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문제 정의
- 그러나 식물의경우 수확시기에 따라 성분과 생리활성이 크게 좌우되며, 또한 함초의 용도가 4~6월의 식용과 9~10월의 약용으로 구분됨을 고려할 때 수확시기별 함초의 유용생리활성 변화에 대한연구가 필요하나, 현재까지 함초의 수확시기별 성분변화와 활성연구는 매우 제한적이며, 또한 기존 연구가 8~10월에 집중되어 있으며, 생리활성 평가가 항산화 활성에 한정되어 있는실정이다[6, 17]. 따라서 본 연구에서는 함초를 이용한 기능성식품 소재개발 연구의 일환으로, 4~10월의 다양한 시기에 채취한 함초를 대상으로 유용성분 분석과 이에 따른 항산화, 항혈전 활성을 분석하였으며, 그 결과 특정시기에 수확된 함초를 특정용매로 추출하는 경우 새로운 항산화제 및 항혈전제로개발할 수 있음을 확인하여, 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Japan)하여 분말로조제하였다[13]. 에탄올 추출물은 이물질을 제거하고 수세한함초에 10배의 95% ethanol (Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd., Korea)을 가한 후 상온에서 24시간, 3회 반복 추출하였으며, 추출액은 상기와 동일하게 감압 농축하여 분말로 조제하였다. 조제된 추출물들은 DMSO또는 증류수에 적당한 농도로 녹여, 성분분석, 혈액응고 저해, 혈소판 응집저해, 적혈구용혈활성 및 항산화 활성에 사용하였다.
- 1). 열수 추출물 제조를 위해서는 함초시료에 대해 10배의 증류수를 가하고 100℃에서 1시간 가열 추출한 후 방냉하고, 다시 상기 과정을 1회 반복한 후 추출액을 모아 filter paper (Whatsman No. 2)로 거른 후 감압 농축(Eyela Rotary evapo- rator N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Ltd. Japan)하여 분말로조제하였다[13]. 에탄올 추출물은 이물질을 제거하고 수세한함초에 10배의 95% ethanol (Daejung Chemicals & Metals Co.
- 5 μl를 넣고 혈소판 응집을 측정하였다. 응집반응은 collagen 첨가 후 12분간 측정하였으며, 응집곡선의 area under값을 구하였다. 함초 추출물의 혈소판응집도 는 시료 첨가시의 area under 값과 용매대조구인 DMSO 첨가시의 area under값의 비를 백분율로 나타내었다 [13].
- 각각의 혈액응고활성은 3회 반복 측정하였으며, thrombin, prothrombin, 혈액응고인자 저해활성은 시료 첨가시의 TT, PT 및 aPTT의 평균값을 용매 대조구인 DMSO첨가시의 TT, PT및 aPTT 평균값의 비로 각각 나타내었다[14]. 이때 시료 대조군으로는 aspirin (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을, 용매 대조군으로는 열수 추출물의 경우증류수를, 에탄올 추출물의 경우 DMSO를 사용하였으며, 각각의 실험은 3회 반복 측정하였다.
- )를가하고 혼합하였다. 이후 15분간 실온에서 방치 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 nitrite 양을 측정하였다. NSA (%) 는 다음의 식에 의해 계산하였으며, 소거 활성의 비교는 RC50 으로 나타내었다.
- , Korea)을 가한 후 상온에서 24시간, 3회 반복 추출하였으며, 추출액은 상기와 동일하게 감압 농축하여 분말로 조제하였다. 조제된 추출물들은 DMSO또는 증류수에 적당한 농도로 녹여, 성분분석, 혈액응고 저해, 혈소판 응집저해, 적혈구용혈활성 및 항산화 활성에 사용하였다. 실험에 사용한 함초시료는 안동대학교 식품영양학과에서 보관하고 있다(voucher specimen 2015-SH1~5).
- 조제된 함초 추출물의 항산화 활성은 기존의 보고[13]한 DPPH (1, 1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 음이온 소거능, ABTS [2, 2-azobis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonate)] 양이온 소거능 및 환원력 측정으로 평가하였으며, 최종 항산화 활성의 비교는 RC50 (표준조건에서 활성 radical을 50% 제거하는데 소요되는 시료의 양)으로 나타내었다. 이때 활성 대조구로는 vi- tamin C (Sigma Co.
- 함초 시료의 혈액응고 저해 활성은 기존의 보고한 throm- bin time (TT), prothrombin time (PT) 및 activated partial thromboplastin time (aPTT)을 측정하여 평가하였다[13]. 혈장은 시판 control plasma (MD Pacific Technology Co.
- 함초 추출물의 항혈전 활성을 평가하기 위해 0.25 mg/ml 농도의 시료를 이용하여 인간 혈소판 응집저해능을 평가하였다. 아스피린은 농도 의존적으로 혈소판 응집을 저해하였으며, 0.
- 함초 추출물의 항혈전 활성을 평가하기 위해 5 mg/ml 농도의 시료를 이용하여 혈액응고 저해활성을 평가하였다(Table 2, Table 3). 먼저 트롬빈 타임의 경우, 열수 추출물에서는 9월함초가 트롬빈 타임을 1.
- 혈소판 응집저해 활성은 혈소판이 미세전극에 부착, 응집됨에 따라 발생하는 전기 저항값의 변화를 Whole Blood Aggregometer (Chrono-log, PA, U.S.A)를 시용하여 측정하였다[39]. 먼저 10 mM CaCl2 50 μl, suspending buffer 147.
대상 데이터
- 본 실험의 함초 시료는 2015년 6월~2016년 6월에 전남 신안군 농가의 동일장소에서 재배한 함초를 구입하여 사용하였다 (Fig. 1). 열수 추출물 제조를 위해서는 함초시료에 대해 10배의 증류수를 가하고 100℃에서 1시간 가열 추출한 후 방냉하고, 다시 상기 과정을 1회 반복한 후 추출액을 모아 filter paper (Whatsman No.
- 먼저 PBS로 3회 수세한인간 적혈구(4%) 100 μl를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 시료용액 100 μl를 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리(1,500 rpm)하여 상등액 100 μl를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른헤모글로빈 유출 정도를 414 nm에서 측정하였다. 시료의 용매대조구로는 DMSO (2%)를 사용하였으며, 활성 대조구로는 triton X-100을 사용하였다. 용혈활성은 다음의 식을 이용하여계산하였다.
- 조제된 추출물들은 DMSO또는 증류수에 적당한 농도로 녹여, 성분분석, 혈액응고 저해, 혈소판 응집저해, 적혈구용혈활성 및 항산화 활성에 사용하였다. 실험에 사용한 함초시료는 안동대학교 식품영양학과에서 보관하고 있다(voucher specimen 2015-SH1~5).
- 시료의 양)으로 나타내었다. 이때 활성 대조구로는 vi- tamin C (Sigma Co.)를, 용매 대조구로는 DMSO를 사용하였다. 한편 nitrite 소거능의 경우 아질산염 용액(1 mM)에 시료 용액을 가하고 여기에 0.
- 혈장은 시판 control plasma (MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China), PT reagent와 aPTT re- agent는MD Pacific Hemostasis (MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)의 분석시약을, 기타 시약은 시약급 이상으로 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)의 제품을 구입하여 사용하였다[3]. 각각의 혈액응고활성은 3회 반복 측정하였으며, thrombin, prothrombin, 혈액응고인자 저해활성은 시료 첨가시의 TT, PT 및 aPTT의 평균값을 용매 대조구인 DMSO첨가시의 TT, PT및 aPTT 평균값의 비로 각각 나타내었다[14].
데이터처리
- 실험 결과는 SPSS 23.0 버전을 사용하여 mean±SD 로 나타내었으며, 각 군간의 차이는 ANOVA로 분석하였으며, Dun- can 다중비교 검증법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였다. 유의수준은 p<0.
이론/모형
- Total flavonoid (TF) 및 Total polyphenol (TP) 함량 측정은기존의 보고된 방법[27]에 따라 측정하였으며, 각각 rutin과 tannic acid를 표준시약으로 사용하였다. 총당 정량의 경우에는 phenol-sulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다[31].
- acid를 표준시약으로 사용하였다. 총당 정량의 경우에는 phenol-sulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다[31]. 각각의 분석결과는 3회 반복한 실험의평균과 편차로 나타내었다.
성능/효과
- 4A, 4E). ABTS 양이온 소거능을 0.5 mg/ml 농도에서 평가한 결과, 열수 추출물에서는 10월함초가 81.1% 소거능, 에탄올 추출물에서는 9월 함초가 79.2% 로 가장 높게 나타났으며, 4월 함초의 경우 추출용매와 무관하게 가장 낮은 소거능을 나타내었다(Fig. 4B, 4F). Nitrite 소거능을 0.
- 4B, 4F). Nitrite 소거능을 0.2 mg/ml 농도에서 평가한 경우, 열수 추출물은 6, 9, 10월함초가 57~59%의 유사한 소거능을 나타낸 반면, 에탄올 추출물의 경우 4월에서 9월로 재배시기가 증가할수록 nitrite 소거능도 유의적으로 증가하여 최대 69.4% 소거능을 나타내었으며, 이후 10월에는 8월 소거능 수준으로 감소하였다(Fig. 4C, 4G). 다양한 농도의 시료를 이용하여 DPPH 음이온, ABTS 양이온, nitrite 소거능을 측정한 후, 각각의 추출물의 활성 radi- cal 소거능을 RC50로 계산한 결과, 열수 추출물은 10월이, 에탄올 추출물은 9월이 가장 낮은 RC50를 나타내었다(Table 1).
- 1). 각각의 시기에 채취한 함초의 열수 및 에탄올 추출물의 수율을 측정한 결과 특징적인패턴을 나타낸 바, 먼저 열수 추출의 경우 4월 함초4.3% 추출효율이 6월 함초 3.2%로 감소한 후 8월 함초에서는 5.72%로최고조에 도달하였으나, 이후 서서히 감소하여 10월 함초는 4.56% 추출 수율을 나타내었다. 반면 에탄올 추출의 경우 4월함초 5.
- 5 mg/ml)에 비해 미약한 활성을나타내었다. 내인성 혈전과 관련된 aPTT의 경우 열수 추출물의 경우 4~6월 함초 추출물에서 아스피린(1.5 mg/ml)보다 우수한 항응고 활성을 나타내었으며, 이는 에탄올 추출물에서도동일하게 나타났다. 특히 에탄올 추출물의 경우 6월 이후 감소된 aPTT 저해가 10월 함초에서 다시 유의성 있게 증가하였다.
- 4C, 4G). 다양한 농도의 시료를 이용하여 DPPH 음이온, ABTS 양이온, nitrite 소거능을 측정한 후, 각각의 추출물의 활성 radi- cal 소거능을 RC50로 계산한 결과, 열수 추출물은 10월이, 에탄올 추출물은 9월이 가장 낮은 RC50를 나타내었다(Table 1). 그러나 대조구로 사용된 vitamin C에 비해서는 상대적으로 미약한 활성을 나타내었다.
- 3). 따라서 관능성과 부드러운 식감을 고려할 때, 식용으로는 8월 함초가 적합하며, 유용 생리활성소재로 이용하고자 하는 경우 9~10월 함초가 적합함을 알 수 있었다.
- 4에 나타내었다. 먼저 DPPH 음이온 소거능을 0.5 mg/ml 농도에서 평가한결과 9월 함초에서 가장 높게 나타났으며, 열수 추출물은 9월함초의 강력한 DPPH 소거능이 10월까지 유지된 반면 에탄올추출물은 9월 함초의 72.7% 소거능이 10월 함초에서는 52%로유의적으로 감소하였다(Fig. 4A, 4E). ABTS 양이온 소거능을 0.
- 5 mg/ml농도의 아스피린보다 강력한 것으로 확인되었다(Table 2). 반면 외인성 혈전 생성과 관련된 프로트롬빈 저해는 열수 추출물의경우 4~6월에서 우수하였으며, 에탄올 추출물은 10월에서 가장 강력하였으나, 아스피린(1.5 mg/ml)에 비해 미약한 활성을나타내었다. 내인성 혈전과 관련된 aPTT의 경우 열수 추출물의 경우 4~6월 함초 추출물에서 아스피린(1.
- 5 mg/ml 농도까지 전혀 용혈활성이 나타나지 않았다(results not shown). 상기의 연구 결과는, 함초는 성장단계에 따라 다양한 성분을 함유하며 이에 따라 수확시기별로 다양한 생리활성을 나타냄을 제시하고 있으며, 4~6월의 함초는 내인성 항응고제로, 8~9월의 함초는 트롬빈 저해제로, 9~10월의 함초는항산화제로 개발 가능함을 제시하고 있다. 본 연구결과는 함초를 이용한 기능성 식품 제조의 기초자료로 이용될 것이다.
- 3). 즉함초의 경우 수용성 폴리페놀, 플라보노이드 성분은 10월로 갈수록 증가하였으며, 지용성 폴리페놀, 플라보노이드 성분은 9월에서 가장 높은 함량을 나타내었다. 한편 총당 및 환원당 함량의 경우 열수 추출물 및 에탄올 추출물 모두에서 8월 함초가 가장 높게 나타났으며, 이는 기존의 6, 8, 10월 수확한 함초의 분석보고와 일치되는 결과이다[6].
후속연구
- 상기의 연구 결과는, 함초는 성장단계에 따라 다양한 성분을 함유하며 이에 따라 수확시기별로 다양한 생리활성을 나타냄을 제시하고 있으며, 4~6월의 함초는 내인성 항응고제로, 8~9월의 함초는 트롬빈 저해제로, 9~10월의 함초는항산화제로 개발 가능함을 제시하고 있다. 본 연구결과는 함초를 이용한 기능성 식품 제조의 기초자료로 이용될 것이다.
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