Leuconostoc mesenteroides를 이용한 브로콜리 발효물에 의한 Clostridium difficile의 생육 제어 Growth Inhibition of Clostridium difficile by Fermented Broccoli with Leuconostoc mesenteroides원문보기
본 연구에서는 김치로부터 L. mesenteroides CJNU0041을 분리하여 16S rRNA 염기서열 분석을 통해, 동정하였으며, ${\beta}$-glucosidase 활성이 우수한 것으로 나타났다. L. mesenteroides CJNU0041를 이용한 브로콜리 발효 동안 생균수와 pH 및 ${\beta}$-glucosidase 활성에 대해 분석한 결과, 발효 시간은 48 hours이 적당한 것으로 판단되었다. 또한, 발효 후 생물 전환이 일어남을 HPLC 분석을 통해 확인하였다. 그리고, L. mesenteroides CJNU0041의 브로콜리 발효물에서 C. difficile에 대한 생육 억제 효과를 확인 할 수 있었다. 따라서, 본 연구를 통해 분리된 신규 L. mesenteroides CJNU0041을 C. difficile의 생육 제어를 위한 유산균 제재화가 가능할 것으로 판단되며, 브로콜리 발효물도 다양한 식품에 적용이 가능할 것으로 사료된다.
본 연구에서는 김치로부터 L. mesenteroides CJNU0041을 분리하여 16S rRNA 염기서열 분석을 통해, 동정하였으며, ${\beta}$-glucosidase 활성이 우수한 것으로 나타났다. L. mesenteroides CJNU0041를 이용한 브로콜리 발효 동안 생균수와 pH 및 ${\beta}$-glucosidase 활성에 대해 분석한 결과, 발효 시간은 48 hours이 적당한 것으로 판단되었다. 또한, 발효 후 생물 전환이 일어남을 HPLC 분석을 통해 확인하였다. 그리고, L. mesenteroides CJNU0041의 브로콜리 발효물에서 C. difficile에 대한 생육 억제 효과를 확인 할 수 있었다. 따라서, 본 연구를 통해 분리된 신규 L. mesenteroides CJNU0041을 C. difficile의 생육 제어를 위한 유산균 제재화가 가능할 것으로 판단되며, 브로콜리 발효물도 다양한 식품에 적용이 가능할 것으로 사료된다.
In this study, Leuconostoc mesenteroides CJNU0041 was isolated from Korean traditional food kimchi and antimicrobial activity of fermented broccoli with the isolate was tested against pathogenic Clostridium difficile. L. mesenteroides CJNU0041 showed higher glucosidase activity than other isolates. ...
In this study, Leuconostoc mesenteroides CJNU0041 was isolated from Korean traditional food kimchi and antimicrobial activity of fermented broccoli with the isolate was tested against pathogenic Clostridium difficile. L. mesenteroides CJNU0041 showed higher glucosidase activity than other isolates. As the results of physiological properties such as pH and viable cell count during broccoli fermentation with L. mesenteroides CJNU0041, we confirmed that 48 hours was optimal fermentation time. As the results of metabolite analysis by HPLC, metabolites were changed during the fermentation. Especially, the growth of C. difficile was inhibited by the fermented broccoli. Therefore, L. mesenteroides CJNU0041 might be a candidate for improving the functionality of natural materials by lactic acid fermentation.
In this study, Leuconostoc mesenteroides CJNU0041 was isolated from Korean traditional food kimchi and antimicrobial activity of fermented broccoli with the isolate was tested against pathogenic Clostridium difficile. L. mesenteroides CJNU0041 showed higher glucosidase activity than other isolates. As the results of physiological properties such as pH and viable cell count during broccoli fermentation with L. mesenteroides CJNU0041, we confirmed that 48 hours was optimal fermentation time. As the results of metabolite analysis by HPLC, metabolites were changed during the fermentation. Especially, the growth of C. difficile was inhibited by the fermented broccoli. Therefore, L. mesenteroides CJNU0041 might be a candidate for improving the functionality of natural materials by lactic acid fermentation.
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문제 정의
또한, 최근 다양한 임상 결과를 통해 probiotics와 이것들이 생산하는 bacteriocin 등의 물질들이 다양한 질환들에 대해 예방적 효과와 치료적 효과가 있는 것으로 알려져 있다12,13). 따라서 본 연구에서는 C. difficile의 제어를 위해 김치로부터 신규의 Leuconostoc mesenteroides를 분리하였고, 이를 이용한 브로콜리 발효물을 제조하여 C. difficile 억제에 활용하고자 하였다.
제안 방법
Esculin agar는 0.1% esculin, 0.05% ferric citrate (Sigma-aldrich), 2.5% heart infusion, 1.5% agar (Difco Laboratory)로 제조하였으며, esculin agar에 배양된 유산균들을 1 µL 접종한 후 24 hours, 48 hours 동안 배양하였다.
gov/)의 BLAST search program을 이용하여 DNA database와 비교하였다. 그리고 계통학적 분석은 NCBI에서 제공하는 유산균 표준 균주의 16S rRNA 염기서열과 비교하여 염기서열간의 유연 관계를 EMBL-EBI에서 제공하는 Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)를 사용하여 확인하였다.
1% peptone water에 혼합 하고, stomacher를 이용하여 균질화한 후 10진 희석을 하여 MRS agar에 도말 후 37℃에서 48-72 hours 배양하였다. 그리고 배양된 집락들 중 형태학적으로 상이한 것을 선택하여 MRS agar에 평판 획선하여 배양하여 순수 분리하였다.
그리고, 브로콜리 현탁액과 브로콜리 발효물에 대한 대사산물 변화를 분석하기 위해서 PDA검출기가 구비된 HPLC (YL9100, Younglin, Kyunggi, Korea)를 사용하였으며, 실험 조건은 용매 A는 멸균수, 용매 B는 메탄올을 이용하였다. 그리고, 30℃에서 반응을 진행하였으며, 1 단계는 0~20분에서 용매 A 100%, 2단계에서는 20-75분으로 용매 A 100%에서 용매 B로 농도 기울기를 하였으며, 마지막 3단계에는 75-85분으로 용매 B 100%로 수행한 후 발효물의 조성 차이를 확인하였다.
그리고, C. difficile 배양액이 도말된 배지 위에 브로콜리 현탁액과 브로콜리 발효 농축액을 각각 2 µL 씩 분주한 후 억제환을 확인하여 생육 저해효과를 확인하였다.
그리고, 검정색 환의 생성 정도를 비교하여 β-glucosidase 활성이 우수한 유산균을 확보하여 이를 C. difficile의 항균 활성 검정에 적용하였다.
mesenteroides CJNU0041를 이용한 브로콜리 발효 동안 생균수와 pH 및 β-glucosidase 활성에 대해 분석한 결과, 발효 시간은 48 hours이 적당한 것으로 판단되었다. 또한, 발효 후 생물 전환이 일어남을 HPLC 분석을 통해 확인하였다. 그리고, L.
분리된 유산균 중 β-glucosidase 활성이 우수한 균주를 사용하여 브로콜리 분말 40 g에 800 mL의 증류수를 가해 5% 브로콜리 현탁액을 제조하고, 고압멸균기에서 브로콜리 현탁액을 멸균 처리하였다. 멸균한 브로콜리 현탁액에 0.5%의 분리 유산균 배양액(v/v)을 접종하고 3 L 발효조(Fermentec, Cheongju, Korea)에서 발효시켰으며, 발효되는 공정 중에 브로콜리 추출물에 접종된 균주의 세포 성장 및 pH 변화를 측정하였다. 그리고, 브로콜리 현탁액과 브로콜리 발효물에 대한 대사산물 변화를 분석하기 위해서 PDA검출기가 구비된 HPLC (YL9100, Younglin, Kyunggi, Korea)를 사용하였으며, 실험 조건은 용매 A는 멸균수, 용매 B는 메탄올을 이용하였다.
분리된 유산균 중 β-glucosidase 활성이 우수한 균주를 사용하여 브로콜리 분말 40 g에 800 mL의 증류수를 가해 5% 브로콜리 현탁액을 제조하고, 고압멸균기에서 브로콜리 현탁액을 멸균 처리하였다.
분리된 유산균의 최종적인 동정을 위해 16S rRNA 서열 분석을 수행하였다. 염기 서열은 국내 생명공학회사(Macrogen Co.
브로콜리 발효물을 이용하여 C. difficile에 대한 항균 활성 유무를 확인하였다. 이를 위해 제조된 브로콜리 발효물에서 상등액을 수득하여 상등액을 10배 농축하여 브로콜리 발효 농축액을 제조하였다.
difficile에 대한 항균 활성 유무를 확인하였다. 이를 위해 제조된 브로콜리 발효물에서 상등액을 수득하여 상등액을 10배 농축하여 브로콜리 발효 농축액을 제조하였다. 그리고, C.
대상 데이터
difficile KCTC 5009는 생물자원센터 (KCTC, Jeongeup, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. C. difficile의 배양을 위한 액체 배지로는 Reinforced Clostridial Medium (Difco Laboratory, Detroit, MI, US)를 사용하였으며, 고체배지는 Brucella agar에 hemin과 vitamin K를 첨가하여 사용하였다. 그리고, 유산균의 배양은 0.
5%의 분리 유산균 배양액(v/v)을 접종하고 3 L 발효조(Fermentec, Cheongju, Korea)에서 발효시켰으며, 발효되는 공정 중에 브로콜리 추출물에 접종된 균주의 세포 성장 및 pH 변화를 측정하였다. 그리고, 브로콜리 현탁액과 브로콜리 발효물에 대한 대사산물 변화를 분석하기 위해서 PDA검출기가 구비된 HPLC (YL9100, Younglin, Kyunggi, Korea)를 사용하였으며, 실험 조건은 용매 A는 멸균수, 용매 B는 메탄올을 이용하였다. 그리고, 30℃에서 반응을 진행하였으며, 1 단계는 0~20분에서 용매 A 100%, 2단계에서는 20-75분으로 용매 A 100%에서 용매 B로 농도 기울기를 하였으며, 마지막 3단계에는 75-85분으로 용매 B 100%로 수행한 후 발효물의 조성 차이를 확인하였다.
김치로부터 유산균의 분리를 위해 MRS agar에서 배양된 유백색 집락을 선발하였다.
본 실험에 사용된 C. difficile KCTC 5009는 생물자원센터 (KCTC, Jeongeup, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. C.
분리된 유산균의 최종적인 동정을 위해 16S rRNA 서열 분석을 수행하였다. 염기 서열은 국내 생명공학회사(Macrogen Co. Daejeon, Korea)에 의뢰하여 수행하였다. 16S rRNA 유전자 상동성 분석은 National Center for Biotechnology Information (http://www.
데이터처리
Daejeon, Korea)에 의뢰하여 수행하였다. 16S rRNA 유전자 상동성 분석은 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLAST search program을 이용하여 DNA database와 비교하였다. 그리고 계통학적 분석은 NCBI에서 제공하는 유산균 표준 균주의 16S rRNA 염기서열과 비교하여 염기서열간의 유연 관계를 EMBL-EBI에서 제공하는 Clustal Omega (https://www.
이론/모형
분리된 김치 유산균의 β-glucosidase 활성을 분석하기 위해 Esculin agar법을 통해 확인하였다.
성능/효과
β-glucosidase 활성이 우수했던 CJNU0041의 최종 동정을 위해 16S rRNA 염기 서열에 대해 NCBI의 BLAST 분석 결과 L. mesenteroides와 상동성이 가장 높은 것으로 확인되었으며, 유산균들과의 phylogenetic tree 분석을 수행한 결과 L. mesenteroides와 계통학적으로 가장 유사한 것으로 나타났다(Fig. 2).
C. difficile에 대한 항균 효과를 확인한 결과, L. mesenteroides CJNU0041를 24 hours 배양한 배양 상등액에 의한 C. difficile의 생육 억제 효과가 있는 것으로 나타났다(결과 미제시). 그리고, L.
Esculin agar 상에서 βglucosidase 활성은 분리된 유산균 대부분이 활성을 나타냈지만, 이 중 CJNU0041이 배양 후 12 hours부터 활성을 나타내고 있었으며, 24 hours, 48 hours 후에 활성이 증가되는 것으로 확인되었다.
L.mesenteroides CJNU0041를 이용한 브로콜리 발효 동안 생균수와 pH 및 β-glucosidase 활성에 대해 분석한 결과, 발효 시간은 48 hours이 적당한 것으로 판단되었다.
또한, 발효 후 생물 전환이 일어남을 HPLC 분석을 통해 확인하였다. 그리고, L. mesenteroides CJNU0041의 브로콜리 발효물에서 C. difficile에 대한 생육 억제 효과를 확인 할 수 있었다. 따라서, 본 연구를 통해 분리된 신규 L.
1 log CFU/mL이었다. 그리고, 발효 24 hours 후에는 pH가 약 3.0 수준으로 낮아졌고 생균수가 약 9.0 log CFU/mL 으로 증가하였으나, 48 hours에서는 다시 초기 균수 수준인 6.0 log CFU/mL 수준으로 낮아진 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 일반적으로 L.
mesenteroides CJNU0041을 이용한 브로콜리 발효물의 대사 산물은 상이한 것으로 나타났다. 대체적으로 발효 후에 생물 전환이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 추후 LC/MS/MS 등의 수행을 통해 metabolomics분석을 하여 발효 후에 물질들의 특성과 차이점에 대한 분석이 필요할 것으로 사료된다.
따라서, 발효를 위한 기간은 L. mesenteroides CJNU0041의 생육 정도와 β-glucosidase 활성을 분석했을 때 48 hours 동안 발효가 적정할 것으로 사료된다.
본 연구에서는 김치로부터 L. mesenteroides CJNU0041을 분리하여 16S rRNA 염기서열 분석을 통해, 동정하였으며, β-glucosidase 활성이 우수f한 것으로 나타났다.
분리된 L. mesenteroides CJNU0041을 이용하여 브로콜리 발효하면서 pH의 변화와 생균수를 확인한 결과(결과 미제시), 발효 초기에는 약 pH 5 수준이었으며 생균수는 약 6.1 log CFU/mL이었다. 그리고, 발효 24 hours 후에는 pH가 약 3.
3과 같다. 브로콜리 현탁액과 L. mesenteroides CJNU0041을 이용한 브로콜리 발효물의 대사 산물은 상이한 것으로 나타났다. 대체적으로 발효 후에 생물 전환이 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
4와 같다. 브로콜리가 포함된 현탁액을 접종한 경우 C. difficile에 대한 저해환이 형성되지 않았으며, 반면에 브로콜리 발효액을 접종했을 때는 C. difficile에 대한 억제환이 뚜렷하게 형성된 것을 확인할 수 있어, 브로콜리 발효 농축액이 C. difficile 균주의 생육을 효과적으로 저해한다는 사실을 확인할 수 있었다. 최근 C.
후속연구
그러므로, 본 연구에서 우수한 β-glucosidase 활성을 가지고 있는 CJNU0041을 이용하여 항균활성, 항산화 등의 다양한 생리 활성 기능을 갖는 발효물을 생산할 수 있을 것으로 판단된다.
또한, 활용 가능한 유산균에 대한 보고도 매우 미미한 것으로 판단된다. 따라서 본 연구를 통해 분리된 L. mesenteroides CJNU0041의 C. difficile의 생육 제어를 위한 유산균으로 활용이 가능할 것이며, 또한 L. mesenteroides CJNU0041를 이용한 브로콜리 발효물의 생육 억제 효과는 식품 산업에 적용이 쉽게 가능할 것으로 사료된다.
difficile에 대한 생육 억제 효과를 확인 할 수 있었다. 따라서, 본 연구를 통해 분리된 신규 L.mesenteroides CJNU0041을 C. difficile의 생육 제어를 위한 유산균 제재화가 가능할 것으로 판단되며, 브로콜리 발효물도 다양한 식품에 적용이 가능할 것으로 사료된다.
대체적으로 발효 후에 생물 전환이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 추후 LC/MS/MS 등의 수행을 통해 metabolomics분석을 하여 발효 후에 물질들의 특성과 차이점에 대한 분석이 필요할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
C. difficile의 주요 감염원인은?
C. difficile의 주요 감염원인은 암피실린(ampicillin), 아목시실린(amoxicillin), 세팔로스포린(cephalosporin), 클린다마이신(clindamycin) 등과 같은 광범위한 항생제의 남용에 의한 결과로서, 이와 같은 항생제들은 C. difficile의 과증식을 유도하고, 증식된 C.
Clostridium difficile의 특징은?
Clostridium difficile은 혐기성 그람양성 세균이며 포자를 형성하는 것으로 보고되어 있고, 장내에서 증식하며 다양한 병원성을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 대장 내에서 과증식 할 경우 독소를 생성하면서 급성 대장염 등을 유발시키는 것으로 보고되고 있다1). 국내에서는 1997년대에 위막성 대장염 환자에게서 C.
CDAD를 일으키는 독성 인자는 어떤 것이 있는가?
그리고, C. difficile에 의한 독성 인자로는 대표적으로 장독소(enterotoxin)인 toxin A와 세포독소(cytotoxin)인 toxin B를 생산하는 것으로 보고되고 있다7,8). 최근 이러한 CDAD를 개선 또는 치료하기 위해서 반코마이신(vancomycin), 메트로니다졸(metronidazole) 등과 같은 항생제를 사용하여 일차적으로 치료하고 있으나, 항생제 오·남용으로 인해 C.
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