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문제 정의
- , 2010). 따라서 본 실험에서 개발한 Enterococcus Mixed F medium이 환경 시료에서의 장구균 검출 효율을 확인 하기 위해 대전지역의 주요 하천인 갑천에서 시료를 채취하여 장구균 검출효과를 확인하였다. 장구균의 개체 수와 형광성의 상관성을 비교 분석하기 위해 시료를 30, 60, 90, 120, 150 CFU/100 ml이 되도록 희석한 후 41℃에서 18시간 Enterococcus Mixed F broth에 배양하여 1시간 간격으로 형광성을 측정하였고, 4-methylumbelliferyl-β-D-glycoside가 366 nm에서 blue 형광을 띄는 것을 이용하여 육안으로도 관찰하였다(Fig.
- 본 연구는 분변오염의 지표가 되는 장구균을 좀 더 쉽고 정확하게 검출할 수 있는 배지를 개발하여, 이 배지에서의 장구균 배양 조건과 배양시간에 따른 균체 증식 속도 등을 조사한 후, 실제 환경시료에 존재하는 장구균 검출에 활용할 수 있는지를 조사하고자 하였다.
- 분변오염의 지표가 되는 장구균을 검출하기 위하여 장구균 선택 배지를 개발하였다. 기존에 알려진 여러 장구균 검출 배지 중 총 9종류(Enterococci Confirmatory agar, Azide dextrose agar, Bromocresol-purple azide agar, Esculin bile agar, Citrate azide tween carbonate agar, KF Streptococcus agar, BROLACIN agar, Kanamycin esculin azide agar, Membrane filter Enterococcus selective agar)의 배지를 선별하였고, 배지 성분을 적절히 조합하여 새로운 배지 Enterococcus Mixed medium을 개발하였다.
제안 방법
- 각 공시균주를 LB (Difco)배지에서 전배양한 다음 OD 1.0으로 조정하고 Enterococcus Mixed broth와 Enterococcus Mixed F broth에 각각 1%씩 접종한 후 41℃로 조정된 배양기에서 2일 정치배양하며 균의 생육과 형광성을 측정하였다. 측정은 2시간마다 배양액의 일정량을 분취한 후 UV-Spectrophotometer (SmartSpec3000, Bio-Rad)를 이용하여 600 nm에서 균체량을 측정하였고, VersaFluorTM Fluorometer (Bio-Rad)를 이용하여 형광성을 측정하였다.
- 갑천에서 검출한 균이 장구균인지 확인하기 위해 개체수 조사 배지에서 검출된 콜로니 중 무작위로 11개의 콜로니를 분리하여 16S rRNA 유전자의 중합효소 연쇄반응으로 염기서열을 분석하였다. 그 결과 7개 균주가 Enterococcus faecium ATCC 19434T과 99.
- 그리고 저온성 세균 및 일부 중온성 세균이 증식하지 못하도록 배양 온도를 41℃로 조절하여 장구균만 생장하고 비장구균은 저해되는 Enterococcus Mixed medium을 개발하였다. 그리고 6종의 장구균과 3종의 비장구균을 대상으로 개발된 Enterococcus Mixed broth배지에서 균의 생육을 Enterococcus Mixed F broth배지에서 형광성 실험을 진행하였다.
- 5 g/L로 조정하였고, indicator agent로 2,3,5-triphenyltetrazolium solution을 첨가하였다. 그리고 저온성 세균 및 일부 중온성 세균이 증식하지 못하도록 배양 온도를 41℃로 조절하여 장구균만 생장하고 비장구균은 저해되는 Enterococcus Mixed medium을 개발하였다. 그리고 6종의 장구균과 3종의 비장구균을 대상으로 개발된 Enterococcus Mixed broth배지에서 균의 생육을 Enterococcus Mixed F broth배지에서 형광성 실험을 진행하였다.
- 분변오염의 지표가 되는 장구균을 검출하기 위하여 장구균 선택 배지를 개발하였다. 기존에 알려진 여러 장구균 검출 배지 중 총 9종류(Enterococci Confirmatory agar, Azide dextrose agar, Bromocresol-purple azide agar, Esculin bile agar, Citrate azide tween carbonate agar, KF Streptococcus agar, BROLACIN agar, Kanamycin esculin azide agar, Membrane filter Enterococcus selective agar)의 배지를 선별하였고, 배지 성분을 적절히 조합하여 새로운 배지 Enterococcus Mixed medium을 개발하였다. 배지의 효과를 검증하기 위하여 장구균 6종류(Enterococcus avium KACC 10788, Enterococcus faecium KACC 11954, Enterococcus saccharolyticus KACC 10783, Enterococcus durans KACC 10787, Enterococcus faecalis KACC 11304, Enterococcus hirae KACC 10779)와 비장구균 3종류(Escherichia coli KACC 10005, Staphylococcus aureus subsp.
- 그러나 이 배지들도 조건에 따라 일부 장구균이 생장하지 않거나 비장구균이 생장하였다. 따라서 이들 배지성분 중 coliforms group의 생장을 저해하기 위해 sodium azide 함량을 0.5 g/L로 조정하였고, indicator agent로 2,3,5-triphenyltetrazolium solution을 첨가하였다. 그리고 저온성 세균 및 일부 중온성 세균이 증식하지 못하도록 배양 온도를 41℃로 조절하여 장구균만 생장하고 비장구균은 저해되는 Enterococcus Mixed medium을 개발하였다.
- 또 이들 9종류의 장구균 배지들을 다양한 조성으로 실험한 후 장구균 검출에 보다 적합한 Enterococcus Mixed Medium을 개발하였고(Table 1), 효소발색법시 형광성을 방해하는 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride 대신 장구균에 특이적으로 형광성을 나타내는 4-methyumbelliiferyl-β-D-glucoside (0.008 g/L)를 첨가한 Enterococcus Mixed F medium도 개발하였다.
- 그 결과 새롭게 개발된 장구균 검출배지에서 비장구균의 생장이 억제된 반면에 장구균 6종류는 모두 생장하는 것을 확인하였다. 또 환경시료에서 장구균을 분리할 수 있는지 확인하기 위해 하천과 바다에서 채취해온 시료를 이용하여 실험한 결과 장구균의 생장을 확인하였다. 따라서 이 배지를 이용하면 수질 분변오염의 지표가 되는 장구균을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
- 2). 또 희석한 장구균의 이론적인 개체수를 확인하기 위해 각각의 희석한 시료를 막여과법을 이용하여 41℃에서 2일간 배양하며 직접 콜로니를 계수하였다. 그 결과 대부분 이론 값과 측정 값이 약 10 CFU/100 ml 정도의 차이를 보여 비교적 근사치를 나타냈으나, 150 CFU/100 ml에서는 약 30 CFU/100 ml 정도의 차이를 나타내었으나(Table 2), 장구균은 100 CFU/100 ml 이상의 유무로 오염 여부를 판단하므로 형광성을 이용하여 장구균을 판단하는데 문제가 없을 것으로 생각된다.
- 이들 각각의 콜로니는 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위한 27F (5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC A-3′)와 1492R (5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) 프라이머를 이용하여 direct PCR을 통해 PCR 산물을 얻은 후 solgent사(solgent)에 의뢰하여 16S rRNA gene의 염기서열 분석을 수행하였다. 분석된 각 염기 서열들은 EZbiocloud (http://www.ezbiocloud.net/)에서 염기서열을 확인하였다.
- 이들 각각의 콜로니는 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위한 27F (5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC A-3′)와 1492R (5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) 프라이머를 이용하여 direct PCR을 통해 PCR 산물을 얻은 후 solgent사(solgent)에 의뢰하여 16S rRNA gene의 염기서열 분석을 수행하였다.
- 장구균의 개체 수와 형광성의 상관성을 비교 분석하기 위해 시료를 30, 60, 90, 120, 150 CFU/100 ml이 되도록 희석한 후 41℃에서 18시간 Enterococcus Mixed F broth에 배양하여 1시간 간격으로 형광성을 측정하였고, 4-methylumbelliferyl-β-D-glycoside가 366 nm에서 blue 형광을 띄는 것을 이용하여 육안으로도 관찰하였다(Fig. 2).
- 0으로 조정하고 Enterococcus Mixed broth와 Enterococcus Mixed F broth에 각각 1%씩 접종한 후 41℃로 조정된 배양기에서 2일 정치배양하며 균의 생육과 형광성을 측정하였다. 측정은 2시간마다 배양액의 일정량을 분취한 후 UV-Spectrophotometer (SmartSpec3000, Bio-Rad)를 이용하여 600 nm에서 균체량을 측정하였고, VersaFluorTM Fluorometer (Bio-Rad)를 이용하여 형광성을 측정하였다.
- 채취된 시료는 멸균된 용기를 이용해 4℃를 유지하여 실험실로 운반하였다. 현장 시료는 Enterococcus Mixed broth와 Enterococcus Mixed F broth 배지 조성을 100 ml에 맞게 조정하여 멸균시킨 병에 첨가한 후, 담수와 해수에서 채취한 시료를 각각 100 ml씩 취하여 준비된 병에 분주하고 41℃에서 배양하며, 일정량씩 분취하여 600 nm의 UV-Spectrophotometer (SmartSpec3000, Bio-Rad)와, VersaFluorTM Fluorometer (Bio-Rad)를 이용하여 균체량과 형광성을 측정하였다.
- 현장시료의 장구균 확인을 위해 갑천 시료 100 ml을 membrane filter법을 이용하여 Enterococcus Mixed agar에서 41℃로 1일간 배양하여 검출된 콜로니 중 11개의 단일 콜로니를 임의로 분리하였다. 이들 각각의 콜로니는 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위한 27F (5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC A-3′)와 1492R (5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) 프라이머를 이용하여 direct PCR을 통해 PCR 산물을 얻은 후 solgent사(solgent)에 의뢰하여 16S rRNA gene의 염기서열 분석을 수행하였다.
대상 데이터
- Time course on the growth curve (A) and fluorescence measurement (B) of sample in fresh water. The samples were cultured in Enterococcus Mixed and Enterococcus F Mixed medium.
- 담수는 대전에 흐르고 있는 대전천, 관평천, 유등천 그리고 갑천에서 5곳을, 해수는 전라북도 군산시 금강하구에 있는 무역항인 군산항 근처에서 임의로 10곳을 선정하여 실험에 사용하였다. 채취된 시료는 멸균된 용기를 이용해 4℃를 유지하여 실험실로 운반하였다.
- 대전천, 유등천 그리고 관평천에서 각 1곳 그리고, 갑천은 두 곳에서 시료를 채취하여 총 5개의 담수 시료와 군산항 주변에서 임의로 11곳에서 해수 시료를 채취하였다. 담수 및 해수의 시료들은 각각 100 ml씩 Enterococcus Mixed medium을 첨가하여 41℃에서 48시간 동안 배양한 후 장구균의 생육 및 형광성을 측정한 결과 모든 시료에서 균이 생장하고 형광성을 띄는 것을 확인하였다.
- 기존에 알려진 여러 장구균 검출 배지 중 총 9종류(Enterococci Confirmatory agar, Azide dextrose agar, Bromocresol-purple azide agar, Esculin bile agar, Citrate azide tween carbonate agar, KF Streptococcus agar, BROLACIN agar, Kanamycin esculin azide agar, Membrane filter Enterococcus selective agar)의 배지를 선별하였고, 배지 성분을 적절히 조합하여 새로운 배지 Enterococcus Mixed medium을 개발하였다. 배지의 효과를 검증하기 위하여 장구균 6종류(Enterococcus avium KACC 10788, Enterococcus faecium KACC 11954, Enterococcus saccharolyticus KACC 10783, Enterococcus durans KACC 10787, Enterococcus faecalis KACC 11304, Enterococcus hirae KACC 10779)와 비장구균 3종류(Escherichia coli KACC 10005, Staphylococcus aureus subsp. aureus KACC 10768, Bacillussubtilis KACC 10111)를 사용하였다. 그 결과 새롭게 개발된 장구균 검출배지에서 비장구균의 생장이 억제된 반면에 장구균 6종류는 모두 생장하는 것을 확인하였다.
- 분원성 장구균 검출 배지를 개발하기 위해 9종의 공시균주를 사용하였다. 본 실험에 사용된 균주는 장구균 6종(Enterococcus avium KACC 10788, Enterococcus faecium KACC 11954, Enterococcus saccharolyticus KACC 10783, Enterococcus durans KACC 10787, Enterococcus faecalis KACC 11304, Enterococcus hirae KACC 10779)과 비장구균 3종(Escherichia coli KACC 10005, Staphylococcus aureus subsp. aureus KACC 10768, Bacillus subtilis KACC 10111)이고, 이들 균주는 한국농업미생물자원센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 분양 받아 사용하였다.
- 분원성 장구균 검출 배지를 개발하기 위해 9종의 공시균주를 사용하였다. 본 실험에 사용된 균주는 장구균 6종(Enterococcus avium KACC 10788, Enterococcus faecium KACC 11954, Enterococcus saccharolyticus KACC 10783, Enterococcus durans KACC 10787, Enterococcus faecalis KACC 11304, Enterococcus hirae KACC 10779)과 비장구균 3종(Escherichia coli KACC 10005, Staphylococcus aureus subsp.
- 장구균의 배양에 적합한 배지를 개발하기 위해, 장구균의 농화배양에 이용되고 있는 가장 일반적 배지인 Enterococci Confirmatory agar, Azide dextrose agar, Bromocresol-purple azide agar, Esculin bile agar, CATC (Citrate azide tween carbonate) agar, KF Streptococcus agar, BROLACIN (Bromothymol-blue Lactose Cystine) agar, Kanamycin esculin azide agar, Membrane filter Enterococcus selective agar 등 총 9종류의 배지(Sneath et al., 1986)를 일차 선별하여 본 실험에 사용하였다. 또 이들 9종류의 장구균 배지들을 다양한 조성으로 실험한 후 장구균 검출에 보다 적합한 Enterococcus Mixed Medium을 개발하였고(Table 1), 효소발색법시 형광성을 방해하는 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride 대신 장구균에 특이적으로 형광성을 나타내는 4-methyumbelliiferyl-β-D-glucoside (0.
성능/효과
- 개발된 각 배지에 9종의 공시균주를 접종하여 41℃에서 48시간 배양하며, 균의 생육과 형광성을 3회 반복하여 측정한 결과, E. faecium과 E. hirae 그리고 E. faecalis는 접종 후 6시간 안에 OD 1.0에 도달해 가장 활발히 생장하였고, E. saccharolyticus는 약 18시간 후에, E. avium은 26시간 후에 OD 1.0에 도달하였다. 그리고 E.
- 그 결과 7개 균주가 Enterococcus faecium ATCC 19434T과 99.64–100%, 3개 균주는 Enterococcus faecalis ATCC 19433T와 99.16–100%, 그리고 1개의 균주는 Enterococcus durans CECT411T와 99.88%의 상동성을 나타내었다(Table 3).
- 또 희석한 장구균의 이론적인 개체수를 확인하기 위해 각각의 희석한 시료를 막여과법을 이용하여 41℃에서 2일간 배양하며 직접 콜로니를 계수하였다. 그 결과 대부분 이론 값과 측정 값이 약 10 CFU/100 ml 정도의 차이를 보여 비교적 근사치를 나타냈으나, 150 CFU/100 ml에서는 약 30 CFU/100 ml 정도의 차이를 나타내었으나(Table 2), 장구균은 100 CFU/100 ml 이상의 유무로 오염 여부를 판단하므로 형광성을 이용하여 장구균을 판단하는데 문제가 없을 것으로 생각된다. 또 균 수에 따른 형광강도의 변화를 확인해본 결과 흥미롭게도 30, 60, 90 CFU/100 ml까지는 13시간부터 형광성이 나타나기 시작해 14시간만에 형광성이 최대값을 나타내고, 120, 150 CFU/100 ml에서는 12시간부터 형광성이 나타나 약 13–14시간만에 최대값을 나타내었다(Fig.
- aureus KACC 10768, Bacillussubtilis KACC 10111)를 사용하였다. 그 결과 새롭게 개발된 장구균 검출배지에서 비장구균의 생장이 억제된 반면에 장구균 6종류는 모두 생장하는 것을 확인하였다. 또 환경시료에서 장구균을 분리할 수 있는지 확인하기 위해 하천과 바다에서 채취해온 시료를 이용하여 실험한 결과 장구균의 생장을 확인하였다.
- 0에 도달하였다. 그리고 E. durans는 다른 장구균에 비해 비교적 늦게 생장하여 배양 30시간 후에도 OD 0.7을 나타내었고, 비장구균인 E. coli와 B. subtilis 그리고 S. areus는 모두 이 배지에서 생장이 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 1A). 그리고 형광성 측정에서 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride를 첨가할 경우 균의 생장 측정은 가능하지만, 배양액의 색 자체가 강하게 나타나 형광성은 측정할 수가 없었다.
- 1A). 그리고 형광성 측정에서 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride를 첨가할 경우 균의 생장 측정은 가능하지만, 배양액의 색 자체가 강하게 나타나 형광성은 측정할 수가 없었다. 따라서, 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride 제거한 후 대신 4-methylumbelliferyl-β-D-glycoside를 첨가하여 만든 배지에 각각의 균을 접종하여 형광성을 관찰한 결과, 장구균은 접종한 후 9시간부터 20시간 내에 측정치가 10,000 이상의 형광성이 나타나는 반면 비장구균은 생장이 저해됨과 동시에 형광성이 나타나지 않는 것을 확인하였다(Fig.
- 1까지 장구균이 생장하는 것을 확인하였다. 그리고 형광성은 담수보다는 늦은 약 30시간째부터 형광성이 나타나는 것을 확인하였다(Fig. 5). 이는 해수는 NaCl의 함량 등 여러 환경조건들 때문에 장구균 생장이 담수보다 다소 늦게 나타난 것으로 생각되지만 전체적으로 Enterococcus Mixed medium을 이용할 경우 담수와 해수에서 장구균을 검출 할 수 있음을 확인하였고, 또 장구균에 특이적으로 이용하는 4-methylumbelliferyl-β-D-glycoside을 이용할 경우 일반 담수와 해수에서 장구균 검출 시 특정 장비가 없어도 장구균의 존재 유무를 간접적으로 확인할 수 있어, 본 연구에서 개발된 배지가 추후 해수와 담수에서 장구균 검출에 유용하게 활용 될 수 있을 것이라 생각된다.
- 대전천, 유등천 그리고 관평천에서 각 1곳 그리고, 갑천은 두 곳에서 시료를 채취하여 총 5개의 담수 시료와 군산항 주변에서 임의로 11곳에서 해수 시료를 채취하였다. 담수 및 해수의 시료들은 각각 100 ml씩 Enterococcus Mixed medium을 첨가하여 41℃에서 48시간 동안 배양한 후 장구균의 생육 및 형광성을 측정한 결과 모든 시료에서 균이 생장하고 형광성을 띄는 것을 확인하였다. 즉, 담수에서는 배양한지 48시간 정도에서 약 OD 0.
- 따라서 Enterococcus Mixed F medium에서 41℃로 배양했을 때, 장구균이 약 100 CFU/100 ml 이상 존재 할 경우 약 13–14시간 이전에 형광성이 나타나고, 100 CFU/100 ml 이하일 경우 약 13–14시간이 지나서 형광성이 나타나는 것으로 확인되어 장구균의 개체수를 간접적으로 추정할 수 있을 것으로 판단된다.
- 또 환경시료에서 장구균을 분리할 수 있는지 확인하기 위해 하천과 바다에서 채취해온 시료를 이용하여 실험한 결과 장구균의 생장을 확인하였다. 따라서 이 배지를 이용하면 수질 분변오염의 지표가 되는 장구균을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
- 따라서, 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride 제거한 후 대신 4-methylumbelliferyl-β-D-glycoside를 첨가하여 만든 배지에 각각의 균을 접종하여 형광성을 관찰한 결과, 장구균은 접종한 후 9시간부터 20시간 내에 측정치가 10,000 이상의 형광성이 나타나는 반면 비장구균은 생장이 저해됨과 동시에 형광성이 나타나지 않는 것을 확인하였다(Fig. 1B).
- 1B). 따라서, 9종류의 장구균 배지에서는 일부 장구균만 생장하거나 비장구균이 생장한 반면 본 연구에서 개발한 Enterococcus Mixed medium은 6종의 모든 장구균이 생장하였고, 비장구균은 저해되어 새로이 개발된 Enterococcus Mixed medium이 장구균 검출에 적합한 배지임을 확인하였을 뿐만 아니라, 비장구균을 제외한 모든 장구균은 형광성을 나타내어 효소발색법을 이용한 Enterococcus F Mixed medium도 장구균 검출에 활용할 수 있음을 확인하였다.
- 또 균 수에 따른 형광강도의 변화를 확인해본 결과 흥미롭게도 30, 60, 90 CFU/100 ml까지는 13시간부터 형광성이 나타나기 시작해 14시간만에 형광성이 최대값을 나타내고, 120, 150 CFU/100 ml에서는 12시간부터 형광성이 나타나 약 13–14시간만에 최대값을 나타내었다(Fig. 3).
- 본 실험에 사용한 9종류의 장구균 배지 중 Azide dextrose 배지와 Citrate azide tween carbonate 배지 그리고 Membrane filter Enterococci Selective 배지가 장구균만 생장하고 비장구균들은 저해되어 장구균 검출에 비교적 적합한 배지로 확인되었다(자료 미제시). 그러나 이 배지들도 조건에 따라 일부 장구균이 생장하지 않거나 비장구균이 생장하였다.
- 담수 및 해수의 시료들은 각각 100 ml씩 Enterococcus Mixed medium을 첨가하여 41℃에서 48시간 동안 배양한 후 장구균의 생육 및 형광성을 측정한 결과 모든 시료에서 균이 생장하고 형광성을 띄는 것을 확인하였다. 즉, 담수에서는 배양한지 48시간 정도에서 약 OD 0.6에서 OD 1.2까지 생장하는 것을 확인하였고, 약 16시간부터 형광성이 나타났고(Fig. 4), 해수 역시 OD 0.7에서 OD 1.1까지 장구균이 생장하는 것을 확인하였다. 그리고 형광성은 담수보다는 늦은 약 30시간째부터 형광성이 나타나는 것을 확인하였다(Fig.
후속연구
- 따라서 Enterococcus Mixed F medium에서 41℃로 배양했을 때, 장구균이 약 100 CFU/100 ml 이상 존재 할 경우 약 13–14시간 이전에 형광성이 나타나고, 100 CFU/100 ml 이하일 경우 약 13–14시간이 지나서 형광성이 나타나는 것으로 확인되어 장구균의 개체수를 간접적으로 추정할 수 있을 것으로 판단된다. 뿐만 아니라 최근에는 이와 같은 효소발색법으로 대장균을 검사할 수 있는 키트를 제조하여 사용하고 있기 때문에(Lee et al., 2009), 담수나 해수에 존재하는 장구균을 본 연구에서 개발한 효소발색법을 이용하여 분석하면 매우 유효하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 이는 해수는 NaCl의 함량 등 여러 환경조건들 때문에 장구균 생장이 담수보다 다소 늦게 나타난 것으로 생각되지만 전체적으로 Enterococcus Mixed medium을 이용할 경우 담수와 해수에서 장구균을 검출 할 수 있음을 확인하였고, 또 장구균에 특이적으로 이용하는 4-methylumbelliferyl-β-D-glycoside을 이용할 경우 일반 담수와 해수에서 장구균 검출 시 특정 장비가 없어도 장구균의 존재 유무를 간접적으로 확인할 수 있어, 본 연구에서 개발된 배지가 추후 해수와 담수에서 장구균 검출에 유용하게 활용 될 수 있을 것이라 생각된다.
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