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문제 정의
- 본 연구는 methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)로부터, 독소 유전자형과 항생제 내성의 상관 관계를 결정하는 것을 목표로 하였다. 2014년 1월∼12월까지 전남 순천의 한 병원 중환자실의 임상검체 2,664건에서 얻어진 MRSA 52균주를 분리하였다.
- 이러한 균주들이 중환자실에서 감염 전파로 원내 폐렴의 발병률이 높게 나타남으로서 높은 사망율과 심각한 합병증을 나타낼 수 있어 중환자실 내에서의 MRSA에 대한 효과적인 병원 감염관리는 매우 중요하다 할 수 있다[13]. 본 연구의 목적은 S. aureus의 다양한 독소유전자중 toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1), Panton-Valentine leukocidin (PVL), exfoliative toxin A와 B (eta, etb), 및 Enterotoxin (se)인 sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej를 포함하여 모두 13종류의 독소 유전자에 대한 specific primer를 이용해 Multiplex PCR을 실시하여 독소유전자의 다양성과 항생제 감수성검사 결과와의 연관성을 조사 하고자 하였다.
제안 방법
- Muller-Hinton agar (MHA)에서 oxacillin 항생제 디스크 주위에 형성된 억제대의 직경이 10 mm 이하인 균주를 선별하는 디스크 확산법으로 CLSI M100-S19 지침[14]에 따라 MRSA를 1차 판정하였으며 자동화 기기인 Vitek automated system (bioMérieux, Hazelwood, MO, USA)의 AST-P601 카드를 이용한 최소억제 농도(MIC)가 4 ug/mL 이상임을 확인 하였으며 이때 동일 환자로부터 반복 분리된 MRSA 균주는 제외하였다.
- PCR 반응액은 dNTP (각 2.5 mM), MgCl2 2 mM, primer 각 20 pmol, Taq DNA polymerase (Bioneer, Daejeon, Korea) 0.5 U, genomic DNA 100 ng 및 반응 완충용액(10 mM Tris-HCl, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2)에 총 부피가 50 μL가 되도록 증류수를 첨가하였다.
- PCR 반응은 PCR thermal cycler TP 600 (Takara Bio, Foster City, CA, USA)을 이용하였으며 PCR 반응 조건은 95°C에서 5분간 초기 denaturation 시키고, 95°C에서 30초, 59°C에서 30초, 72°C에서 40초의 cycle을 30회 반복한 후 마지막으로 72°C에서 10분 동안 반응 시켰다.
- PCR 반응은 PCR thermal cycler TP 600 (Takara Bio, Foster City, CA, USA)을 이용하였으며 PCR 반응 조건은 95°C에서 5분간 초기 denaturation 시키고, 95°C에서 30초, 59°C에서 30초, 72°C에서 40초의 cycle을 30회 반복한 후 마지막으로 72°C에서 10분 동안 반응 시켰다. PCR 산물은 2% agarose gel에 전기영동한 후 특이 밴드를 확인하였다.
- mecA와 독소 유전자를 증폭하기 위해 사용한 primer는 Table 1과 같다. Primer는 3 Set (A, B, C)로 구분하여 모두 동일한 조건으로 multiplex PCR을 실시하였다. PCR 반응액은 dNTP (각 2.
- 독소유전자의 특이적인 primer를 사용하여 3 Set (A, B, C)로 구분하여 multiplex PCR을 실시하였다(Fig. 1). 장독소 중 seg와 sei 유전자는 각각 40 균주(76.
- 2014년 1월∼12월까지 전남 순천의 한 병원 중환자실의 임상검체 2,664건에서 얻어진 MRSA 52균주를 분리하였다. 유전자들이 암호화하고 있는 mecA, 장독소(staphylococcal enterotoxins; sea, seb, sec, seg, seh, sei, sej), 독성 쇼크 증상독소-1 (toxic shock syndrome toxin-1; tst-1), 표피박탈성독소(exfoliative toxin; eta, etb), 백혈구 용해 독소(Panton-Valentine leukocidin; pvl)를 특이적 프라이머를 이용한 multiplex PCR로 증폭 검출 하였다. 독소 유전자 seg와 sei 유전자가 각각 40균주(76.
- 혈액배지에 배양한 균을 생리식염수로 McFarland 0.5관에 맞춘 세균현탁액을 멸균된 면봉에 충분히 적신 후 MHA 배지에 접종한 후 항생제 디스크를 올려놓고 37°C incubator 에서 16∼24시간 배양한 후 디스크 주위에 형성된 억제대의 직경을 mm단위로 측정하여 판정 기준표와 비교하여 감수성, 중간내성, 저항성으로 판정하였다[14].
대상 데이터
- 2014년 1월∼12월까지 전남 순천의 한 병원 중환자실의 임상검체 2,664건에서 얻어진 MRSA 52균주를 분리하였다.
- 2014년 1월부터 12월까지 전라남도 순천의 일개 종합병원 중환자실에서 의뢰된 2,664건의 환자 가검물로부터 MRSA 균주를 분리하였다. Muller-Hinton agar (MHA)에서 oxacillin 항생제 디스크 주위에 형성된 억제대의 직경이 10 mm 이하인 균주를 선별하는 디스크 확산법으로 CLSI M100-S19 지침[14]에 따라 MRSA를 1차 판정하였으며 자동화 기기인 Vitek automated system (bioMérieux, Hazelwood, MO, USA)의 AST-P601 카드를 이용한 최소억제 농도(MIC)가 4 ug/mL 이상임을 확인 하였으며 이때 동일 환자로부터 반복 분리된 MRSA 균주는 제외하였다.
- 5관에 맞춘 세균현탁액을 멸균된 면봉에 충분히 적신 후 MHA 배지에 접종한 후 항생제 디스크를 올려놓고 37°C incubator 에서 16∼24시간 배양한 후 디스크 주위에 형성된 억제대의 직경을 mm단위로 측정하여 판정 기준표와 비교하여 감수성, 중간내성, 저항성으로 판정하였다[14]. 매 시험마다 대조 균주로 S. aureus ATCC 25923를 사용하였다. 최소 억제 농도(MIC)는 자동화 기기인 Vitek automated system (bioMérieux, USA)의 AST-P601 카드를 이용 하였다.
- 최소 억제 농도(MIC)는 자동화 기기인 Vitek automated system (bioMérieux, USA)의 AST-P601 카드를 이용 하였다.
이론/모형
- 분리균의 항생제 감수성 시험은 CLSI M100-S19 지침[14]의 방법에 따라 디스크 확산법(disc diffusion method)으로 각각의 항생제가 함유된 디스크 6 mm를 사용하여 실시하였다. 혈액배지에 배양한 균을 생리식염수로 McFarland 0.
성능/효과
- 2,664건의 환자 검체에서 균이 분리된 검체는 객담에서 20균주, 농 11균주, 소변 8균주, 혈액 4균주, 중심정맥관 팁 4 균주, 체액 3 균주, 창상 2균주로 총 52균주 이었다(Table 2).
- 4%) 순으로 검출 되었으며 eta, etb, sea, sed, see, seh, sej와 pvl 유전자들은 검출 되지 않았다. 2개 이상의 독소유전자를 동시에 보유한 조합의 MRSA는 40균주(76.9%) 였는데 5개 유전자(seb, sec, seg, sei, tst)를 동시 보유한 조합이 28균주(53.8%)로 가장 많은 분포를 보였으며 다음으로 seg, sei 유전자 동시 보유 조합으로 6균주(11.5%)에서 나타났다. 유전자들 간의 동시 보유율은 72.
- 독소 유전자들 간의 동시 유전자 보유율은 tst 유전자가 seg, sei 유전자들을 100% 동시 보유하였고 seb가 tst, seg, sei와 sec가 tst, seg, sei와 seg가 sei와 sei가 seg 유전자를 100% 동시 보유하였다. seb, sec, seg, sei와 tst 유전자들 사이의 동시보유율은 seg 또는 sei 보유균주가 seb 또는 sec를 동시에 보유한 비율인 72.5%에서 sei 보유균주가 seg를 동시에 보유한 비율인 100%에 달했다(Table 5).
- 그러나 gentamicin은 다른 항생제와 비교해 볼때 내성율은 훨신 낮았으며 또한 독소유전자를 보유한 균주들은 보유하지 않은 균주들보다 내성율은 높았지만 전체 평균 내성율과는 큰 차이가 없는 결과를 보였다. 결론적으로 독소유전자를 하나 또는 5개 독소유전자(seb, sec, seg, sei, tst)를 동시에 보유한 균주들과의 항생제 내성율의 차이는 독소유전자 보유 갯수와는 상관 없이 모두 내성율이 높았음을 확인하였다. 그렇지만 독소유전자를 보유하지 않은 균주들보다는 내성율이 높게 나타났다.
- 특정 독소유전자 보유에 대한 항생제 내성과의 연관성을 분석한 결과 5개 독소유전자(seb, sec, seg, sei, tst)를 동시에 보유한 균주들과 개별적으로 독소유전자 seb, sec, seg, sei와 tst를 각각 1개씩만을 보유한 균주들은 ciprofloxacin, clindamycin, erythromycin, tetracycline에 대한 내성율의 차이는 크지는 않았지만 독소유전자를 하나도 갖지 않은 균주들 보다는 내성율이 높게 나타났다. 그러나 gentamicin은 다른 항생제와 비교해 볼때 내성율은 훨신 낮았으며 또한 독소유전자를 보유한 균주들은 보유하지 않은 균주들보다 내성율은 높았지만 전체 평균 내성율과는 큰 차이가 없는 결과를 보였다. 결론적으로 독소유전자를 하나 또는 5개 독소유전자(seb, sec, seg, sei, tst)를 동시에 보유한 균주들과의 항생제 내성율의 차이는 독소유전자 보유 갯수와는 상관 없이 모두 내성율이 높았음을 확인하였다.
- 그렇지만 독소유전자를 보유하지 않은 균주들보다는 내성율이 높게 나타났다. 그리고 5개의 독소유전자(seb, sec, seg, sei, tst)를 보유한 균주와 개별적 독소유전자 seb, sec, tst 유전자를 각각 보유한 균주의 조합에서 ciprofloxacin, clindamycin, erythromycin 항생제에 100% 내성을 보임으로서 공통적으로 포함된 seb, sec, tst 유전자와 이 항생제의 내성과는 연관이 있음을 확인 할 수 있었다. 이렇듯 독소유전자를 보유한 MRSA 균주들이 중환자실 환자들에게 감염이 된다면 효과적인 항생제 치료가 제한적이므로 내성균의 확산 방지를 위한 철저한 감염관리가 더욱 필요하다고 생각한다.
- 5%로 내성을 보였다. 그리고, 5개의 독소유전자(seb, sec, seg, sei, tst)를 동시에 보유한 균주들도 ciprofloxacin, clindamycin, erythromycin에 100% 내성율을 보였고 tetracycline, gentamicin은 각각 82.1%, 25.0%의 내성율을 보였다(Table 7).
- 8%)가 보유하고 있었으며 sea와 sed, see, sej, seh, see 유전자들은 검출되지 않았으며 피부 박탈성 독소 유전자 eta와 etb, leukocidin 독소 유전자인 pvl 또한 검출되지 않았다. 독성 쇼크 증상독소-1 유전자 tst를 보유한 균주는 34균주(65.4%)로 확인되었으며 검체별 객담에서 가장 많이 분리된 독소유전자는 tst, seg, sei를 각각 19균주(95.0%)에서 보유하고 있었으며 농에서는 seg, sei를 각각 11균주(100%) 모두에서 보유하고 있었다(Table 3). 2개 혹은 그 이상의 독소 유전자를 동시에 보유한 균주들의 분포는 Table 4에 나타내었다.
- 유전자들이 암호화하고 있는 mecA, 장독소(staphylococcal enterotoxins; sea, seb, sec, seg, seh, sei, sej), 독성 쇼크 증상독소-1 (toxic shock syndrome toxin-1; tst-1), 표피박탈성독소(exfoliative toxin; eta, etb), 백혈구 용해 독소(Panton-Valentine leukocidin; pvl)를 특이적 프라이머를 이용한 multiplex PCR로 증폭 검출 하였다. 독소 유전자 seg와 sei 유전자가 각각 40균주(76.9%)로 가장 많은 보유율을 나타냈으며 다음으로 tst 34균주(65.4%) 순으로 검출 되었으며 eta, etb, sea, sed, see, seh, sej와 pvl 유전자들은 검출 되지 않았다. 2개 이상의 독소유전자를 동시에 보유한 조합의 MRSA는 40균주(76.
- 8%)가 5개의 독소유전자(seb, sec, seg, sei, tst)를 동시에 보유하고 있었다. 독소 유전자들 간의 동시 유전자 보유율은 tst 유전자가 seg, sei 유전자들을 100% 동시 보유하였고 seb가 tst, seg, sei와 sec가 tst, seg, sei와 seg가 sei와 sei가 seg 유전자를 100% 동시 보유하였다. seb, sec, seg, sei와 tst 유전자들 사이의 동시보유율은 seg 또는 sei 보유균주가 seb 또는 sec를 동시에 보유한 비율인 72.
- 독소 유전자들 간의 동시 유전자 보유율은 tst 유전자가 seg, sei 유전자들을 100% 동시 보유하였으며 뿐만 아니라 seb가 tst, seg, sei를 sec가 tst, seg, sei를 seg가 sei를 sei가 seg 유전자들을 100% 동시 보유하고 있었다. 본 연구 결과는 특정한 독소 유전자 seb, sec, seg, sei와 tst 유전자간의 상관성이 높음을 말해준다.
- 독소유전자형에 따른 MRSA의 항생제 내성 양상은 seb, sec와 tst 유전자 보유 균주들은 ciprofloxacin, clindamycin과 erythromycin에 대한 항생제 내성율이 100%를 보였고, seg, sei를 보유한 균주들 또한 ciprofloxacin, clindamycin, erythromycin, tetracycline 항생제에 각각 85.0%, 92.5%, 92.5%, 72.5%로 내성을 보였다. 그리고, 5개의 독소유전자(seb, sec, seg, sei, tst)를 동시에 보유한 균주들도 ciprofloxacin, clindamycin, erythromycin에 100% 내성율을 보였고 tetracycline, gentamicin은 각각 82.
- 3%로 나타났다. 또한 telithromycin, ciprofloxacin, tetracycline은 각각 84.6%, 82.7%, 71.2% 내성율을 나타냈다. Daptomycin, linezolid, quinupristin-dalfopristin, teicoplanin, tigecycline, vancomycin에 대한 내성은 없었다(Table 6).
- 3%로 같은 내성율을 보였다. 또한 telithromycin, ciprofloxacin, tetracycline은 각각 84.6%, 82.7%, 71.2%의 내성을 보였다. 이와 같은 항생제 내성의 결과는 다른 연구 결과[5]와도 거의 일치함을 확인 할 수 있었다.
- 독소 유전자들 간의 동시 유전자 보유율은 tst 유전자가 seg, sei 유전자들을 100% 동시 보유하였으며 뿐만 아니라 seb가 tst, seg, sei를 sec가 tst, seg, sei를 seg가 sei를 sei가 seg 유전자들을 100% 동시 보유하고 있었다. 본 연구 결과는 특정한 독소 유전자 seb, sec, seg, sei와 tst 유전자간의 상관성이 높음을 말해준다. 다른 연구자들의 보고 자료에 의한 S.
- 분리된 MRSA 52균주의 항생제 내성 양상은 amoxicil-lin-clavulanic acid, benzylpenicillin, ampicillin, imipenem은 100% 내성을 보였고 erythromycin, clindamycin 항생제에 대한 내성율은 똑같이 92.3%로 나타났다. 또한 telithromycin, ciprofloxacin, tetracycline은 각각 84.
- 분리된 MRSA 균주들 중 식중독을 유발한다고 알려진 5개의 독소 유전자(sea, seb, sec, sed, see) 외의 seg와 sei 유전자가 각각 40 균주(76.9%)로 가장 많은 보유율을 나타냈으며 다음으로 독성 쇼크증상 독소 1 유전자 tst는 34균주(65.4%), 장독소 seb, sec는 각각 29균주(55.8%) 순으로 검출 되었으며 검체별 객담과 농으로부터 분리된 MRSA 균주가 혈액과 소변으로부터 분리된 MRSA에 비해 독소유전자 보유 빈도가 높음을 알 수 있었고 특이하게 소변에서 분리된 균주들은 독소유전자를 한 균주도 갖고 있지 않음을 확인하였다. 한편 피부 박탈성 독소(exfoliative toxin) 유전자 eta와 etb 그리고 장독소 sea, sed, see, seh, sej와 주로 피부감염이나 병원감염보다는 지역감염 환자로부터 분리되는 leukocidin 독소 pvl 유전자는 검출 되지 않았다.
- 분리된 균주들중 독소유전자를 2개 이상 동시에 보유한 조합의 MRSA는 40균주(76.9%)였으며 분포도를 살펴보면 seb, sec, seg, sei, tst의 5개 유전자를 동시 보유한 조합은 28균주(53.8%)를 보였으며 다음으로 seg, sei 유전자 동시 보유와 seg, sei, tst 유전자 동시 보유 조합은 각각 6균주(11.5%), 5균주(9.6%)를 보였다(Table 4). 이것은 여러 다른 보고에 의한 것과 마찬가지로 대부분의 MRSA 균주가 2∼4개의 독소유전자를 동시에 보유한다[23]는 결과와 일치 하였으며, 오히려 본 연구에서는 다른 보고에 의한 것 보다 더 많은 5개(seb, sec, seg, sei, tst)까지의 독소유전자를 동시 보유하고 있음을 확인 할 수 있었다.
- 유전자들 간의 동시 보유율은 72.5∼100%로서 특정한 독소 유전자 seb, sec, seg, sei와 tst 유전자간의 상관성이 높게 나타났다.
- 1). 장독소 중 seg와 sei 유전자는 각각 40 균주(76.9%)에서 확인되었고 seb와 sec는 각각 29균주(55.8%)가 보유하고 있었으며 sea와 sed, see, sej, seh, see 유전자들은 검출되지 않았으며 피부 박탈성 독소 유전자 eta와 etb, leukocidin 독소 유전자인 pvl 또한 검출되지 않았다. 독성 쇼크 증상독소-1 유전자 tst를 보유한 균주는 34균주(65.
- 5∼100%로서 특정한 독소 유전자 seb, sec, seg, sei와 tst 유전자간의 상관성이 높게 나타났다. 특정 다수의 독소유전자(seb, sec, seg, sei, tst)를 동시에 보유한 균주들이 개별적 독소유전자를 보유한 균주(seb, sec, tst)와의 항생제 내성의 상관성은 ciprofloxacin, clindamycin, erythromycin 항생제에 100% 내성을 보임으로서 공통적으로 포함된 seb, sec, tst 유전자와 이 항생제의 내성과는 밀접한 연관이 있음을 알았다.
- 특정 독소유전자 보유에 대한 항생제 내성과의 연관성을 분석한 결과 5개 독소유전자(seb, sec, seg, sei, tst)를 동시에 보유한 균주들과 개별적으로 독소유전자 seb, sec, seg, sei와 tst를 각각 1개씩만을 보유한 균주들은 ciprofloxacin, clindamycin, erythromycin, tetracycline에 대한 내성율의 차이는 크지는 않았지만 독소유전자를 하나도 갖지 않은 균주들 보다는 내성율이 높게 나타났다. 그러나 gentamicin은 다른 항생제와 비교해 볼때 내성율은 훨신 낮았으며 또한 독소유전자를 보유한 균주들은 보유하지 않은 균주들보다 내성율은 높았지만 전체 평균 내성율과는 큰 차이가 없는 결과를 보였다.
- 한편, 분리된 MRSA 52균주의 항생제 내성율은 amoxicillin-clavulanic acid, benzylpenicillin, ampicillin, imipenem은 100% 내성을 보였고 erythromycin, clindamycin 내성율은 각각 92.3%로 같은 내성율을 보였다. 또한 telithromycin, ciprofloxacin, tetracycline은 각각 84.
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