 측정하였다. 각 시료 0.
성능/효과
- MTT assay를 이용하여 WS-E의 RAW 264.7 대식 세포에 대한 세포독성을 측정한 결과 100 μg/ml의 농도까지 세포의 증식에 별다른 영향을 주지 않는 안전한 농도인 것으로 확인되었다(Fig. 3). 따라서 전혀 독성을 나타내지 않는 안전한 농도인 100 μg/ml이하의 농도로 WS-E를 처리하여 다음 실험을 수행하였다.
- DPPH 라디칼 소거능은 안정한 라디칼인 DPPH를 소거시키는 항산화물질의 활성을 측정하는 것으로 짙은 자색을 띄 는 DPPH 라디칼이 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 색이 탈색되는 것을 이용하여 항산화물질을 검색하는 데 이용되고 있다 [13]. WS-E의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과 Fig. 1에 나타낸 바와 같이 WS-E의 DPPH 라디칼 소거 활성은 31.2, 62.5, 125 μg/ml에서 각각 26.27±2.31%, 57.25±3.14%, 83.44± 0.41%로 나타났으며, 농도의존적으로 활성이 증가하고 있음을 알 수 있었다. Kang [9]이 보고한 합환피(Albizziae cortex)추출물이 400 μg/ml에서 25.
- 그 결과 비교적 높은 농도인 100 μg/ml의 농도에서부터 WS-E는 대식세포로부터 TNF-α의 분비를 유도하는 것으로 관찰되었다(data not shown). 결과적으로 WS-E의 항염증 활성에서 TNF-α의 분비 억제가 인정되지 않았던 것은 WS-E가 단독으로 TNF-α를 유도하는 것과 관련이 있는 것으로 사료된다.
- 7 대식 세 포에 WS-E를 농도별로 처리한 후 염증매 개인자인 NO 생성 정도를 정량하였다. 그 결과 Fig. 4에 나타낸 바와 같이 WS-E 를 농도별로 (0.16, 0.8, 4, 20, 100 μg/ml) 처리하였을 때 8.98, 8.15, 7.42, 6.48, 4.71 μM로 투여 농도의존적으로 NO의 생성을 억제하였다 (p<0.05). 또한 염증 반응의 자극에 의해 유도되는 NO를 생합성하는 효소로 알려진 iNOS의 세포 내 발현량을 Western blot으로 측정하여 NO 분비 억제에 관한 작용기전을 확인하였다.
- 따라서 WS-E 의 항염증 활성이 NF-κB 활성화 억제에 의한 것인지를 알아보기 위하여 WS-E를 전처리 하고, LPS로 자극한 대식세포에서 IκB의 인산화에 대한 영향을 측정하였다. 그 결과 Fig. 8에 나타낸 바와 같이 WS-E는 LPS에 의한 IκB의 인산화를 농도 의존적으로 억제하는 것으로 확인되었다.
- 본 연구에서는 염증 반응에서 대식세포로부터 분비되는 중요한 in- flammatory cytokine으로 알려진 TNF-α와 IL-6의 분비에 대한 WS-E의 억제 활성을 조사하였다. 그 결과 LPS로 자극된 대식세포로부터 분비되는 TNF-α에 대해서는 WS-E 전처리에 의한 억제 효과가 관찰되지 않았다 (Fig. 6). WS-E가 NO의 분비를 억제하는 활성을 보임에도 불구하고 TNF-α의 분비를 억제하지 않는 이유를 분석하기 위하여 WS-E가 대식세포에 대해 TNF-α의 생성을 유도하는가를 조사하였다.
- 또한 염증 반응의 자극에 의해 유도되는 NO를 생합성하는 효소로 알려진 iNOS의 세포 내 발현량을 Western blot으로 측정하여 NO 분비 억제에 관한 작용기전을 확인하였다. 그 결과 WS-E를 전처리한 경우에 있어서 iNOS의 세포 내 발현이 현저하게 억제되었으며, 이 억제 효과 는 WS-E의 농도에 의존하는 것으로 나타났다(Fig. 5). 또한Western blot에 의한 결과를 정량적으로 관찰하기 위해 densi- tometer를 이용하여 분석한 결과에서도 iNOS의 발현이 현저하게 억제되는 것으로 관찰되었다.
- WS-E가 NO의 분비를 억제하는 활성을 보임에도 불구하고 TNF-α의 분비를 억제하지 않는 이유를 분석하기 위하여 WS-E가 대식세포에 대해 TNF-α의 생성을 유도하는가를 조사하였다. 그 결과 비교적 높은 농도인 100 μg/ml의 농도에서부터 WS-E는 대식세포로부터 TNF-α의 분비를 유도하는 것으로 관찰되었다(data not shown). 결과적으로 WS-E의 항염증 활성에서 TNF-α의 분비 억제가 인정되지 않았던 것은 WS-E가 단독으로 TNF-α를 유도하는 것과 관련이 있는 것으로 사료된다.
- 특히 p38, JNK 및 ERK와 같은 MAPK는 이러한 염증 반응에 있어서 매우 중요한 신호전달분자로서 이들 분자의 인산화에 의해 염증 반 응이 유발되는 것으로 알려져 있다 [24]. 따라서 WS-E의 항염증 활성이 MAPK의 조절 여부에 의해 나타나는지 알아보기 위하여 평가한 결과, Fig. 7에 나타난 바와 같이 LPS 자극에 의한 p38, ERK 및 JNK 등의 MAPK 활성을 억제하지 못하는 것으로 나타났다.
- 5). 또한Western blot에 의한 결과를 정량적으로 관찰하기 위해 densi- tometer를 이용하여 분석한 결과에서도 iNOS의 발현이 현저하게 억제되는 것으로 관찰되었다. Kim 등[11]은 NO 저해 활성이 높게 나타난 왕쥐똥나무(Ligustrum ovalifolium) 잎에 탄올 추출물이 iNOS의 발현을 효과적으로 저해한다고 보고하였으며, 이는 WS-E의 NO 생성 억제와 iNOS 발현 저해양상과 유사한 결과로 사료된다.
- 6). 이상의 결과로부터 WS-E는 LPS에 의한 대식세포의 염증 반응에 있어서 NO와 inflammatory cytokine인 IL-6의 분비를 억제하는 활성이 인정되었으나 TNF-α의 분비에 대해서는 억제 효과가 없는 것으로 확인되었다.
- 이상의 결과를 종합해보면 병꽃나무 꽃에탄올 추출물인 WS-E의 항염증 활성은 MAPK 억제보다는 NF-κB의 활성 억제, 그리고 iNOS의 세포 내 발현 억제를 통한 NO 생성의 저해, inflammatory cytokine인 IL-6의 억제 등과 같은 일련의 기전을 통해 일어나는 것으로 추정되었다. 향후 TNF-α의 분비에 관한 활성에 대해 면밀한 검토가 필요할 것으로 사료된다.
후속연구
- 이상의 결과를 종합해보면 병꽃나무 꽃에탄올 추출물인 WS-E의 항염증 활성은 MAPK 억제보다는 NF-κB의 활성 억제, 그리고 iNOS의 세포 내 발현 억제를 통한 NO 생성의 저해, inflammatory cytokine인 IL-6의 억제 등과 같은 일련의 기전을 통해 일어나는 것으로 추정되었다. 향후 TNF-α의 분비에 관한 활성에 대해 면밀한 검토가 필요할 것으로 사료된다.
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