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문제 정의
- 32) 본 연구에서는 돼지감자가 열, 삼투 및 산화적 다양한 스트레스가 주어진 환경에서 선충의 저항성 평가를 시행하였다. 먼저, NGM agar에 고농도의 NaCl을 첨가하여 삼투압에 대한 저항성을 검정한 결과, 돼지감자는 농도에 관계없이 선충의 생존율에 유의적인 영향을 미치지 못하였다(Fig.
- 노화 과정에 영향을 미치는 다양한 노화 관련 인자들이 알려져 있으며, 본 연구에서는 돼지감자의 수명연장 효과가 노화 관련 인자의 조절에 의한 것인지 알아보기 위해 돼지 감자 투여에 따른 선충의 식이 섭취량 및 성장의 변화를 측정하였다. 식이제한은 노화의 억제와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 Bordone 등은 식이량을 제한적으로 공급한 경우 선충의 수명이 유의적으로 증가한다고 보고하였다.
- 돼지감자는 매우 뛰어난 항산화 활성이 있다고 보고된 바있으며,33) 이를 바탕으로 본 연구에서는 돼지감자가 선충의 항산화능에 미치는 영향을 알아보았다. 먼저, 선충의 항산화 효소인 superoxide dismutase(SOD)에 대한 돼지감자의 활성은 xanthine과 xanthine oxidase의 반응에 의해 생성되는 superoxide anion(·O2−)에 의한 nitro blue tetrazolium (NBT) 환원능을 통해 간접적으로 검정하였다.
- 먼저 돼지감자를 처리한 선충의 수명을 측정하였고 이와 더불어 삼투압, 열자극, 산화적 환경 등 다양한 스트레스 조건에서 선충의 생존력을 확인하였다. 또한 돼지감자가 선충의 항산화효소의 활성 및 세포 내 ROS levels에 미치는 영향을 알아보았으며, 식이섭취, 성장, 움직임 등의 노화와 관련 인자들이 돼지감자의 수명연장 효과와 관련이 있는지 확인하였다.
- 항노화 약물 개발에 있어서 수명을 연장시키는 것과 더불어 건강하게 오래 사는 건강수명(healthspan)의 연장은 중요한 부분을 차지하고 있다. 본 연구에서는 돼지감자의 투여가 선충의 건강수명에 미치는 영향을 알아보기 위해서 노화한 선충의 움직임을 관찰하였다. 선충의 움직임이 확연하게 줄어드는 성체 8일째에 1분간의 운동량을 측정한 결과, 대조군은 1분 동안 2900 μm를 움직인 반면에 돼지감자 고농도군은 3500 μm를 움직여 유의적인(*p<0.
제안 방법
- 더불어, 선충의 모든 유전자 염기서열이 밝혀져 있으며 이들 중 인간의 유전자와 일치하거나 비슷한 것은 75% 이상이다.23,30,31) 이러한 장점 때문에 예쁜꼬마선충은 노화 연구에 있어서 각광받고 있는 모델이며 본 연구에서는 동물 모델을 사용하여 돼지감자의 항노화 효능을 검정하였다.
- Catalase 활성도 측정은 Aebi의 방법29)을 응용하여 25 mM H2O2에 샘플 50 μL를 반응시키고 3분 동안 240 nm로 흡광도를 측정하였다.
- 2A). 다음으로 돼지감자가 열자극에 의해 발생한 스트레스에 대한 저항성을 알아보기 위하여 20℃에서 배양되는 선충을 36℃에서 배양하여 열자극에 의한 조직의 손상을 유발하고 1시간마다 그 생존율을 측정하였다. Fig.
- 01)으로 효소 활성이 돼지감자 처리에 의해 농도의존적으로 증가함을 관찰할 수 있었다. 돼지감자에 의한 항산화 효소 활성의 증가가 실제 선충 내부의 활성산소종(ROS)이 감소되는 결과를 가져오는지 확인하기 위해서 H2DCF-DA와선충 내부 ROS를 반응시켜 나오는 형광을 정량하여 분석하였다. Fig.
- 그 후 adult day 4, 8에 깨끗한 NGM plate로 옮겨 1분 동안 인두의 움직임을 측정하였으며, adult day 1, 4에는 선충의 몸 길이를 증정하였다. 또한 성체 8일째에는 깨끗한 NGM plate로 옮겨져 20초 동안 선충이 움직인 거리를 실체현미경과 이미지 분석 프로그램을 사용하여 측정하였다.
- 2B에서 볼 수 있듯이 열자극이 가해진 환경에서 대조군은 최대 14시간 생존한 반면에 돼지감자 처리군은 선충의 최대 생존 시간을 농도의존적으로 증가시키는 것을 관찰할 수 있었으며 특히 고농도군에서는 그 상승폭이 크게 증가하는 것 (250 μg/mL, 21시간)을 확인할 수 있었다. 마지막으로 NGM agar에 paraquat을 첨가하여 돼지감자가 산화적 스트레스에 대한 저항성에 미치는 영향을 알아보았다. 실험 결과, 대조군은 최대 20시간까지 생존하였지만 돼지감자 처리군은 저농도rns(125 μg/mL)과 고농도군(250 μg/mL)에서 각각 24시간, 25시간까지 생존하였다.
- 먼저 돼지감자가 선충의 수명에 미치는 영향을 알아보기 위하여 돼지감자를 농도별로 처리한 NGM agar plate에서 lifespan assay를 수행하였다.
- elegans) 모델을 이용하여 검정하였다. 먼저 돼지감자를 처리한 선충의 수명을 측정하였고 이와 더불어 삼투압, 열자극, 산화적 환경 등 다양한 스트레스 조건에서 선충의 생존력을 확인하였다. 또한 돼지감자가 선충의 항산화효소의 활성 및 세포 내 ROS levels에 미치는 영향을 알아보았으며, 식이섭취, 성장, 움직임 등의 노화와 관련 인자들이 돼지감자의 수명연장 효과와 관련이 있는지 확인하였다.
- 먼저, 선충의 항산화 효소인 superoxide dismutase(SOD)에 대한 돼지감자의 활성은 xanthine과 xanthine oxidase의 반응에 의해 생성되는 superoxide anion(·O2−)에 의한 nitro blue tetrazolium (NBT) 환원능을 통해 간접적으로 검정하였다.
- 26) 성체 7일째에 선충을 80 mM parqauat plate 로 옮기고 시간별로 생존율을 확인하였다. 삼투압 스트레스 저항성은 성체 3일째에 500 mM NaCl이 함유된 NGM plate로 선충을 옮겨 측정하였으며, 선충의 생존율은 12시간 배양 후에 확인하였다.27) 각 실험은 독립적으로 3회 이상 수행하였다.
- 선충의 성장 단계를 일치시키기 위해 NGM plate로부터 egg만을 분리하여 각 농도별 plate(돼지감자 0, 125, 250 μg/mL)에 옮겨 배양하였고 매일 생존을 확인하였다.
- 세포내 활성산소종 분석 − 세포내 활성산소종은 2',7'-dichlorodihydrofluoreoscein diacetate(H2DCF-DA)를 사용하여 측정되었다.
- 실험 결과, 대조군은 최대 20시간까지 생존하였지만 돼지감자 처리군은 저농도rns(125 μg/mL)과 고농도군(250 μg/mL)에서 각각 24시간, 25시간까지 생존하였다.
- 스트레스 저항성 평가 − 성장 단계가 동일한 선충은 각 농도별 plate에서 배양되었다. 열자극에 대한 내성을 분석하기 위해 성체 4일째에 신선한 배지로 옮기고 36℃에서 배양하여 시간별로 생존율을 측정하였다.25) 산화적 스트레스에 대한 저항성은 Mekheimer 등의 방법을 약간 수정하여 시행하였다.
- 이에 돼지감자 250 μg/mL 농도를 최고 농도로 설정하여 추가 연구를 수행하였다.
- 이러한 돼지감자 투여에 의한 선충의 식이제한 효과는 돼지감자에 함유된 inulin 과 관련이 있을 것으로 추정된다. 한편, 노화 관련 인자 중 하나인 성장에 돼지감자가 미치는 영향을 조사하기 위해서 선충의 몸 길이를 측정하였다. 성장 역시 식이량과 마찬가지로 노화를 가속화시키는 인자로 알려져 있으며, 선충을 이용한 연구에서도 크기가 작은 선충일수록 수명이 증가한다고 보고되고 있다.
대상 데이터
- 실험재료 및 추출 − 본 실험에 사용된 돼지감자의 괴경은 2014년 8월 강원약초(Kangwon-do, Korea)에서 구입하여 우석대학교 약학대학 김대근 교수의 감정을 거친 후 실험을 진행하였다.
- 예쁜꼬마선충 배양 − 본 연구에 사용된 C. elegans(N2: wild type)는 Caenorhabditis Gentic Center(CGC: University of Minnesota, Minneapolis, MN)로부터 제공받았다.
데이터처리
- Differences compared to the control were considered significant at *p<0.05 and **p< 0.01 by one-way ANOVA.
- 유의성 검증은 Student’s t-test와 Log-rank test 분석법을 이용하였고 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001 수준에서 유의성을 검증하였다.
- 통계 분석 − 모든 자료는 평균값±표준오차(mean±S.E.M.)로 표시하였다.
이론/모형
- Change in mean lifespan (%) compared with control group. Statistical significance of the difference between survival curves was determined by rog-rank test using the Kaplan-Meier survival analysis. Differences compared to the control were considered significant at ***p<0.
- 이에 본 연구에서는 돼지감자가 노화에 미치는 영향을 예쁜꼬마선충(C. elegans) 모델을 이용하여 검정하였다. 먼저 돼지감자를 처리한 선충의 수명을 측정하였고 이와 더불어 삼투압, 열자극, 산화적 환경 등 다양한 스트레스 조건에서 선충의 생존력을 확인하였다.
성능/효과
- 성장 역시 식이량과 마찬가지로 노화를 가속화시키는 인자로 알려져 있으며, 선충을 이용한 연구에서도 크기가 작은 선충일수록 수명이 증가한다고 보고되고 있다.36) 실험 결과, 선충의 크기를 비교한 결과 대조군에 비해 돼지감자 투여에 의해 선충의 성장이 농도의존적으로 감소되는 것을 알 수 있었으며, 그 차이는 성체 1일째와 비교해 4일째에서 두드러지게 나타남을 확인하였다(Fig. 4B). 이러한 결과를 통해 돼지감자의 수명 연장 효과는 노화 관련 인자인식이 및 성장의 억제와도 관련이 있는 것을 알 수 있었다.
- Fig. 2B에서 볼 수 있듯이 열자극이 가해진 환경에서 대조군은 최대 14시간 생존한 반면에 돼지감자 처리군은 선충의 최대 생존 시간을 농도의존적으로 증가시키는 것을 관찰할 수 있었으며 특히 고농도군에서는 그 상승폭이 크게 증가하는 것 (250 μg/mL, 21시간)을 확인할 수 있었다.
- 돼지감자에 의한 항산화 효소 활성의 증가가 실제 선충 내부의 활성산소종(ROS)이 감소되는 결과를 가져오는지 확인하기 위해서 H2DCF-DA와선충 내부 ROS를 반응시켜 나오는 형광을 정량하여 분석하였다. Fig. 3C에서 나타난 것과 같이 돼지감자 처리군은 대조군에 비해 활성산소종이 농도의존적으로 낮게 측정되었으며 그 차이는 시간이 지날수록 더욱 커지는 것으로 확인되었다. 따라서 돼지감자는 자체의 radical 소거능과 더불어 선충의 항산화활성을 증가시켜 결과적으로 세포 내 ROS를 감소시킨 것으로 생각되며, 이와 같은 결과는 돼지감자에 함유된 caffeic acid, chlorogenic acid, kaempferol-3-O-glucoside 등의 phenolic compound와 관련이 있을 것으로 사료된다.
- 돼지감자는 항산화 효소인 SOD 및 CAT의 활성을 증가시키고 그 결과 세포 내 ROS를 감소시켰다. 더불어 돼지감자는 노화 관련 인자 가운데 식이섭취량 및 성장을 억제시켜 수명을 연장시키는 것을 알 수 있었다. 한편, 노화한 선충에서 활동량은 돼지감자 투여에 의해 유의적으로 증가하여 건강수명이 증가하는 것을 알 수 있었다.
- 돼지감자 투여에 따라 125 μg/mL 및 250 μg/mL 농도에서 각각 평균 수명이 9.2%, 22.7% 증가하였으며, 500 μg/mL 농도에서 수명 연장 효과는 250 μg/mL일 때와 유사하게 나타났다(Table I).
- 3C에서 나타난 것과 같이 돼지감자 처리군은 대조군에 비해 활성산소종이 농도의존적으로 낮게 측정되었으며 그 차이는 시간이 지날수록 더욱 커지는 것으로 확인되었다. 따라서 돼지감자는 자체의 radical 소거능과 더불어 선충의 항산화활성을 증가시켜 결과적으로 세포 내 ROS를 감소시킨 것으로 생각되며, 이와 같은 결과는 돼지감자에 함유된 caffeic acid, chlorogenic acid, kaempferol-3-O-glucoside 등의 phenolic compound와 관련이 있을 것으로 사료된다.34) 더불어, 돼지감자의 항산화활성은 수명연장 효과와 밀접한 관련이 있을 것으로 추정된다.
- 돼지감자는 대조군에 비하여 선충의 수명을 농도의존적으로 증가시켰다. 또한 다양한 스트레스 환경에서의 생존율을 확인한 결과, 돼지감자는 삼투압 저항성에는 영향을 미치지 않았으나 열자극 및 산화적 스트레스 환경에서 선충의 생존율을 효과적으로 향상시켰다. 돼지감자는 항산화 효소인 SOD 및 CAT의 활성을 증가시키고 그 결과 세포 내 ROS를 감소시켰다.
- 32) 본 연구에서는 돼지감자가 열, 삼투 및 산화적 다양한 스트레스가 주어진 환경에서 선충의 저항성 평가를 시행하였다. 먼저, NGM agar에 고농도의 NaCl을 첨가하여 삼투압에 대한 저항성을 검정한 결과, 돼지감자는 농도에 관계없이 선충의 생존율에 유의적인 영향을 미치지 못하였다(Fig. 2A). 다음으로 돼지감자가 열자극에 의해 발생한 스트레스에 대한 저항성을 알아보기 위하여 20℃에서 배양되는 선충을 36℃에서 배양하여 열자극에 의한 조직의 손상을 유발하고 1시간마다 그 생존율을 측정하였다.
- 선충의 움직임이 확연하게 줄어드는 성체 8일째에 1분간의 운동량을 측정한 결과, 대조군은 1분 동안 2900 μm를 움직인 반면에 돼지감자 고농도군은 3500 μm를 움직여 유의적인(*p<0.05) 건강수명 연장효과가 관찰되었다.
- 실험 결과, 돼지감자 처리에 의해 선충의 식이 섭취량이 농도의존적으로 감소함을 확인할 수 있었고 4일과 8일째 모두 고농도군에서는 대조군 대비 유의적(*p<0.05)인 감소를 보였다(Fig. 4A).
- 실험 결과, 돼지감자는 대조군에 비해서 농도의존적으로 SOD의 활성을 저농도군은 189.22%(*p<0.05), 고농도군은 202.33%(**p<0.01) 증가시켰다(Fig. 3A).
- 실험 결과, 대조군은 최대 20시간까지 생존하였지만 돼지감자 처리군은 저농도rns(125 μg/mL)과 고농도군(250 μg/mL)에서 각각 24시간, 25시간까지 생존하였다. 이러한 결과로 미루어보아 돼지감자의 수명 연장 효과는 스트레스 저항성과도 밀접한 관련이 있음을 확인할 수 있었다.
- 05) 건강수명 연장효과가 관찰되었다. 이러한 결과를 통해 돼지감자는 항노화 효과가 있는 것을 알 수 있었으며. 향후 추가 연구를 통해 건강식품으로서의 가치가 높아질 수 있을 것으로 기대된다.
- 4B). 이러한 결과를 통해 돼지감자의 수명 연장 효과는 노화 관련 인자인식이 및 성장의 억제와도 관련이 있는 것을 알 수 있었다. 항노화 약물 개발에 있어서 수명을 연장시키는 것과 더불어 건강하게 오래 사는 건강수명(healthspan)의 연장은 중요한 부분을 차지하고 있다.
- 이와 더불어 H2O2의 분해를 촉매하는 효소인 catalase(CAT)의 항산화 활성에 돼지감자가 미치는 영향을 조사한 결과 대조군의 CAT activity가 3.56 U/mg protein인데 반해 돼지감자 저농도군은 7.71 U/mg protein(*p<0.05), 고농도군에서는 10.89 U/mg protein(**p< 0.01)으로 효소 활성이 돼지감자 처리에 의해 농도의존적으로 증가함을 관찰할 수 있었다.
- 더불어 돼지감자는 노화 관련 인자 가운데 식이섭취량 및 성장을 억제시켜 수명을 연장시키는 것을 알 수 있었다. 한편, 노화한 선충에서 활동량은 돼지감자 투여에 의해 유의적으로 증가하여 건강수명이 증가하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 돼지감자 괴경이 노화 및 노화관련 질환의 치료 및 예방에 활용될 수 있음을 시사한다.
후속연구
- 한편, 노화한 선충에서 활동량은 돼지감자 투여에 의해 유의적으로 증가하여 건강수명이 증가하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 돼지감자 괴경이 노화 및 노화관련 질환의 치료 및 예방에 활용될 수 있음을 시사한다.
- 이러한 결과를 통해 돼지감자는 항노화 효과가 있는 것을 알 수 있었으며. 향후 추가 연구를 통해 건강식품으로서의 가치가 높아질 수 있을 것으로 기대된다.
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