식품으로부터 식중독 세균 검출을 위한 Real-time PCR에 적합한 DNA 추출 방법 비교 Comparison of DNA isolation methods for detection of foodborne pathogens by real-time PCR from foods원문보기
본 연구에서는 다양한 식품으로부터 식중독 세균의 DNA를 추출하는 효율을 비교 하였다. 사용된 DNA 추출 방법은 TaKaRa Kit를 이용하는 방법, PrepMan reagent를 이용하는 방법, boiling method, PEG를 이용한 alkaline method가 사용되었다. 비용절감이나 시간절약 면에서 boiling method나 PrepMan method도 고려할 수 있지만, column kit를 이용하는 TaKaRa kit가 효율적이라고 판단되었다. 또한 정성 시험법에서 적은 양의 균을 검출하기 위해 증균배양을 거치게 되는데 이때 사용되는 증균배지의 성분이 DNA 추출 후에도 잔류하여 saline과 비교하였을 때 DNA 추출효율이 낮은 결과를 나타내었다. 따라서 증균배지의 성분을 제거한 뒤 DNA를 추출하는 것이 PCR의 효율을 높일 수 있을 것으로 예상된다. 정량 시험법에서는 증균과정을 거치지 않아 균을 검출할 때 DNA의 추출 효율이 중요하기 때문에 DNA 추출 효율을 높이기 위한 가장 좋은 버퍼를 선정하고자 하였다. 그 결과 E. coli O157:H7에서는 saline이, S. aureus에서는 증류수를 버퍼로 사용했을 때 DNA 추출 효율이 가장 높은 것으로 나타났다.
본 연구에서는 다양한 식품으로부터 식중독 세균의 DNA를 추출하는 효율을 비교 하였다. 사용된 DNA 추출 방법은 TaKaRa Kit를 이용하는 방법, PrepMan reagent를 이용하는 방법, boiling method, PEG를 이용한 alkaline method가 사용되었다. 비용절감이나 시간절약 면에서 boiling method나 PrepMan method도 고려할 수 있지만, column kit를 이용하는 TaKaRa kit가 효율적이라고 판단되었다. 또한 정성 시험법에서 적은 양의 균을 검출하기 위해 증균배양을 거치게 되는데 이때 사용되는 증균배지의 성분이 DNA 추출 후에도 잔류하여 saline과 비교하였을 때 DNA 추출효율이 낮은 결과를 나타내었다. 따라서 증균배지의 성분을 제거한 뒤 DNA를 추출하는 것이 PCR의 효율을 높일 수 있을 것으로 예상된다. 정량 시험법에서는 증균과정을 거치지 않아 균을 검출할 때 DNA의 추출 효율이 중요하기 때문에 DNA 추출 효율을 높이기 위한 가장 좋은 버퍼를 선정하고자 하였다. 그 결과 E. coli O157:H7에서는 saline이, S. aureus에서는 증류수를 버퍼로 사용했을 때 DNA 추출 효율이 가장 높은 것으로 나타났다.
This study was conducted to find out the most suitable DNA isolation methods for PCR detection of foodborne pathogens. Four DNA isolation methods including Universal Genomic DNA Extraction Kit (TaKaRa), PrepMan Ultra (Applied Biosystems), boiling method and alkaline lysis method (w/PEG) were tested ...
This study was conducted to find out the most suitable DNA isolation methods for PCR detection of foodborne pathogens. Four DNA isolation methods including Universal Genomic DNA Extraction Kit (TaKaRa), PrepMan Ultra (Applied Biosystems), boiling method and alkaline lysis method (w/PEG) were tested and compared. The Universal Genomic DNA Extraction kit (TaKaRa) was considered as the more efficient isolation method for Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus in lettuce, fish and beef. Meanwhile to detect the foodborne pathogens directly from foods without enrichment, the four different buffers such as double-distilled water, saline, glycine-saline, glycine-saline with Tween-20 and beef extract were also evaluated. As a result, saline was more suitable buffer for E. coli O157:H7. And double-distilled water was more suitable buffer than saline for S. aureus, respectively
This study was conducted to find out the most suitable DNA isolation methods for PCR detection of foodborne pathogens. Four DNA isolation methods including Universal Genomic DNA Extraction Kit (TaKaRa), PrepMan Ultra (Applied Biosystems), boiling method and alkaline lysis method (w/PEG) were tested and compared. The Universal Genomic DNA Extraction kit (TaKaRa) was considered as the more efficient isolation method for Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus in lettuce, fish and beef. Meanwhile to detect the foodborne pathogens directly from foods without enrichment, the four different buffers such as double-distilled water, saline, glycine-saline, glycine-saline with Tween-20 and beef extract were also evaluated. As a result, saline was more suitable buffer for E. coli O157:H7. And double-distilled water was more suitable buffer than saline for S. aureus, respectively
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 PCR을 수행할 때 효율을 높일 수 있는 방법을 확인하고자 다양한 DNA 추출법을 비교하였다. 또한 증균과정을 거치지 않고 식품에서 직접 식중독 세균을 검출하기 위한 균질화 버퍼(stomaching buffer)로서 saline, glycine-saline, 증류수 등의 효과를 분석하였다.
E. coli O157:H7과 S. aureus의 목적 유전자(target gene)를 각각 stx2, femA로 하여 프라이머(primer)와 프루브(probe)를 제작하였다 (Table 1). Real-time PCR을 위한 반응물 조성은 다음과 같다.
DNA 추출 효율을 비교하기 위해 kit를 이용하는 방법, PrepMan Ultra sample preparation reagent (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) method, boiling method, alkaline PEG method의 네 가지 방법을 사용하였다. Kit는 MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit ver.5.0 (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan)을 사용하였고 제조사에서 제공하는 방법에 따라 추출하였다. PrepMan reagent도 제조사에서 제공하는 방법에 따라 추출하였다.
coli O157:H7에 대한 검출방법으로는 시료를 증균배지에서 1차 배양한 뒤, sorbitol MacConkey agar에서 2차 분리 배양한 후 무색 집락을 확인하고 이후 동정검사를 실시한다(6). S. aureus에 대한 검출방법으로는 10% (w/v) NaCl을 첨가한 tryptic soy broth (TSB)를 증균배지로 사용하여 1차 배양한 뒤, Baird-Parker agar, coagulase 확인시험을 실시한다(7). 이와 같은 방법은 전통적인 배지배양법으로 위양성 결과가 빈번하고 검사기간이 오래 걸리며(3-5일) 많은 노동력이 소모되는 것이 단점이다(8,9).
4 µL를 혼합하여 총 부피를 20 µL로 96-well plate에 준비하였다. StepOne Plus realtime PCR systems (Applied Biosystems)를 사용하여 real-time PCR을 수행하였다. 반응조건은 95℃에서 10분간 pre-denaturation 한 뒤, 95℃에서 10초, 60℃에서 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle 수행되었다.
균질화 후 각각을 1 mL씩 취하여 DNA 분리에 사용하였으며 모두 3반복 실험을 수행하였다. 각 DNA 추출 방법의 효율을 비교하기 위해 미생물배지 배양액과 인위 접종된 각 식품에서 DNA 추출도 수행하였다. DNA 추출 효율을 비교하기 위해 kit를 이용하는 방법, PrepMan Ultra sample preparation reagent (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) method, boiling method, alkaline PEG method의 네 가지 방법을 사용하였다.
각각의 식품을 25 g씩 멸균백(Whirl-pak, 19×30cm; Nasco, Fort Atkinson, WI, USA)에 소분하였다.
225 mL의 saline, 증균배지, 조성을 달리한 다양한 버퍼를 각각 넣은 뒤 stomacher (Laboratory Blender Stomacher 400; Seward, MO, USA)를 이용하여 2분간 균질화하였다. 균질화 후 각각을 1 mL씩 취하여 DNA 분리에 사용하였으며 모두 3반복 실험을 수행하였다. 각 DNA 추출 방법의 효율을 비교하기 위해 미생물배지 배양액과 인위 접종된 각 식품에서 DNA 추출도 수행하였다.
따라서 본 연구에서는 PCR을 수행할 때 효율을 높일 수 있는 방법을 확인하고자 다양한 DNA 추출법을 비교하였다. 또한 증균과정을 거치지 않고 식품에서 직접 식중독 세균을 검출하기 위한 균질화 버퍼(stomaching buffer)로서 saline, glycine-saline, 증류수 등의 효과를 분석하였다.
mTSB의 조성 및 제조방법은 다음과 같다. 즉, TSB (30 g/L; Oxoid)에 bile salt no. 3 (1.5 g/L; Oxoid), dipotassium phosphate(1.5 g/L; Oxoid), NaCl (15 g/L; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)을 첨가하여 고압 멸균한 뒤 novobiocin (20 mg/L; Oxoid)을 여과 멸균하여 가하였다. 10% (w/v) NaCl이 첨가된 TSB는 TSB (30 g/L; Oxoid)에 NaCl (90 g/L; Sigma-Aldrich)을 첨가한 뒤 고압 멸균하여 제조하였다.
증균배지가 real-time PCR에 미치는 영향을 확인하기 위해 E. coli O157:H7의 증균배지인 modified tryptic soy broth (mTSB)와 S. aureus의 증균배지인 10% (w/v) NaCl이 첨가된 TSB와 0.85% saline을 비교하였다. 각 증균배지는 식품공전에 따라 제조하였다.
현재 E. coli O157:H7에 대한 검출방법으로는 시료를 증균배지에서 1차 배양한 뒤, sorbitol MacConkey agar에서 2차 분리 배양한 후 무색 집락을 확인하고 이후 동정검사를 실시한다(6). S.
식품은 양상추, 광어회, 소고기를 선정하여 정릉동 인근 마트에서 구입하였다. 각각의 식품을 25 g씩 멸균백(Whirl-pak, 19×30cm; Nasco, Fort Atkinson, WI, USA)에 소분하였다.
이론/모형
PrepMan reagent도 제조사에서 제공하는 방법에 따라 추출하였다. Boiling method는 de Medici 등(16)에 의한 방법에 따라 추출하였고, alkaline PEG method는 PEG 200 (Sigma-Aldrich)을 이용하여 Chomczynski와 Rymaszewski(17)에 의한 방법에 따라 추출하였다.
각 DNA 추출 방법의 효율을 비교하기 위해 미생물배지 배양액과 인위 접종된 각 식품에서 DNA 추출도 수행하였다. DNA 추출 효율을 비교하기 위해 kit를 이용하는 방법, PrepMan Ultra sample preparation reagent (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) method, boiling method, alkaline PEG method의 네 가지 방법을 사용하였다. Kit는 MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit ver.
, Shiga, Japan)을 사용하였고 제조사에서 제공하는 방법에 따라 추출하였다. PrepMan reagent도 제조사에서 제공하는 방법에 따라 추출하였다. Boiling method는 de Medici 등(16)에 의한 방법에 따라 추출하였고, alkaline PEG method는 PEG 200 (Sigma-Aldrich)을 이용하여 Chomczynski와 Rymaszewski(17)에 의한 방법에 따라 추출하였다.
성능/효과
순수 배양액으로부터 DNA를 추출하는 경우에는 추출 방법에 따라 효율에 큰 영향을 미치지 않을 것으로 생각되었다. Boiling method와 PrepMan method는 추출하기까지 시료 1개 기준으로 약 15분 정도의 시간이 소요되며, alkaline PEG method는 약 30분, TaKaRa kit를 이용한 경우는 약 50분 정도의 시간이 소요되는 것을 확인 하였다. 따라서 비용과 시간의 효율성을 고려한다면 boiling method나 PrepMan method가 순수배양액에서 DNA를 추출하는 효과적인 방법으로 판단되었다.
48로 나타나 증류수가 아닌 saline을 쓰는 것이 효율적인 것으로 확인하였다. S. aureus의 경우 Ct 값이 소고기는 saline에서 32.71, 회는 증류수에서 34.70, 양상추는 증류수에서 33.99로 전반적으로 증류수가 더 효율적인 것을 확인하였다. 이러한 버퍼의 효율 차이는 bacteria의 종류나 버퍼의 recovery 효과에서 기인한다고 생각되었다.
aureus 각각의 증균배지인 mTSB와 10% (w/v) NaCl이 첨가된 TSB를 사용했을 때의 결과를 나타내었다. Saline을 버퍼로 사용한 경우에는 소고기에서는 TaKaRa kit를 이용한 경우에만 검출이 되었고, 그 외의 방법에서는 검출이 되지 않음을 확인하였다. E.
Boiling method와 PrepMan method는 추출하기까지 시료 1개 기준으로 약 15분 정도의 시간이 소요되며, alkaline PEG method는 약 30분, TaKaRa kit를 이용한 경우는 약 50분 정도의 시간이 소요되는 것을 확인 하였다. 따라서 비용과 시간의 효율성을 고려한다면 boiling method나 PrepMan method가 순수배양액에서 DNA를 추출하는 효과적인 방법으로 판단되었다.
정량시험법에서는 식품자체에서 유래하는 PCR 저해물질에 의한 저해를 극복하면서 균을 식품으로부터 효율적으로 분리할 수 있는 버퍼 조성이 중요하다. 따라서 이러한 전처리 조건 확립은 식품에서 효율적으로 균을 분리하여 DNA를 분리할 수 있게 하여 PCR 검출의 효율성을 증대 시킬 수 있을 것으로 판단된다.
Elizaquivel과 Aznar(19)의 연구에서는 PrepMan method 등 열을 이용하여 DNA를 추출하는 방법은 사용법이 간편하고 비용적인 측면에서 저렴하나 추출물이 불안정하거나 때때로 혼탁하기 때문에 추출 효율이 우수하지 않으며, column kit를 이용하는 방법이 효율적이라고 언급하였다. 본 실험을 통해 확인한 결과 모든 추출 방법에서 효율이 비슷하였다. 순수 배양액으로부터 DNA를 추출하는 경우에는 추출 방법에 따라 효율에 큰 영향을 미치지 않을 것으로 생각되었다.
DNA 추출 효율을 높이는 방법 중 버퍼의 조성에 변화를 주는 것도 효과적인 방법이라고 판단된다. 본 연구에서는 E. coli O157:H7에서는 saline이 적합하며 S. aureus에서는 증류수가 적합한 버퍼인 것으로 측정하였다. 정성 시험법에서 균을 증식하는데 사용되는 증균배지의 성분을 제거하고 식품과 균의 종류에 따라 적합한 버퍼를 사용한다면 DNA 추출 효율이 높아질 것으로 보인다.
aureus는 105까지검출되었다. 양상추에서는 PrepMan method 외에 모든 방법에서 검출이 되었으며 E. coli O157:H7은 boiling method에서 102으로 가장 낮았고, S. aureus에서는 alkaline PEG method에서 103으로 가장 낮았다. 위의 결과를 토대로 버퍼로 증균배지를 사용했을 때 보다 saline을 사용했을 때 검출한계가 낮은 것을 확인하였다.
회에서는 alkaline PEG method 외에 모든 방법에서 검출이 되었는데 TaKaRa kit를 이용한 경우에 각 균에서 103까지 검출되었다. 양상추에서는 모든 방법에서 잘 검출이 되었으며 E. coli O157:H7에서는 boiling method에서 102으로 가장 낮았고, S. aureus에서는 TaKaRa kit에서 104으로 가장 낮았다. 증균배지를 버퍼로 사용한 경우, 소고기에서는 PrepMan method에서 검출이 되지 않았으며, alkaline PEG method에서는 S.
aureus에서는 alkaline PEG method에서 103으로 가장 낮았다. 위의 결과를 토대로 버퍼로 증균배지를 사용했을 때 보다 saline을 사용했을 때 검출한계가 낮은 것을 확인하였다. Hyeon 등(20)의 연구결과에서 증균배지의 성분이 PCR반응에 저해제로 작용하는 것을 보고하였다.
이러한 결과를 종합해 볼 때, DNA 추출 효율은 식품에 따라, 균에 따라 달라지는 것을 확인하였다. 따라서 적합한 DNA 추출 방법을 선택하는 것이 PCR 효율을 높이는 데 중요한 요인이 될 것으로 보인다.
정량 시험법에서 식품을 균질화하는 버퍼의 조성을 다르게 했을 때의 DNA 추출 효율을 비교한 결과, E. coli O157:H7, S. aureus 각 균에서 차이를 보였다. E.
후속연구
따라서 적합한 DNA 추출 방법을 선택하는 것이 PCR 효율을 높이는 데 중요한 요인이 될 것으로 보인다. 또한 증균배지가 PCR 작용을 저해하는 것으로 보아 DNA를 추출할 때 증균배지의 성분을 제거하는 washing step을 거치거나, 두 가지 이상의 DNA 추출 방법을 병합하여 사용하여 저해요인을 제거하는 등의 전처리가 필요할 것으로 보인다. DNA 추출 효율을 높이는 방법 중 버퍼의 조성에 변화를 주는 것도 효과적인 방법이라고 판단된다.
coli O157:H7이 접종된 양상추에서는 recovery 효율이 좋았기 때문에 Ct값이 가장 적게 나온 것으로 생각되었다. 이와 같은 버퍼에 대한 연구는 미비한 실정이기 때문에 추후 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Verotoxin의 인체 유해성은?
감염경로는 주로 덜 익힌 고기, 유제품, 과일, 물 등 다양한 것으로 알려져 있다. Verotoxin으로 인해 출혈성 대장염, 혈전성 혈소판 감염증 및 용혈성 요독증후군 등의 증상이 나타나며 사망에 이르기까지 한다(1-3).
Escherichia coli O157:H7이란?
Escherichia coli O157:H7은 장관출혈성 대장균으로 그람 음성, 간균 형태의 통성혐기성균으로 verotoxin을 생산하는 균이다. 감염경로는 주로 덜 익힌 고기, 유제품, 과일, 물 등 다양한 것으로 알려져 있다.
Escherichia coli O157:H7의 감염경로는?
Escherichia coli O157:H7은 장관출혈성 대장균으로 그람 음성, 간균 형태의 통성혐기성균으로 verotoxin을 생산하는 균이다. 감염경로는 주로 덜 익힌 고기, 유제품, 과일, 물 등 다양한 것으로 알려져 있다. Verotoxin으로 인해 출혈성 대장염, 혈전성 혈소판 감염증 및 용혈성 요독증후군 등의 증상이 나타나며 사망에 이르기까지 한다(1-3).
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