느티나무 잎 에틸아세테이트 분획물 및 열수 추출물의 항산화 및 산화적 DNA 손상 억제 활성 Antioxidant activities and inhibitory effects on oxidative DNA damage of leaf from Zelkova serrata with ethyl acetate fractions and hot water extracts원문보기
활성산소종은 DNA의 손상에서 중요한 역할을 한다. 최근 활성산소를 제어하고 조절하기 위해 천연항산화제를 개발하기 위해 많은 노력이 이루어지고 있다. 느티나무(Zelkova serrate)는 느릅나무과의 식물로 한국 마을 입구에 흔히 심어져 친숙한 식물이다. 하지만 느티나무의 항산화 활성 및 산화적 DNA 손상에 대한 방어효과에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 본 연구에서 느티나무 잎의 에틸아세테이트 분획물 및 열수 추출물의 항산화 활성 및 산화적 DNA 손상에 대한 억제활성을 확인하였다. 에틸아세테이트 분획물은 열수 추출물에 비해 DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활성, $Fe^{2+}$ 킬레이팅 활성 그리고 reducing power에서 높은 항산화 활성을 보였다. 또한, 페놀류 화합물 함량은 각각 에틸아세테이트 분획물은 56.63 mg/g 그리고 열수 추출물은 51.61 mg/g으로 분석됐다. ${\phi}X$-174 RF I plasmid DNA를 이용한 산화적 DNA 손상억제활성은 에틸아세테이트 분획물과 열수 추출물 모두 상당한 방어효과를 나타냈다. 따라서 느티나무 잎의 에틸아세테이트 분획물 및 열수 추출물은 뛰어난 항산화 활성 및 산화적 DNA 손상 억제 효과를 통한 천연 자원으로서의 잠재성을 보였다.
활성산소종은 DNA의 손상에서 중요한 역할을 한다. 최근 활성산소를 제어하고 조절하기 위해 천연항산화제를 개발하기 위해 많은 노력이 이루어지고 있다. 느티나무(Zelkova serrate)는 느릅나무과의 식물로 한국 마을 입구에 흔히 심어져 친숙한 식물이다. 하지만 느티나무의 항산화 활성 및 산화적 DNA 손상에 대한 방어효과에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 본 연구에서 느티나무 잎의 에틸아세테이트 분획물 및 열수 추출물의 항산화 활성 및 산화적 DNA 손상에 대한 억제활성을 확인하였다. 에틸아세테이트 분획물은 열수 추출물에 비해 DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활성, $Fe^{2+}$ 킬레이팅 활성 그리고 reducing power에서 높은 항산화 활성을 보였다. 또한, 페놀류 화합물 함량은 각각 에틸아세테이트 분획물은 56.63 mg/g 그리고 열수 추출물은 51.61 mg/g으로 분석됐다. ${\phi}X$-174 RF I plasmid DNA를 이용한 산화적 DNA 손상억제활성은 에틸아세테이트 분획물과 열수 추출물 모두 상당한 방어효과를 나타냈다. 따라서 느티나무 잎의 에틸아세테이트 분획물 및 열수 추출물은 뛰어난 항산화 활성 및 산화적 DNA 손상 억제 효과를 통한 천연 자원으로서의 잠재성을 보였다.
Reactive oxygen species (ROS) has been played a critical role in damage of DNA. Recently, many effort is focusing to develop the natural antioxidants for controlling ROS. Zelkova serrata, Ulmaceae, is close as plants which are planted in front of Korea villages. Although Zelkova serrata is familiar ...
Reactive oxygen species (ROS) has been played a critical role in damage of DNA. Recently, many effort is focusing to develop the natural antioxidants for controlling ROS. Zelkova serrata, Ulmaceae, is close as plants which are planted in front of Korea villages. Although Zelkova serrata is familiar with Koreans, those of antioxidant activities and protective effects on oxidative DNA damage haven't studied. We demonstrated antioxidant activities and inhibitory effects on oxidative DNA damage of Leaf from Zelkova serrata with ethyl acetate fractions (EA) and hot water extracts (HW). Between the extracts, EA showed higher activities in 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl, 2,2'-azino-bis[3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid radical scavenging, $Fe^{2+}$ chelating and reducing power than HW. Also, those of total phenolic content are 56.63 and 51.61 mg/g respectively. In addition, ${\phi}X$-174 RF I plasmid DNA cleavage assay for inhibitory effect by oxidative DNA damage was both EA and HW has significant protective effect on oxidative DNA damage. The results suggested that leaf from Zelkova serrata with ethyl acetate fractions and hot water extracts have surpassing potential as natural resources with antioxidant and inhibitory effect on oxidative DNA damage.
Reactive oxygen species (ROS) has been played a critical role in damage of DNA. Recently, many effort is focusing to develop the natural antioxidants for controlling ROS. Zelkova serrata, Ulmaceae, is close as plants which are planted in front of Korea villages. Although Zelkova serrata is familiar with Koreans, those of antioxidant activities and protective effects on oxidative DNA damage haven't studied. We demonstrated antioxidant activities and inhibitory effects on oxidative DNA damage of Leaf from Zelkova serrata with ethyl acetate fractions (EA) and hot water extracts (HW). Between the extracts, EA showed higher activities in 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl, 2,2'-azino-bis[3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid radical scavenging, $Fe^{2+}$ chelating and reducing power than HW. Also, those of total phenolic content are 56.63 and 51.61 mg/g respectively. In addition, ${\phi}X$-174 RF I plasmid DNA cleavage assay for inhibitory effect by oxidative DNA damage was both EA and HW has significant protective effect on oxidative DNA damage. The results suggested that leaf from Zelkova serrata with ethyl acetate fractions and hot water extracts have surpassing potential as natural resources with antioxidant and inhibitory effect on oxidative DNA damage.
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문제 정의
하지만 느티나무의 항산화 활성 및 산화적 DNA 손상에 대한 방어효과에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 본 연구에서 느티나무 잎의 에틸아세테이트 분획물 및 열수 추출물의 항산화 활성 및 산화적 DNA 손상에 대한 억제활성을 확인하였다. 에틸아세테이트 분획물은 열수 추출물에 비해 DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활성, Fe2+ 킬레이팅 활성 그리고 reducing power에서 높은 항산화 활성을 보였다.
느티나무는 3-hydroxylated flavonoid C-glucosides (Hayashi 등, 1987), 7-hydroxy-3-methoxycadalrene(Kim 등, 2004)이 분석되었고, 최근까지 항진균 활성 및 항산화(Lee 등, 2000), 폐암 억제(Kim 등, 2004) 등의 연구가 진행되어 있다. 하지만 느티나무 잎의 항산화 활성 및 DNA 손상억제에 대한 연구가 미흡하여, 본 연구를 통해 차후 느티나무잎의 천연 항산화제로의 활용가능성 및 추출 방식에 따른 효과적인 이용 방법을 제시하고자 한다.
제안 방법
ehtyl acetate 분획물(EA)을 얻기 위해 느티나무 잎을 동결건조한 후에 분쇄하여 분말화하였다. 분말화한 느티나무 잎을 초음파를 이용하여 80 % methanol에 3일 동안 침출시킨 후, filter paper (Whatman NO.
2, Maidstone, UK)로 여과하였다. methanol 추출물을 40oC 이하의 중탕에서 감압 환류 냉각장치(N-1110S, EYELA, Tokyo, JAPAN)로 농축한 후 분별 깔대기를 이용하여 petroleum ether, ethyl acetate 을 이용하여 각각 순차적으로 3회 분획 하였다. 이 중 ethyl acetate 분획물을 감압 환류 냉각장치로 농축하여 시료로 사용하였다.
각 농도별 추출물 40 μL에 1 mM FeCl2 40 μL와 증류수 700 μL를 혼합하여 약 30초간 실온에서 반응하였다.
각 농도별 추출물 40 μL에 ABTS solution 760 μL를 첨가한 후 37oC에서 20분 반응시켜 UV/Visible spectrophotometer를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.
각 농도별 추출물(0.32, 1.6, 8, 40, 200 μg/mL) 40 μL에 DPPH solution 760 μL를 첨가한 후 37oC에서 20분 반응시켜 UV/Visible spectrophotometer (Human Cop, Xma-3000PC, Seoul, Korea) 를 이용하여 515nm에서 흡광도를 측정하였다.
대조구로는 Fe2+ 칼레이트화 반응을 통해 Fe2+ 과다 환자치료에 사용되어 온 deferoxamine으로 비교 분석하였다(Sonakul등, 1988; Zurlo 등, 1989; Oliveri 등, 1994; Oliver와 Brittenham 1997; Barman Balfour과 Foster 1999; Benz 2001).
반응물 20 μL와 φX-174 RF I plasmid DNA 5 μL를 넣고, 37oC에서 3분간 반응한 후, 10X loading buffer와 혼합한 후 1 % agarose gel로 전기영동을 실시한 후 UV하에서 사진 촬영하였다.
반응물 20 μL와 φX-174 RF I plasmid DNA 5 μL를 넣고, 37oC에서 3분간 반응한 후, 10X loading buffer와 혼합한 후 1% agarose gel로 전기영동을 실시한 후 UV하에서 사진 촬영 하였다.
열수 추출물(HW)을 얻기위해 느티나무 잎을 동결건조한 후에 분쇄하여 분말화하였다. 분말화한 느티나무 잎을 증류수에 침출시켜 뜨거울 물에 용출하여 filter paper (Whatman NO. 2, UK) 로 여과하였다. 여과한 추출물을 freeze drier (Ilshin, Donducheon-si, Korea) 를 이용하여 건조시켜 시료로 사용하였다.
산화적 스트레스에 의한 DNA 손상 억제 활성 DNA 손상 억제 활성은 FeCl2 (ferric chloride) 로 인한 산화적 스트레스와 FeSO4 (ferrous sulfate) 와 H2O2의 fenton 반응에 의한 산화적 스트레스로 평가하였으며, φX-174 RF I plasmid DNA cleavage assay로 평가하였다.
이 중 ethyl acetate 분획물을 감압 환류 냉각장치로 농축하여 시료로 사용하였다. 열수 추출물(HW)을 얻기위해 느티나무 잎을 동결건조한 후에 분쇄하여 분말화하였다. 분말화한 느티나무 잎을 증류수에 침출시켜 뜨거울 물에 용출하여 filter paper (Whatman NO.
위 반응액을 2000 g에서 5분간 원심 분리하여 상등액 400 μL에 증류수 400 μL와 0.10 % ferric chloride 16 μL를 첨가하여 혼합한 후, UV/Visible spectrophotometer를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
9 mg/g)으로 에틸아세테이트 분획물의 총 페놀성 화합물의 함량이 높았다. 총 페놀성 화합물의 함량은 농도별로 희석한 tannic acid의 표준곡선을 통해 함량을 계산하였다.
대상 데이터
φX-174 RF I plasmid DNA는 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하여 사용하였다.
모든 시료는 실험 전까지 −27oC 냉동 보관하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해하여 실험에 사용하였다.
본 실험에 사용된 느티나무 잎은 충청북도 괴산군 칠성면에서 채취하여, 중원대학교 생약자원개발학과에서 분류 및 동정한 것 (voucher number: JWU15-1)을 시료로 사용하였다.
본 연구에 사용된 High-performance liquid chromatography grade의 methanol, petroleum ether, ethyl acetate 및 DMSO 는 SK chemicals (Seoul, Korea) 제품을 사용 하였고, 나머지 시약은 Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. φX-174 RF I plasmid DNA는 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하여 사용하였다.
2, UK) 로 여과하였다. 여과한 추출물을 freeze drier (Ilshin, Donducheon-si, Korea) 를 이용하여 건조시켜 시료로 사용하였다. 모든 시료는 실험 전까지 −27oC 냉동 보관하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해하여 실험에 사용하였다.
methanol 추출물을 40oC 이하의 중탕에서 감압 환류 냉각장치(N-1110S, EYELA, Tokyo, JAPAN)로 농축한 후 분별 깔대기를 이용하여 petroleum ether, ethyl acetate 을 이용하여 각각 순차적으로 3회 분획 하였다. 이 중 ethyl acetate 분획물을 감압 환류 냉각장치로 농축하여 시료로 사용하였다. 열수 추출물(HW)을 얻기위해 느티나무 잎을 동결건조한 후에 분쇄하여 분말화하였다.
데이터처리
모든 실험 결과는 3번 이상 수행하였으며, 통계분석은 SPSS 18.0 (Statistical Package for the Social Sciences) 을 이용하여 각 실험의 평균과 표준편차를 계산하였고, ANOVA를 통한 p <0.05 수준에서 Duncan 다중검정법(duncan’s multiple range test)으로 사후 검정하여 각 실험의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
φX-174 RF I plasmid DNA 산화적 스트레스 손상 억제 활성은 Jung과 Surh의 방법(Jung and Surh 2001)을 참고하여 측정하였다.
1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH)를 이용한 전자 공여능은 Bondet 방법(Bondet 등, 1997)을 참고하여 측정하였다. DPPH solution은 300 μM DPPH 를 515 nm에서 흡광도 값이 1.
3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) 라디칼 소거 활성 능력은 Van den Berg 등의 방법(Van den Berg 등, 1999)을 참고하여 측정하였다. ABTS solution은 7.
φX-174 RF I plasmid DNA를 이용한 산화적 DNA 손상억제활성은 에틸아세테이트 분획물과 열수 추출물 모두 상당한 방어효과를 나타냈다.
항산화 활성 중에서 활성산소 또는 전자 공여능으로 인한 안정화 작용은 환원이라고 할 수 있다. 결과적으로 강한 환원력을 가진 물질은 뛰어난 전자 공여능을 뜻하는 것으로 지질과산화 과정과 같은 산화적 기작에서 2차적인 항산화제의 역할을 수행할 수 있다. 환원력 평가는 potassium ferricyanide reduction method를 이용하여 ferric-ferricyanide (Fe3+) 혼합물이 수소를 공여하여 유리라디칼을 안정화시켜 ferrous (Fe2+)로 전환하는 환원력을 700 nm에서의 흡광도 값으로 표현한 것이다.
느티나무 잎의 에틸아세테이트 분획물과 열수 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성을 측정한 결과, 추출물 농도 200 μg/mL에서 99.50, 99.40 %로 EA와 HW의 활성이 모두 높게 나타났으며, IC50값은 5.5, 4.4 μg/mL로 열수 추출물의 활성이 더 높은 것으로 나타났다(Table 2).
느티나무 잎의 에틸아세테이트 분획물과 열수 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과, 농도의존적으로 활성을 나타냈으며, 추출물 농도 200 μg/mL에서87.08, 72.66%로 에틸아세테이트 분획물의 활성이 더 높게 나타났고 IC50 (Inhibitor concentration 50%) 값 또한 19.2 μg/mL, 25.5 μg/mL로, 에틸아세테이트 분획물의 활성이 더 높은 것으로 나타났다(Table 1).
느티나무 잎의 에틸아세테이트 분획물과 열수 추출물의 Fe2+ 킬레이팅 활성을 측정한 결과, 각 추출물의 농도가 높을수록 킬레이팅 활성이 높았으며, 추출물 농도 200 μg/mL에서 deferoxamine 95.40 %과 비교하여 에틸아세테이트 분획물(73.96 %)과 열수 추출물(72.42 %)로 에틸아세테이트 분획물의 활성이 더 우수한 것으로 나타났다(Table 4).
느티나무 잎의 에틸아세테이트 분획물과 열수 추출물의 Fe2+에 의한 DNA 손상 억제 활성은 대조구와 비교하였을 때 추출물 농도별(200, 40, 8, 1.6, 0.32 μg/mL) 에틸아세테이트 분획물과 열수 추출물 모두 DNA 손상 억제 활성이 있는 것으로 나타났다(Fig. 2).
느티나무 잎의 에틸아세테이트 분획물과 열수 추출물의 Reducing power는 에틸아세테이트 분획물보다 열수 추출물의 활성이 높았으며, 특히 열수 추출물은 L-ascorbic acid와 비교하였을 때 유사한 환원력을 가진 것으로 보아 강한 항산화제로 평가된다(Table 3). Fe2+ 킬레이팅 활성은 철 이온에 대한 시료의 킬레이팅 반응을 통해 산화반응을 일으키는 금속이온과 결합하여 금속이온의 그 반응성이나 결합성을 제어하는 역할을 한다.
느티나무 잎의 에틸아세테이트 분획물과 열수 추출물의 총 페놀성 화합물 함량을 분석한 결과(Fig. 1), 에틸아세테이트 분획물(56.63±0.9 mg/g), 열수 추출물(51.62±0.9 mg/g)으로 에틸아세테이트 분획물의 총 페놀성 화합물의 함량이 높았다.
다. 따라서 느티나무 잎의 에틸아세테이트 분획물 및 열수 추출물은 뛰어난 항산화 활성 및 산화적 DNA 손상 억제 효과를 통한 천연 자원으로서의 잠재성을 보였다.
에틸아세테이트 분획물은 열수 추출물에 비해 DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활성, Fe2+ 킬레이팅 활성 그리고 reducing power에서 높은 항산화 활성을 보였다. 또한, 페놀류화합물 함량은 각각 에틸아세테이트 분획물은 56.63 mg/g 그리고 열수 추출물은 51.61 mg/g으로 분석됐다. φX-174 RF I plasmid DNA를 이용한 산화적 DNA 손상억제활성은 에틸아세테이트 분획물과 열수 추출물 모두 상당한 방어효과를 나타냈
에틸아세테이트 분획물은 열수 추출물에 비해 DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활성, Fe2+ 킬레이팅 활성 그리고 reducing power에서 높은 항산화 활성을 보였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
느티나무의 국내 서식지는?
이와 같이, 펜톤 반응의 억제를 이끌어내는 항산화 활성은 철 이온의 환원반응을 발생시키거나, OH−를 직접적으로 소거하므로 OH−에 의한 DNA 손상으로부터 supercoiled plasmid DNA의 구조를 보호한다 (Prakash 등, 2007). 느티나무(Zelkova serrata)는 평안남도 및 함경남도 이남에서 자라며 높이 26 m, 지름 3 m인 낙엽성 교목이다. 또한 생장이 빠르지만 저수지나 염분이 있는 곳에서는 생장이 어렵다(Lee 2003).
식물의 항산화 물질은 어떤 화합물인가?
이에 반해 인체에 대한 유해성이 낮은 천연 항산화제의 사용이 증대되고 있고(Warnholtz과 Münzel, 2000; Hwang 등, 2011), 천연 항산화제로 사용될 수 있는 식물의 항산화 물질에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다. 식물의 항산화 물질은 phenolics 및 flavonoid 계통의 화합물로 알려져 있고(Choe와 Yang 1982), 이 물질들은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 대해 연쇄반응을 통해 alkyl radical 또는 alkylperoxy radical에 수소를 공여하는 반응을 한다(Lee 등, 2006). 이러한 활성산소종은 체내의 당, 지질, 단백질과 DNA에 이르는 비가역적인 변형과 파괴를 유래한다고 알려져 있으며 (Harold 등, 2007), 항산화제의 산화 반응의 억제를 통해 체내 radical의 반응에 대해 인체를 보호하고, 활성산소종에 의한 암,
느티나무가 자라지 못하는 환경은?
느티나무(Zelkova serrata)는 평안남도 및 함경남도 이남에서 자라며 높이 26 m, 지름 3 m인 낙엽성 교목이다. 또한 생장이 빠르지만 저수지나 염분이 있는 곳에서는 생장이 어렵다(Lee 2003). 느티나무는 3-hydroxylated flavonoid C-glucosides (Hayashi 등, 1987), 7-hydroxy-3-methoxycadalrene(Kim 등, 2004)이 분석되었고, 최근까지 항진균 활성 및 항산화(Lee 등, 2000), 폐암 억제(Kim 등, 2004) 등의 연구가 진행되어 있다.
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