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문제 정의
- 본 연구에서는 GABA를 다량 함유하고 있는 유산균 발효 다시마 추출물의 AChE 및 PEP 효소 저해활성 기능을 살펴보고, 정상 동물모델에서 학습 및 기억력 증진 효과를 검증하여 유산균 발효 다시마 추출물의 기억력 및 인지능력 개선 기능성을 평가하고자 하였다.
- , 2012).작업 기억은 장기 기억이 아니라 단기 기억의 일종으로 본 연구에서는 행동실험을 통해 control 군과 시험군의 비교 분석을 통해 단기기억력 개선 정도를 검증하고자 하였다.
제안 방법
- (Busan, Korea)에서 분리 동정한 균주를 사용하였다. 유산균 발효 다시마 추출물은 다시마(81.7%), 배지성분(효모농축액 2%, 함수포도당 1%)과 유산균 배양액(15.3%)을 혼합하여 발효하였다, 이때 사용된 다시마는 적당한 크기로 분쇄한 건다시마를 사용하였고 물은 다시마의 15배(w/v)를 첨가하였다. 배지성분을 멸균(121℃, 30분) 후 균주(L.
- 3%)을 혼합하여 발효하였다, 이때 사용된 다시마는 적당한 크기로 분쇄한 건다시마를 사용하였고 물은 다시마의 15배(w/v)를 첨가하였다. 배지성분을 멸균(121℃, 30분) 후 균주(L. brevis BJ20, 15.3%) 를 접종하여 발효(37℃, 48시간) 후 멸균(121℃, 30분)하고 여과 농축과정을 거쳐 건조한 분말을 실험에 사용하였다.
- AChE 저해 활성 측정은 Ellman et al. (1961)의 방법을 변형하여 측정하였다. AChE와 acetylthocholine iodine (ATC)은 100 mM phosphate buffer (pH 8.
- (1961)의 방법을 변형하여 측정하였다. AChE와 acetylthocholine iodine (ATC)은 100 mM phosphate buffer (pH 8.0)에 녹여 각각 0.25 U/ mL와 75 mM을 제조하였으며, 발색시약은 39.6 mg의 DTNB [5, 5-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)]와 15 mg의 sodium bicarbonate를 100 mM phosphate buffer (pH 8.0) 10 mL에 녹여 제조하였다. 추출물 30 μL에 phosphate buffer (100 mM, pH 8.
- PEP 저해활성 측정은 Toda et al. (1992)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉 0.
- 25 unit/mL 효소 20 μL, 시료액 10 μL의 혼합액을 96 well plate에 넣고 37℃에서 10분간 반응시킨 후 20 mM Z-Gly-Pro-pNA 20 μL를 가하여 37℃에서 30분간 반응시키고 410 mM에서 흡광도를 측정(A) 하였다. 따로 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0) 240 μL와 시료액 10 μL의 혼합액을 준비하여 역시 410 nm에서 흡광도 측정(B) 후 아래와 같은 식으로 저해울을 조사하였다. 이때 controle 시료액 대신 시료액을 녹인 용매를 사용하여 흡광도를 (C)를 측정하였다.
- 실험동물은 실험동물실에서 약 1주간 순화시키면서 예비사육을 실시하였으며, 예비사육기간 동안 모든 동물의 일반 건강상태에 대한 수의학적 검역을 실시하여 16마리를 선별하였다. 선별된 실험동물은 각 군별로 8마리씩 구성하였으며, 군분리시 군평균체중및 군표준편차를 계산하여 균등성 여부를 확인하였다. 실험기간동안 FST (실험집단)와 증류수(통제집단)를 각각 100 mg/ kg을 증류수에 희석하여 10 µL/g 씩 2주간 매일 1회 경구 투여하였다.
- 선별된 실험동물은 각 군별로 8마리씩 구성하였으며, 군분리시 군평균체중및 군표준편차를 계산하여 균등성 여부를 확인하였다. 실험기간동안 FST (실험집단)와 증류수(통제집단)를 각각 100 mg/ kg을 증류수에 희석하여 10 µL/g 씩 2주간 매일 1회 경구 투여하였다.
- T자 형태의 미로의 긴 통로 쪽에 마우스를 위치하게 하고 갈림길에서 새로운 길을 찾아가는 특성을 이용하여, 이미 다녀온통로를 순간적으로 기억(working memory)하는지를 검증하였다. 첫번째 선택한 통로와 동일한 통로를 다시 선택한다면 point 0, 새로운 통로를 선택한다면 point 1을 부여하고 개별 마우스당 하루에 2번, 이틀간 진행하였고 각 실험이 끝난 후에는 전 실험동물의 흔적을 지우기 위해 70% alcohol로 닦아 다음 실험에 영향을 주지 않도록 하였다.
- 첫번째 선택한 통로와 동일한 통로를 다시 선택한다면 point 0, 새로운 통로를 선택한다면 point 1을 부여하고 개별 마우스당 하루에 2번, 이틀간 진행하였고 각 실험이 끝난 후에는 전 실험동물의 흔적을 지우기 위해 70% alcohol로 닦아 다음 실험에 영향을 주지 않도록 하였다.
- , 1997). 따라서 유산균 발효 다시마 추출물 농도별로(1, 2, 4, 8 mg/mL) PEP 저해활성을 분석하였다. 그 결과 유산균 발효 다시마 추출물 4와 8 mg/mL 처리시 각각 28.
대상 데이터
- 다시마는 부산광역시 소재 서진기장영어조합법인에서 구입하여 사용하였고, Lactobacillus brevis BJ20 (L. brevis BJ20) 은 Marinebioprocess Co., Ltd. (Busan, Korea)에서 분리 동정한 균주를 사용하였다. PEP (Flavobacterium meningosepticum유래)와 기질(Z-Gly-Pro-pNA)은 일본 생화학공업사 (Seikagaku Co.
- (Busan, Korea)에서 분리 동정한 균주를 사용하였다. PEP (Flavobacterium meningosepticum유래)와 기질(Z-Gly-Pro-pNA)은 일본 생화학공업사 (Seikagaku Co., Japan)로부터 구입하였으며, 기타 모든 시약은 Sigma Co. (St. Louis, Mo, USA)를 사용하였다.
- 다시마 발효에 사용된 L. brevis BJ20은 Marinebioprocess Co., Ltd. (Busan, Korea)에서 분리 동정한 균주를 사용하였다. 유산균 발효 다시마 추출물은 다시마(81.
- 유산균 발효 다시마 추출물(FST)의 기억력 증진 효과를 검증하기 위하여 6개월령 FVB/N mice를 사용하였다. 실험동물은 실험동물실에서 약 1주간 순화시키면서 예비사육을 실시하였으며, 예비사육기간 동안 모든 동물의 일반 건강상태에 대한 수의학적 검역을 실시하여 16마리를 선별하였다.
- 실험동물은 실험동물실에서 약 1주간 순화시키면서 예비사육을 실시하였으며, 예비사육기간 동안 모든 동물의 일반 건강상태에 대한 수의학적 검역을 실시하여 16마리를 선별하였다. 선별된 실험동물은 각 군별로 8마리씩 구성하였으며, 군분리시 군평균체중및 군표준편차를 계산하여 균등성 여부를 확인하였다.
데이터처리
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통계처리
통계분석은 SPSS version 15 software (SPSS Inc., USA)를 사용하였고, 실험결과는 평균 ± 표준편차로 표기하였다. 각 그룹간 차이는 분산분석(ANOVA)을 사용하여 통계학적 유의성을 판정하였고 P<0.
- , USA)를 사용하였고, 실험결과는 평균 ± 표준편차로 표기하였다. 각 그룹간 차이는 분산분석(ANOVA)을 사용하여 통계학적 유의성을 판정하였고 P<0.05 수준에서 유의성 검정을 수행하였다.
이론/모형
- , 2012). 본 연구에서 수행된 T-maze test는 기억에 관한 연구 목적으로 많이 사용되는 실험으로 다양한 형태로 응용이 가능하며, T-maze test를 통해 작업기억(working memory)을 검증할 수 있다(Deacon and Rawlins, 2006; Shoji et al., 2012).작업 기억은 장기 기억이 아니라 단기 기억의 일종으로 본 연구에서는 행동실험을 통해 control 군과 시험군의 비교 분석을 통해 단기기억력 개선 정도를 검증하고자 하였다.
성능/효과
- 이에 기억력 및 인기기능 관련 효소 저해 활성을 평가하기 위해 다양한 생리활성 물질이 포함되어 있는 유산균 발효 다시마추출물 농도에 따른 AChE 저해활성을 평가한 결과, Fig. 1에서보는 바와 같이, L. brevis BJ20으로 발효한 다시마추출물에서 효소저해활성이 나타났으며, 시료 0.1, 0.25, 0.5, 1 mg/mL 처리한 샘플에서 각각 8.2±0.4, 24.1±2.1, 46.3±2.4, 96.9±1.5% 의 AChE 저해 활성을 보여 농도의존적으로 억제활성이 증가하는 결과를 나타내었다.
- 따라서 유산균 발효 다시마 추출물 농도별로(1, 2, 4, 8 mg/mL) PEP 저해활성을 분석하였다. 그 결과 유산균 발효 다시마 추출물 4와 8 mg/mL 처리시 각각 28.2±1.2, 57.5±1.9% 의 저해활성을 나타내었고, Fig. 2에서 보는 바와 같이 PEP 저해활성 또한 AChE와 마찬가지로 높게 나타났으며 농도 의존적으로 저해활성이 증가함을 확인하였다.
- 3에 나타내었다. T-maze test에서 나타난 alteration (%)은 단기 공간인지 기억력 회복의 지표로 사용 되며, 분석 결과 Control 그룹에서 56% 의 alternation을 보였고, 유산균 발효 다시마 추출물에서 78% 로 Control 그룹보다 alternation이 증가하는 결과를 확인할 수 있었으며, one–way ANOVA 검증 결과 통계적으로 유의한 차이를 확인하였다(P <0.05).
- , 2016). 따라서 유산균 발효 다시마 추출물의 투여가 AChE 저해, PEP 저해 등 다양한 기전을 통해 기억력 개선에 도움을 줄수 있는 것으로 추측할 수 있다.
후속연구
- 8%로 비교적 높은 억제활성을 나타내었다고 보고하였다. 이와 비교하였을 때유산균 발효 다시마 추출물의 경우 1 mg/mL에서 96.9±1.5% 의 AChE 저해 효과를 보여 상대적으로 저해활성이 높은 것으로 확인되었으며 이에 기억력 개선 효과가 우수한 기능성 식품소재로 이용가능할 것으로 기대된다.
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