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문제 정의
- 또한, linarin은 amyloid로 유도된 신경세포의 사멸을 막고(16), 기억력 감퇴의 원인이 되는 acetylcholinesterase의 활성을 억제함으로써 알츠하이머성 치매의 치료제로서 가능성이 보고된 바 있다(17). 이에 본 연구에서는 한방에서 약재로 사용되고 있는 구절초를 여러 조건별로 추출하여 추출조건에 따른 linarin의 함량 변화와 다양한 in vitro 생리활성을 탐색하고, 건강기능식품 소재로서의 활용 가능성을 확인해보고자 하였다.
제안 방법
- 시료와 enzyme을 먼저 37°C에서 15분 동안 반응시킨 후, 기질 4 μL를 첨가하여 37°C에서 30분 동안 반응시켰다. ELISA reader(Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific Inc.)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였으며, pancreatic lipase inhibitory activity는 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다. 양성대조군으로 위와 췌장의 지방분해효소 억제제인 orlistat(Sigma-Aldrich Co.
- HPLC 분석을 위한 조건으로 column은 Atlantis dC18(id. 4.6×250 mm, 5 μm, Waters, Milford, MA, USA)을 사용하였고, 검출 파장은 331 nm에서 분석하였다.
- 구절초 추출물을 메탄올에 녹여 0.45 μm PVDF syringe filter로 여과한 후 linarin 성분을 HPLC(Shimadzu LC20AD, Kyoto, Japan)로 측정하였다.
- 구절초 추출조건별 항산화 활성으로 ABTS 라디칼 소거 활성과 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였다. ABTS 라디칼 소거 활성은 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid가 100 µg/mL에서 88.
- 구절초의 기능성 원료 개발 가능성을 확인하기 위해 추출 조건별 α-glucosidase 저해 활성 측정으로 탄수화물 흡수 지연 활성을 평가하였다.
- 농축된 구절초 추출물을 여과한 후 수분측정기(MA50C, Satorius Co., Goettingen, Germany)를 사용하여 각각의 추출물에 대하여 추출 수율을 측정한 다음 -75°C, 5 mtorr 조건으로 동결건조(MCFD8512, Ilshinbiobase Co., Dongducheon, Korea) 하였다.
- 대량 재배된 구절초 전초를 10월 하순부터 11월 중순까지 수확 후 절단 가공하여 그 절편을 45°C에서 최종 수분 함량이 5% 이내가 되도록 24시간 동안 열풍건조(COBP-10S, Shinheung Industry Co. Ltd., Chungju, Korea) 한 후 사용하였다.
- 현재 시판되는 lipase 저해제로 orlistat(tetrahydrolipstatin)이 많이 사용되고 있으나(28), 지방변, 대변실금, 우울, 근육통 등의 부작용이 보고되어(5) 소재 발굴이 필요한 실정이다. 본 연구에서는 구절초 추출조건별 lipase 저해 활성을 확인하고, 양성 대조군으로 orlistat을 사용하여 Fig. 4에 나타내었다. Orlistat이 100 μg/mL에서 나타낸 활성을 100%로 보았을 때 구절초 추출물의 활성은 50°C, 50% 주정 추출조건에서 49.
- 본 연구에서는 구절초를 대상으로 물과 에탄올을 이용하여 확보한 각각의 추출물에 대하여 추출 수율, 폴리페놀 함량, 플라보노이드 함량, linarin 함량, ABTS 라디칼 소거능과 DPPH 라디칼 소거능, α-glucosidase 저해 활성, lipase 저 해 활성을 측정하였다.
- 본 연구에서는 구절초의 α-glucosidase 저해 활성을 검증하여 Fig. 3에 나타내었고, 양성대조군으로 acarbose를 사용하였다.
- 시료 10 μL에 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS, Sigma-Aldrich Co.) 시약 190 μL를 혼합한 후 실온에서 7분간 반응시킨 다음, 734 nm에서 ELISA reader(Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific Inc.)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
- 시료 10 μL에 2,2-diphenyl1-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma-Aldrich Co.) 시약 90 μL를 혼합한 후 실온에서 10분간 반응시킨 다음, 517 nm에서 ELISA reader(Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific Inc.)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
- 시료 20 μL에 Folin-Denis' reagent(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 100 μL를 첨가하여 40°C에서 1분간 반응시킨 후 7.5% Na2CO3 용액 80 μL를 첨가하여 40°C에서 15분간 반응시킨 다음, 765 nm에서 ELISA reader(Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
- 시료 20 μL에 diethylene glycol(Samchun Co., Pyeongtaek, Korea) 200 μL와 1 N NaOH 20 μL를 첨가한 후 37°C에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 420 nm에서 ELISA reader(Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific Inc.)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
- 추출용매와 추출온도는 정제수(distilled water)로 추출 시 95°C 조건에서 수행하였으며, 30%, 50%, 70%, 95% 주정(ethanol)으로 추출 시 50°C와 70°C 조건에서 수행하였다. 추출 방법은 칭량된 구절초의 25배수의 용매로 4시간 동안 추출하였다. 농축은 감압농축기(Laborata 20 control, Heidolph Instruments GmbH & Co.
- 추출용매와 추출온도는 정제수(distilled water)로 추출 시 95°C 조건에서 수행하였으며, 30%, 50%, 70%, 95% 주정(ethanol)으로 추출 시 50°C와 70°C 조건에서 수행하였다.
대상 데이터
- 5 mg/mL의 농도로 4°C에서 용해한 후 4,000 rpm으로 원심분리 하여 상층액을 얻어 enzyme solution으로 사용하였다. Substrate로 p-nitrophenyl butyrate(p-NPB, Sigma-Aldrich Co.)를 dimethylformamide에 10 mM로 용해하여 사용하였다. Tris buffer(100 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, pH 7.
- 본 실험에 사용한 구절초 원료는 2015년에 세종시 장군면에 소재한 (주)영평식품으로부터 구입하였다. 대량 재배된 구절초 전초를 10월 하순부터 11월 중순까지 수확 후 절단 가공하여 그 절편을 45°C에서 최종 수분 함량이 5% 이내가 되도록 24시간 동안 열풍건조(COBP-10S, Shinheung Industry Co.
- 양성대조군으로 α-glucosidase inhibitor인 acarbose(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다.
- )를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였으며, pancreatic lipase inhibitory activity는 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다. 양성대조군으로 위와 췌장의 지방분해효소 억제제인 orlistat(Sigma-Aldrich Co.)을 사용하였다.
- , Waltham, MA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 표준용액은 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였으며, 총 폴리페놀 함량은 시료 1 g 중의 mg gallic acid equivalent(GAE, dry basis)로 나타내었다.
- )를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 표준용액은 naringin(SigmaAldrich Co.)을 사용하였으며 총플라보노이드 함량은 시료 1 g 중 mg naringin equivalent(NAE, dry basis)로 나타내었다.
데이터처리
- Linarin, 총폴리페놀, 총플라보노이드 함량, 항산화 활성, α-glucosidase와 lipase 저해활성 간의 상관관계는 PASW Statistics version 18.0(Predictive Analytics Software, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 Pearson's correlation analysis를 적용하여 분석하였다.
- Significantly different between water extracts and ethanol extracts were determined using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnet's multiple comparison test.
- Values are the means±SD. Significantly different between water extracts and ethanol extracts were determined using twoway analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni post test. *P<0.
- Values are the means±SD. Significantly different between water extracts and ethanol extracts were determined using twoway analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni post test. *P<0.
- 모든 실험 결과는 GraphPad Prism version 5.0(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 이용하여 ANOVA의 one-way Dunnet's multiple comparison test와 twoway Bonferroni post test에 의해 각 실험군 간의 유의성을 P<0.05 수준에서 검증하였다.
이론/모형
- α-Glucosidase inhibitory activity는 Kim 등(7)의 방법을 이용하여 측정하였다.
- ABTS cation radical scavenging activity는 Re 등(20)의 방법을 이용하여 측정하였다. 시료 10 μL에 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS, Sigma-Aldrich Co.
- DPPH radical scavenging activity는 Ramos 등(21)의 방법을 이용하여 측정하였다. 시료 10 μL에 2,2-diphenyl1-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma-Aldrich Co.
- 지방 흡수 억제 활성 실험은 Kwon 등(22)의 방법을 이용하여 측정하였다. Enzyme buffer(10 mM MOPS, 1 mM EDTA, pH 6.
- 총폴리페놀 함량은 Folin-Denis(18)법을 이용하여 측정하였다. 시료 20 μL에 Folin-Denis' reagent(Sigma-Aldrich Co.
- 총플라보노이드 함량은 Eum 등(19)의 방법을 이용하여 측정하였다. 시료 20 μL에 diethylene glycol(Samchun Co.
성능/효과
- 100 μg/mL의 농도에서 acarbose는 61.97%의 α-glucosidase 저해 활성을 나타냈고, 구절초 추출조건 중에서는 70°C, 95% 주정 추출조건에서 28.38%로 가장 높은 활성을 보였다.
- 250 µg/mL에서 ascorbic acid는 89.07%의 활성을 보였으며, 구절초 추출조건 중에서는 열수 및 70°C, 50% 주정 추출조건에서 각각 88.71%, 86.93%로 가장 높은 ABTS 라디칼 소거 활성을 보였다.
- 250 μg/mL에서 ascorbic acid는 89.55%를 보였으며, 구절초는 70°C, 30%, 50% 주정 추출조건이 각각 29.18%, 32.30%의 소거 활성을 가져 가장 높았다.
- 250 μg/mL에서는 50% 주정에서 추출할 때 50°C와 70°C에서 각각 101.99%, 101.28%의 활성을 보였으며, 500 μg/mL에서는 50% 주정 농도에서 50°C와 70°C에서 각각 90.38%, 90.44%의 활성을 나타내었다.
- 250 μg/mL의 농도에서는 acarbose가 76.98%의 활성을 나타냈고, 구절초는 70°C, 50% 주정 추출조건에서 54.17%로 추출물 중 가장 높은 저해 활성을 나타냈다.
- 50°C, 50%, 70% 주정 추출조건과 70°C, 70%, 95% 주정 추출조건에서도 45.99% 이상의 저해 활성을 보였다.
- 500 µg/mL에서는 ascorbic acid가 89.03%의 소거 활성을, 구절초 추출조건 중에서는 70°C, 50% 주정 추출조건에서 87.81%의 소거 활성을 보였으며, 50°C, 50% 주정 추출조건을 제외한 모든 추출조건에서 85% 이상의 소거 활성을 보였다(Fig. 2A).
- 500 μg/mL에서 ascorbic acid가 90.04%를, 구절초는 70°C, 50% 주정 추출조건에서 가장 높은 51.42%의 소거 활성을 가졌고, 95% 주정 추출조건은 온도와 관계없이 모든 농도에서 가장 낮은 활성을 보였다(Fig. 2B).
- 500 μg/mL의 농도에서는 acarbose가 87.04%의 활성을 나타냈으며, 50°C, 70°C, 50% 주정 추출조건에서 각각 77.46%와 74.59%의 활성을 나타내었다.
- 70°C, 50% 주정 추출조건에서 57.08 mg/g extract로 가장 높게 나타났으며, 그다음으로 70°C, 70% 주정 및 50°C, 50% 주정 추출 조건에서 각각 53.33 mg/g extract, 52.41 mg/g extract로 높게 측정되었다.
- 95% 주정 추출물은 50°C, 70°C 추출조건에서 각각 33.82 mg/g extract, 36.12 mg/g extract로 가장 적게 함유된 것으로 나타났다(Fig. 1C).
- ABTS 라디칼 소거 활성은 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid가 100 µg/mL에서 88.80%의 활성을 보였고, 구절초 추출조건 중에서는 70°C, 50% 주정 추출조건이 53.86%로 가장 높게 나타났으며, 그다음으로 열수 추출물에서 52.63%로 나타났다.
- ABTS, DPPH 라디칼 소거 활성은 구절초 추출조건 중 같은 주정 농도에서 온도가 높을수록 더 높은 활성을 보였고, 그중 70°C, 50% 주정 추출조건에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
- DPPH 라디칼 소거 활성은 ascorbic acid가 100 μg/mL에서 88.61%를 보였고, 구절초는 70°C, 30%, 50% 주정 추출조건이 각각 14.46%, 16.21%로 가장 높은 활성을 나타냈다.
- Linarin 함량은 열수 추출조건보다 주정 추출조건에서 함량이 높았고, 95% 주정 추출조건을 제외하고 50°C 보다 70°C일 때 더 많이 함유된 것으로 보아, linarin은 50%에서 70% 주정 추출조건에서 높은 온도로 추출할 때 많은 양이 추출되는 것으로 확인되었다.
- Linarin의 함량과 총폴리페놀 함량, 총플라보노이드 함량의 상관계수는 각각 0.316(P>0.05), 0.649(P0.05), 0.391(P<0.05)의 상관계수를 나타내어 양의 상관관계를 보였다.
- Orlistat이 100 μg/mL에서 나타낸 활성을 100%로 보았을 때 구절초 추출물의 활성은 50°C, 50% 주정 추출조건에서 49.75%를 나타내었으며, 50°C, 95% 주정 추출조건에서는 42.02%, 70°C, 70% 주정 추출조건에서는 40.90%의 활성을 나타내었다.
- 구절초 추출물의 총폴리페놀 함량은 ABTS, DPPH 라디칼 소거 활성과 각각 0.757(P<0.001), 0.815(P<0.001)의 상관계수를 나타내며 매우 높은 양의 상관관계를 보였고, 추출물의 총플라보노이드 함량 또한 ABTS, DPPH 라디칼 소거 활성과 각각 0.656(P<0.001), 0.838(P<0.001)의 상관계수를 보여 매우 높은 양의 상관관계를 나타내었다.
- 구절초 추출조건 중 열수 추출물이 62.68 mg/g extract로 가장 높았고, 그다음으로 70°C, 50% 주정 추출물 조건에서 50.49 mg/g extract로 높게 측정되었다.
- 구절초는 70°C, 50% 주정 추출조건 에서 추출 수율과 총플라보노이드 함량, linarin 함량, ABTS 라디칼 소거능과 DPPH 라디칼 소거능, α-glucosidase 저 해 활성, lipase 저해 활성이 가장 높았다.
- 구절초는 열수와 50°C, 30% 주정 추출조건에서 추출 수율이 각각 8.32%, 8.06%로 측정되었으며, 70°C, 50% 주정 추출조건에서 9.18%로 추출 수율이 가장 높았다.
- 5 mg/mL 이상의 농도에서 lipase 저해 활성을 나타낸다고 보고한 바 있다. 구절초는 용매, 온도 등 추출조건에 따라서 lipase 저해 활성을 증가시킬 수 있으며, 이러한 결과를 토대로 구절초가 lipase 저해제의 소재로서 가능성이 있음을 시사하였다.
- 구절초는 70°C, 50% 주정 추출조건 에서 추출 수율과 총플라보노이드 함량, linarin 함량, ABTS 라디칼 소거능과 DPPH 라디칼 소거능, α-glucosidase 저 해 활성, lipase 저해 활성이 가장 높았다. 또한, linarin 함량 이 구절초 추출물의 생리활성과 상관관계가 있음을 확인하였다. 구절초 추출물은 linarin 함량이 증가함에 따라 항산화, 탄수화물 및 지방 흡수 지연 활성을 가지는 것으로 생각 한다.
- 또한, linarin 함량은 α-glucosidase와 lipase 저해 활성과 양의 상관관계를 나타내었는데 상관계수는 각각 0.533(P<0.01), 0.396 (P<0.05)으로 분석되었다.
- 총 폴리페놀과 플라보노이드 모두 주정 농도가 같은 조건일 경우 온도가 높을수록 함량이 더 높게 측정되었으며, 열수 추출물을 제외한 주정 추출물에서는 주정 농도가 50%까지는 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량이 주정 농도에 따라 높아졌으며, 50% 이상에서는 주정 농도가 높아질수록 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 감소하는 경향을 보였다.
후속연구
- Chung과 Jeon(24)은 구절초의 총폴리페놀 및 총플라보노이드 함량과 항산화 활성을 부위별로 측정하여 구절초의 항산화 활성을 입증한 바 있으며, 본 연구에서도 구절초 추출물의 추출조건별 항산화 활성을 확인한 결과 항산화 활성을 가지는 기능성 식품 소재로 사용될 수 있을 것으로 생각한다.
- 본 연구 결과는 구절초 추출 시 추출조건의 변화로 α-glucosidase 저해 활성을 증가시킬 수 있으며, α-glucosidase 저해제의 소재로서 개발될 가능성이 있음을 보여준다.
- 구절초 추출물은 linarin 함량이 증가함에 따라 항산화, 탄수화물 및 지방 흡수 지연 활성을 가지는 것으로 생각 한다. 본 연구를 통하여 구절초의 추출조건에 따른 생리활성 을 확인함으로써 향후 구절초를 이용한 건강기능식품의 소 재 등으로 이용 가능할 것으로 생각한다.
- 본 연구에서 linarin 성분이 다량 함유된 70°C, 50% 주정 추출조건에서 항산화, 탄수화물 및 지방 흡수 지연 활성이 높은 것으로 확인되었고, linarin 함량이 구절초 추출물의 생리활성과 상관관계가 있음을 분석한 바, 추후 건강기능식품 원료로 개발되기 위해서는 linarin 함량을 높이는 추출공정으로 개발하는 것이 적합할 것으로 생각한다.
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