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문제 정의
- 따라서, 초기 당뇨병성 신증으로의 이행 전인 염증 단계에서 염증인자 및 ROS의 감소는 당뇨병성 신증의 예방에 필수적이라 할 수 있다. 본 연구에서도 이를 확인하기 위해 ICAM-1, MCP-1 그리고 NF-κB p65의 발현 변화에 대한 위령탕의 영향을 연구하였다. 그 결과, 고포도당에 의해 염증 관여 인자들의 단백질 발현 뿐만 아니라 NF-κB p65의 핵에서의 발현 역시 현저한 증가를 보였으며 이를 위령탕이 억제시킴이 나타났다.
- 만성 신질환의 진행에서 TGF-β은 collagen IV와 같은 ECM의 형성을 촉진시켜 이들 물질의 과다축적으로 인한 사구체 비후와 사구체 경화 및 전체적인 신섬유화를 촉진하는 것으로 알려져 있다 27-29). 이에 본 연구에서 고포도당에 의해 유발되는 초기 당뇨병성 신장 손상에 대한 위령탕의 영향에 대해 실험하였다. 그 결과, 신장 메산지움 세포에서 고농도의 포도당은 TGF-ß의 단백질 발현 뿐만 아니라 mRNA 수준에서의 발현 역시 증가함이 나타났으며 이는 위령탕에 의해서 억제됨을 보였다.
- 그러나 위령탕의 신장 손상에 대한 개선 효과에 대해 과학적인 증명이 이루어지지 않았다. 이에 본 연구에서는 고포도당에 의해 유도된 사람 유래 신장의 사구체 메산지움 세포에서 위령탕이 사구체 세포의 증식 및 섬유화를 효율적으로 억제하는지에 대한 효과 검증 및 그 기전에 대해 알아보았다.
- 이러한 위령탕은 高指血症, 신장염 등의 개선 효과가 있는 것으로 보고되어 있으나20), 위령탕의 당뇨병성 신증에 대한 효과 및 그 조절기전에 대해서는 아직까지 없었다. 이에 본 연구에서는 위령탕이 고포도당에 의한 메산지움 세포의 TGF-β/Smad 및 NF-κB/ROS 억제 효과와 이에 의한 당뇨병성 신증 개선에 대한 영향을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- Effect of wiryeong-tang on TGF-β1, collagen IV, and Smads mRNA levels. Cells were treated with HG (25 mM) for 24 h in the absence or pre-treatment of wiryeong-tang (10, 20, and 50 ㎍/ml) for 30 min and prepared to perform RT-PCR analysis. GAPDH was used as the internal standard in each sample.
- RNA 분리는 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA)를 이용하여 총 RNA를 추출하였으며, 그 total RNA로부터 mRNA를 역전사시켜 cDNA를 합성하고, 표적유전자인 collagen IV, TGF-β1, 그리고 Smads mRNA 에 대한 PCRe HiPi Plus 5X PCR master mix (ELPIS, Taejeon, Korea)을 이용하여 수행하였다. 중합효소 연쇄 반응 조건은 95℃에서 3 분간 변성시킨 후 94℃에서 30 초간 변성반응, 55℃에서 30 초 결합반응, 72℃ 에서 45 초간 35 cycles 반응시켰다.
- 5% FBS DMEM 배지로 배양해 주었다. 각 조건별로 24시간 동안 배양한 후 1X PBS로 두 번 세척해 준 후 새로운 1X PBS 와 함께 final 농도가 10 μM이 되도록 CM-H2DCFDA를 첨가하여 30 분간 반응시켰다. 반응 종료 후, fluorescence spectrofluorometer (F-2500, Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 485 nm와 535 nm에서 spectrofluorimetry 분석으로 축적된 ROS에 결합된 형광 DCF를 측정하여 대조군에 대한 상대적인 수치로 나타내었다.
- Blocking된 membrane을 1:1,000으로 희석한 각 타겟 단백질의 1차 antibody로 2 시간 이상 처리하였다. 그 후 TBS-Tween 20으로 3회 세척한 다음 1:2, 000으로 희석시킨 2차 antibody를 상온에서 1시간 반응시키고 TBS-tween 20으로 3회 세척한 후 ECL solution을 반응시켜 발현 정도를 Chemidoc image analyzer (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 측정 후 정량하였다.
- 5A). 또한, 염증 반응 조절에 관여하는 전사인자로 알려진 NF-κB의 발현에 대한 위령탕의 영향을 알아보기 위하여 핵과 세포질 단백질을 각각 추출하여 그 발현 변화를 측정하였다. 그 결과, 고포도당을 단독 처리했을 때 핵 부분의 NF-κB p65의 발현이 유의성 있게 증가하였고, 위령탕 추출물을 전 처리 하였을 때는 핵 내 NF-κB p65가 농도 의존적으로 억제되었다 (Fig.
- 먼저, 고포도당에 의한 메산지움 세포의 증식 및 세포주기 조절 단백질의 발현 변화를 조사하여 당뇨병성 신증의 발생과 진행에 대하여 위령탕이 가지는 세포병리학적 역할과 의의를 규명하였다. [3H]-thymidine assay를 통해 메산지움 증식에 대한 위령탕의 영향을 확인한 결과에서 고포도당에 의해 증가된 [3H]-thymidine 의 결합 정도가 위령탕 전처리에 의해 유의적으로 감소함을 보였다.
- 메산지움 세포를 24 well 세포 배양용기에 각 well당 5×104개의 세포가 되도록 분주하여 3회 실험하였다. 이 세포들을 10% 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배양액으로 72 시간 배양한 후, 혈청배제 DMEM으로 24시간 동안 배양하여 세포주기를 동일화하였다.
- 각 조건별로 24시간 동안 배양한 후 1X PBS로 두 번 세척해 준 후 새로운 1X PBS 와 함께 final 농도가 10 μM이 되도록 CM-H2DCFDA를 첨가하여 30 분간 반응시켰다. 반응 종료 후, fluorescence spectrofluorometer (F-2500, Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 485 nm와 535 nm에서 spectrofluorimetry 분석으로 축적된 ROS에 결합된 형광 DCF를 측정하여 대조군에 대한 상대적인 수치로 나타내었다.
- 세포의 사멸 및 증식에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 ROS의 생성에 대한 위령탕의 영향을 알아보기 위해 CM-H2DCFDA 염색을 통해 세포 내의 ROS 발현을 측정하였다. 그 결과, 고포도당에 의해 증가된 ROS의 생성 정도는 위령탕에 의해 농도-의존적인 감소를 보여주었다.
- 실험이 종료되기 24시간 전에 [3H]-thymidine을 각 well에 1 μCi/well의 농도로 첨가하였다. 실험이 종료되면 배지를 제거하고 냉장보관한 인산완충액으로 2회 세척한 후, 10 % trichloro acetic acid (TCA)로 15 분간 실온에서 방치한 후 0.1 N NaOH로 1시간 방치하여 세포를 용해한후 2 ml scintillation cocktail에 넣고 beta-counter (TL 5000s, BeckmanInstruments Inc., Fullerton, CA)을 이용하여 총 방사능을 측정하였다.
- HBH262-01)을 분말로 만들어 플라스크에 넣은 후, 증류수 500 ml를 가하고 9 5℃에서 6시간 가열하여 환류 추출하였다. 여과지를 이용하여 여과한 다음, 여과액을 Evaporator (EYELA, Japan)을 이용하여 감압 농축하고 농축액을 동결 건조하여 실험 시까지 냉동보관 하였다. 실험 시에는 위령탕 추출물을 pure distilled water를 이용하여 배지에 녹인 후, pore size 0.
- 위령탕 추출물이 사람 신장 메산지움 세포에서 고포도당으로 유발된 신장 사구체 세포의 증식 및 신장 손상 개선 효과를 조사하였으며, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 위령탕의 메산지움 세포 증식에 대한 영향을 관찰하기 위해 [3H]-thymidine 의 결합 정도를 관찰하였다. 그 결과, 고포도당은 사람 유래 신장 메산지움 세포의 증식을 대조군에 비해 유의하게 증가시켰으나, 위령탕 투여는 농도에 비례하여 [3H]-thymidine 의 결합 정도가 감소됨을 알 수 있었다.
- 세포가 되도록 분주하여 3회 실험하였다. 이 세포들을 10% 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배양액으로 72 시간 배양한 후, 혈청배제 DMEM으로 24시간 동안 배양하여 세포주기를 동일화하였다. 24 well 세포 배양용기에 각 well당 5×104개의 세포가 되도록 분주하여 3회 실험하였다.
대상 데이터
- , Carlsbad, CA)로부터 구입하여 사용하였다. 메산지움 세포의 배양은 10% 우태아혈청과 100 ㎍/ml의 penicillin을 첨가한 저농도 포도당(100 mg/ml)함유 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM; Gibco, Grand Island, NY)에서 37℃, 5% CO2 세포배양기를 이용하여 배양하였다. 배양액은 2일 마다 바꿔주었다.
- 배양액은 2일 마다 바꿔주었다. 본 연구에는 3대째 계대배양 중인 메산지움 세포를 사용하였다.
- 사람 유래 신장 메산지움 세포(HRMC)는 ScienceCellTM (ScienceCell Research Laboratories Inc., Carlsbad, CA)로부터 구입하여 사용하였다. 메산지움 세포의 배양은 10% 우태아혈청과 100 ㎍/ml의 penicillin을 첨가한 저농도 포도당(100 mg/ml)함유 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM; Gibco, Grand Island, NY)에서 37℃, 5% CO2 세포배양기를 이용하여 배양하였다.
- 세포 내 ROS의 생성 정도를 측정하기 위하여 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (CM-H2DCFDA, Invitrogen) 형광염료를 이용하였다. 근접 빛이 차단된 96-well dish에 1×104 cells을 각각 seeding 한 후, 세포가 약 70% 가량 자랐을 때 0.
- 75 g 으로 구성되어 있다. 여과된 추출물은 농축 후 냉동 건조기를 이용하여 동결 건조시켜 수율 약 17% (6.3 g)의 양을 획득하여 실험에 사용하였다 (Table1).
- 위령탕 (Herbarium voucher No. HBH262-01)을 분말로 만들어 플라스크에 넣은 후, 증류수 500 ml를 가하고 9 5℃에서 6시간 가열하여 환류 추출하였다. 여과지를 이용하여 여과한 다음, 여과액을 Evaporator (EYELA, Japan)을 이용하여 감압 농축하고 농축액을 동결 건조하여 실험 시까지 냉동보관 하였다.
데이터처리
- 실험군 간의 유의성은 Systat사의 SigmaPlot 10.0을 이용하여 실험결과를 Student’s t-test를 통하여 p값이 0.05이하인 경우 유의한 차이로 판정하였고, 실험 치의 표현은 mean ± S.E.로 하였다.
이론/모형
- 단백질 정량은 Bradford (Bio-Rad)법을 이용하여 단백질의 동량을 10% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 전기 영동하여 분리한 후 nitrocellulose membrane으로 transfer하였다. 비 특이적 antibody 결합을 방지하기 위해 membrane을 5% skim milk가 함유된 Tris-buffered saline (TBS) 용액에 상온에서 1시간 동안 blocking하였다.
- 또한, 신장 메산지움 세포에 대한 위령탕의 항-증식작용이 세포주기 조절 인자들의 조절에 의한 것인가를 확인하기 위해 Western blot 법을 이용하였다. 세포의 성장을 유도하는 단백질인 CDK2, CDK4, cyclinD1, 그리고 cyclinE의 단백질 발현 변화는 대조군에 비해 고포도당을 처리한 군에서의 눈에 띄는 증가를 보였으나, 위령탕을 전 처리한 군에서는 세포주기 조절 단백질들의 발현이 유의하게 감소하는 것을 보였다.
성능/효과
- 1. 위령탕 추출물은 고포도당에 의해서 유발된 신장 메산지움 세포의 증식을 CDK/cyclin의 세포주기 조절 인자들의 조절을 통해 유의하게 억제시켰다.
- 2. 위령탕 추출물은 고포도당에 의한 신장 손상에 대해 섬유화 유도 인자인 collagen IV 억제 및 TGF-β/Smad 경로 조절을 통해서 이를 유의하게 개선시켰다.
- 3. 위령탕 추출물은 신장 메산지움 세포에서 고포도당에 의해 유도된 초기 염증 인자들 (ICAM-1 및 MCP-1)의 발현을 억제하였다.
- 4. 위령탕 추출물은 신장 메산지움 세포에서 고포도당에 의해 유도된 NF-κB의 핵에서의 발현 증가를 억제하였다.
- 5. 위령탕 추출물은 신장 메산지움 세포에서 고포도당에 의해 유도된 ROS 생성 증가를 억제하였다.
- 특히 50 ㎍/ml의 농도에서는 대조군 수준 정도의 발현 억제 효과를 보였다. MCP-1의 경우도 고포도당를 처리했을 때, 발현이 크게 증가한 반면, 위령탕에 의해서는 50 ㎍/ml의 농도에서 아주 높은 발현 억제 효과를 보였다 (Fig. 5A). 또한, 염증 반응 조절에 관여하는 전사인자로 알려진 NF-κB의 발현에 대한 위령탕의 영향을 알아보기 위하여 핵과 세포질 단백질을 각각 추출하여 그 발현 변화를 측정하였다.
- Western blot 법을 통하여 메산 지움 세포 내 ICAM-1과 MCP-1의 발현양상을 조사해 본 결과, 고포도당을 처리하였을 때 ICAM-1의 발현이 크게 증가하였고, 증가된 ICAM-1은 WRT의 처리 농도 의존적으로 감소되었다. 특히 50 ㎍/ml의 농도에서는 대조군 수준 정도의 발현 억제 효과를 보였다.
- 3H]-thymidine assay를 통해 메산지움 증식에 대한 위령탕의 영향을 확인한 결과에서 고포도당에 의해 증가된 [3H]-thymidine 의 결합 정도가 위령탕 전처리에 의해 유의적으로 감소함을 보였다. 위령탕은 또한 세포 주기 조절 인자인 CDK2/4와 cyclin D1/E의 발현은 억제시켰으며 만대로 CDK억제제인 p21과 p27의 발현은 대조군 수준으로 회복시키는 것으로 나타났다.
- 본 연구에서도 이를 확인하기 위해 ICAM-1, MCP-1 그리고 NF-κB p65의 발현 변화에 대한 위령탕의 영향을 연구하였다. 그 결과, 고포도당에 의해 염증 관여 인자들의 단백질 발현 뿐만 아니라 NF-κB p65의 핵에서의 발현 역시 현저한 증가를 보였으며 이를 위령탕이 억제시킴이 나타났다. 또한 위령탕은 ROS의 생성 정도 역시 감소시키는 것으로 나타났다.
- 그 결과, 고포도당에 의해 증가된 ROS의 생성 정도는 위령탕에 의해 농도-의존적인 감소를 보여주었다. 특히, 50 ㎍/ml의 농도로 위령탕을 전 처리한 군에서는 유의성 있는 차이를 보여 주었다 (Fig.
- H]-thymidine 의 결합 정도를 관찰하였다. 그 결과, 고포도당은 사람 유래 신장 메산지움 세포의 증식을 대조군에 비해 유의하게 증가시켰으나, 위령탕 투여는 농도에 비례하여 [3H]-thymidine 의 결합 정도가 감소됨을 알 수 있었다. 특히 20 ㎍/ml 과 50 ㎍/ml 의 농도로 위령탕을 전 처리 했을 때 유의한 감소를 나타내었다 (Fig.
- 또한, 염증 반응 조절에 관여하는 전사인자로 알려진 NF-κB의 발현에 대한 위령탕의 영향을 알아보기 위하여 핵과 세포질 단백질을 각각 추출하여 그 발현 변화를 측정하였다. 그 결과, 고포도당을 단독 처리했을 때 핵 부분의 NF-κB p65의 발현이 유의성 있게 증가하였고, 위령탕 추출물을 전 처리 하였을 때는 핵 내 NF-κB p65가 농도 의존적으로 억제되었다 (Fig. 5B).
- 및 TGF-β1 단백질 발현 정도를 확인하였다. 그 결과, 대조군에 비해 collagen IV 과 TGF-β1 발현 정도가 눈에 띄는 증가를 보였으며, 위령탕 추출물에 의해 감소되었다 (Fig. 3A). 또한 본 TGF-β1의 하위신호 중 잘 알려진 Smad의 단백질 발현에 대한 위령탕의 영향을 실험한 결과에서, 고포도당에 의해 증가된 Smad-2와 Smad-3의 인산화 정도가 위령탕에 의해 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
- 이에 본 연구에서 고포도당에 의해 유발되는 초기 당뇨병성 신장 손상에 대한 위령탕의 영향에 대해 실험하였다. 그 결과, 신장 메산지움 세포에서 고농도의 포도당은 TGF-ß의 단백질 발현 뿐만 아니라 mRNA 수준에서의 발현 역시 증가함이 나타났으며 이는 위령탕에 의해서 억제됨을 보였다. Smads의 발현 역시 위령탕에 의해 억제됨을 보였다.
- 따라서, 위령탕 추출물은 고포도당에 의해 유발된 신장 메산지움 세포의 증식, 신-손상, 그리고 초기 염증반응에 대한 억제 효과를 가지는 것으로 확인 되었으며, 이는 나아가 당뇨병성 신증을 개선하는데 있어 좋은 치료 방향이 될 것으로 사료된다.
- 3A). 또한 본 TGF-β1의 하위신호 중 잘 알려진 Smad의 단백질 발현에 대한 위령탕의 영향을 실험한 결과에서, 고포도당에 의해 증가된 Smad-2와 Smad-3의 인산화 정도가 위령탕에 의해 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 co-Smad인 Smad4의 단백질 발현 역시 위령탕에 의해 억제됨을 볼 수 있었다.
- 그 결과, 고포도당에 의해 염증 관여 인자들의 단백질 발현 뿐만 아니라 NF-κB p65의 핵에서의 발현 역시 현저한 증가를 보였으며 이를 위령탕이 억제시킴이 나타났다. 또한 위령탕은 ROS의 생성 정도 역시 감소시키는 것으로 나타났다. 이를 통해 위령탕이 염증 관여 인자들의 발현 억제와 산화적 스트레스의 감소를 통해 pro-inflammatory 반응을 개선하는데 효과를 가지며 이는 결과적으로 당뇨병성 신증으로의 진행을 억제하는데 영향을 미칠 것으로 사료된다.
- Smads의 발현 역시 위령탕에 의해 억제됨을 보였다. 또한 위령탕은 메산지움 팽창과 세포외 기질의 축적을 매개하는 주된 병리인자인 collagen IV의 축적을 감소시키는데 효과를 가지는 것으로 나타났다. 이를 통해 위령탕이 고포도당에 의해 유도되는 신장 손상을 개선하는데 효과를 가지며 이는 TGF-β/Smad 경로 조절을 통한 사구체 메산지움에서의 collagen IV의 축적을 감소시키며 결과적으로 사구체 세포외기질의 축적을 억제함으로써 신장의 섬유화를 억제함에 대한 가능성을 확인한 것으로 사료된다.
- blot 법을 이용하였다. 세포의 성장을 유도하는 단백질인 CDK2, CDK4, cyclinD1, 그리고 cyclinE의 단백질 발현 변화는 대조군에 비해 고포도당을 처리한 군에서의 눈에 띄는 증가를 보였으나, 위령탕을 전 처리한 군에서는 세포주기 조절 단백질들의 발현이 유의하게 감소하는 것을 보였다. 위령탕은 cyclin 계열의 세포성장을 촉진하는 단백질의 발현이 감소하는 반면, 세포성장을 저해하는 단백질인 p21과 p27의 발현은 증가됨을 나타내었다 (Fig.
- 세포의 성장을 유도하는 단백질인 CDK2, CDK4, cyclinD1, 그리고 cyclinE의 단백질 발현 변화는 대조군에 비해 고포도당을 처리한 군에서의 눈에 띄는 증가를 보였으나, 위령탕을 전 처리한 군에서는 세포주기 조절 단백질들의 발현이 유의하게 감소하는 것을 보였다. 위령탕은 cyclin 계열의 세포성장을 촉진하는 단백질의 발현이 감소하는 반면, 세포성장을 저해하는 단백질인 p21과 p27의 발현은 증가됨을 나타내었다 (Fig. 2).
- [3H]-thymidine assay를 통해 메산지움 증식에 대한 위령탕의 영향을 확인한 결과에서 고포도당에 의해 증가된 [3H]-thymidine 의 결합 정도가 위령탕 전처리에 의해 유의적으로 감소함을 보였다. 위령탕은 또한 세포 주기 조절 인자인 CDK2/4와 cyclin D1/E의 발현은 억제시켰으며 만대로 CDK억제제인 p21과 p27의 발현은 대조군 수준으로 회복시키는 것으로 나타났다. 이는 위령탕이 세포주기 관여 인자들의 조절을 통해 고포도당에 의해 유도되는 메산지움 세포의 과도한 증식을 억제 할 것으로 보여진다.
- 또한 위령탕은 메산지움 팽창과 세포외 기질의 축적을 매개하는 주된 병리인자인 collagen IV의 축적을 감소시키는데 효과를 가지는 것으로 나타났다. 이를 통해 위령탕이 고포도당에 의해 유도되는 신장 손상을 개선하는데 효과를 가지며 이는 TGF-β/Smad 경로 조절을 통한 사구체 메산지움에서의 collagen IV의 축적을 감소시키며 결과적으로 사구체 세포외기질의 축적을 억제함으로써 신장의 섬유화를 억제함에 대한 가능성을 확인한 것으로 사료된다. 이는 최근 사구체에서 TGF-β1의 발현을 억제함으로써 신장의 섬유화를 억제하여 사구체 경화 및 당뇨병성 신증 개선을 통해 만성 신부전을 예방할 것이라는 많은 연구들과 일치한다30).
- 또한 위령탕은 ROS의 생성 정도 역시 감소시키는 것으로 나타났다. 이를 통해 위령탕이 염증 관여 인자들의 발현 억제와 산화적 스트레스의 감소를 통해 pro-inflammatory 반응을 개선하는데 효과를 가지며 이는 결과적으로 당뇨병성 신증으로의 진행을 억제하는데 영향을 미칠 것으로 사료된다.
- 이상의 결과에서 위령탕은 신기능 보호효과와 사구체 메산지움 세포의 증식과 경화성 변화를 억제하는 것으로 나타났으며, 이는 위령탕이 TGF-β/Smad 경로 억제를 통한 신장 손상 개선으로 인한 collagen Ⅳ 축적 억제와 염증 관여 인자들의 발현 감소가 주요 작용 기전으로 관여하는 것으로 보인다. 따라서 본 연구를 통해 위령탕이 메산지움 세포에서의 신장손상 및 pro-inflammatory 반응 개선을 통해 초기 당뇨병성 신증으로의 진행에 있어 보호 효과를 가짐을 알 수 있었으며, 향후 임상적 효능 및 안전성 검증을 위한 추가연구를 통해 부작용이 거의 없는 초기 당뇨병성 신증 치료제로서의 가능성을 가질 것으로 사료된다.
후속연구
- 보인다. 따라서 본 연구를 통해 위령탕이 메산지움 세포에서의 신장손상 및 pro-inflammatory 반응 개선을 통해 초기 당뇨병성 신증으로의 진행에 있어 보호 효과를 가짐을 알 수 있었으며, 향후 임상적 효능 및 안전성 검증을 위한 추가연구를 통해 부작용이 거의 없는 초기 당뇨병성 신증 치료제로서의 가능성을 가질 것으로 사료된다.
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