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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 귀리 유래의 수용성 베타-글루칸의 콜레스테롤개선 및 비만조절에 관련한 작용기전을 규명하기 위하여, 베타-글루칸이 지방산대사 및 콜레스테롤 대사의 상위 대사의 하나인 탄수화물대사에 영향을 미칠 것을 가설로 세우고, 이들 탄수화물의 소화흡수의 조절이 전체적인 칼로리 제한의 주요 요소임을 확인하기 위해 소장 내 융모막에 존재하여 이당류 이상의 탄수화물 흡수에 관여하는 알파-글루코시다아제 효소인 sucrase, maltase, glucoamylase의 활성에 미치는 베타-글루칸의 저해활성을 조사한 결과, 베타-글루칸이 자당의 분해흡수에 관여하는 sucrase를 효과적으로 저해하고, 전분의 소화흡수에 관여하는 malase와 glucoamylase를 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
- 따라서, 본 실험에서는 베타-글루칸이 효과적으로 소장 내 당질분해효소들에 대한 저해활성을 측정하여, 베타-글루칸의 혈당상승억제효능이 고콜레스테롤혈증 및 체중증가 경감을 일으키는 주요 작용기전임을 밝히고자 하였다.
- 따라서, 본 연구에서는 귀리 유래의 수용성 베타-글루칸의 항당뇨 효과를 규명하기 위해 귀리 외피를 열수 추출하고, 효소 처리하여 제조된 수용성 베타-글루칸 분말을 사용하여 랫트 소장 유래의 α-glucosidase inhibition, maltase, sucrase, glucoamylase inhibition 시험과 5주령 Sprague-Dawley(SD) 랫트를 이용하여 in vivo 실험을 통해 당질 분해 효소활성 저해 효과 및 식후 혈당 강하 효능을 조사하고, 약력학 연구를 수행하여 수용성 베타-글루칸의 비만 및 혈당조절 작용기전을 규명하고자 한다.
- 본 연구에서는 혈당상승에 관여하는 α-glucosidases인 sucrase, maltase, glucoamylase에 대한 귀리 베타-글루칸의 저해활성을 조사하였다.
제안 방법
- 50 mL의 5 mM pNPG solution을 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시키고, 405 nm에서 ELISA reader를 사용하여 흡광도를 측정하여 rat α-glcucosidase 저해활성을 분석하였다.
- 사육실의 점등 및 소등 시간은 12시간을 기준으로 실시하였다. 5주령의 SD rat을 8마리씩 1군으로 정하고, 총 24마리 3군으로 나누어 각 군에 전분(starch) 혹은 자당(sucrose)을 2.0 g/kg과 각 군별로 control (증류수), 귀리 베타-글루칸(0.1, 0.5 g/kg-body weight)을 액상 상태로 경구투여하였다. 경구 투여량은 1 mL/100 g-body weight로 하였다.
- 실험조건은 온도 22℃, 습도 50%를 유지하였고, 사육 공간(SPF zone)의 모든 공기는 헤파필터를 통한 공기를 사용하였다. Rat의 식이는 (오리엔트바이오 Pico 5053) 하루에 20~25 g으로 체중 증가에 따라 늘려서 제공하였고, 깔짚(오리엔트바이오 Corncob 1/4)은 이틀에 한 번씩 교체하여 주었다. 사육실의 점등 및 소등 시간은 12시간을 기준으로 실시하였다.
- 100 mL의 rat α-glucosidase solution에 50 mL의 시료를 넣은 다음, 37℃에서 10분간 pre-incubation시켰다. 각각의 시험관에 50 mL의 100 mM maltose, 50 mL의 200 mM sucrose, 1% starch solution을 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 각각의 반응액 50 mL를 glucose oxidase/peroxidase reagent와 o-dianisidine reagent 를 섞은 용액 1 mL를 함유한 시험관에 넣어 37℃에서 10분 동안 2차 반응시킨 후, 각각의 시험관에 12 N 황산을 1 mL 첨가하여 반응을 정지시키고, 540 nm에서 ELISA reader를 사용하여 흡광도를 측정하여 저해활성 분석하였다.
- 따라서 in-vitro에서의 활성평가를 통해 소장 내 α-glucosidase 억제활성을 검증한 귀리 베타-글루칸의 혈당상승억제 여부를 동물모델에서 평가하기 위해 SpragueDawley(SD) rat을 이용하여 귀리 베타-글루칸의 식후 혈당 감소 효과를 측정하였으며, 결과는 Fig. 6 및 7과 같았다.
- 동물모델을 이용한 혈당조절능 시험은 위해서 한남대학교 동물실험윤리위원회의 심의를 통과하여 동물실험 승인 후 수행하였다(승인번호: HNU 2016-03). 실험조건은 온도 22℃, 습도 50%를 유지하였고, 사육 공간(SPF zone)의 모든 공기는 헤파필터를 통한 공기를 사용하였다. Rat의 식이는 (오리엔트바이오 Pico 5053) 하루에 20~25 g으로 체중 증가에 따라 늘려서 제공하였고, 깔짚(오리엔트바이오 Corncob 1/4)은 이틀에 한 번씩 교체하여 주었다.
- , Cary, NC, USA) 프로그램을 사용하여 분석하였다. 이를 통해 베타-글루칸/탄수화물 투여 후 혈중 포도당 최고농도(Cmax), Cmax에 도달하는데 걸리는 시간인 tmax, 혈중포도당의 전신순환에 도달한 총량인 시간곡선 하 면적 (AUCt, Area under the plasma level of glucose-time curve)을 구하였고, 이들 데이터를 활용하여 베타-글루칸 섭취가 혈중포도당농도 변화에 미치는 다양한 영향을 분석하였다.
- 측정 시 rat의 꼬리 끝을 멸균된 메스를 이용하여 절개 후 약 0.5 μL의 혈액을 혈당 스트립에 흡수시켜 혈당측정기(Caresens Ⅱ (주)아이센스)를 사용하여 측정하였다.
- 혈당조절능 시험을 통해 확보한 데이터를 활용하여 베타-글루칸 섭취가 탄수화물의 혈중농도에 미치는 영향을 조사하기 위하여 혈중 포도당의 농도에 대한 약력학적 연구를 수행하였다. 탄수화물과 베타-글루칸을 섭취한 후 시간 별로 구해진 혈중포도당 농도의 변화를 WinNonlin(Version 5.2.1, Pharsight Co., Cary, NC, USA) 프로그램을 사용하여 분석하였다. 이를 통해 베타-글루칸/탄수화물 투여 후 혈중 포도당 최고농도(Cmax), Cmax에 도달하는데 걸리는 시간인 tmax, 혈중포도당의 전신순환에 도달한 총량인 시간곡선 하 면적 (AUCt, Area under the plasma level of glucose-time curve)을 구하였고, 이들 데이터를 활용하여 베타-글루칸 섭취가 혈중포도당농도 변화에 미치는 다양한 영향을 분석하였다.
- 한국식품의약품안전처에서 제시한 건강기능식품의 기능성 시험가이드에 제시된 방법을 변형하여 α-glcucosidase (EC 3.2.1.20) 저해활성을 측정하였다.
- 한국식품의약품안전처에서 제시한 건강기능식품의 기능성 시험가이드에 제시된 방법을 변형하여 sucrase, maltase, glucoamylase의 저해 활성을 분석하였다. 효소는 rat 유래의 intestinal acetone powder를 사용하였고, 기질은 sucrose, maltose, starch를 사용하였다.
- 24시간 절식 시 수분의 공급은 자유롭게 하였다. 혈당 측정 0시간의 경우 경구투여 전 측정을 이행하였고, 30분, 1시간, 2시간으로 측정하였다. 측정 시 rat의 꼬리 끝을 멸균된 메스를 이용하여 절개 후 약 0.
- 경구 투여량은 1 mL/100 g-body weight로 하였다. 혈당 측정은 24시간 절식 후 측정하였다. 24시간 절식 시 수분의 공급은 자유롭게 하였다.
- 혈당조절능 시험을 통해 확보한 데이터를 활용하여 베타-글루칸 섭취가 탄수화물의 혈중농도에 미치는 영향을 조사하기 위하여 혈중 포도당의 농도에 대한 약력학적 연구를 수행하였다. 탄수화물과 베타-글루칸을 섭취한 후 시간 별로 구해진 혈중포도당 농도의 변화를 WinNonlin(Version 5.
대상 데이터
- 9% NaCl 용액에 첨가한 후 30초간 12회 ice water bath에서 sonication하고, 10,000×g, 4℃에서 30분간 원심분리하였다. 분리된 상층액을 실험에 사용하였다. 100 mL의 rat α-glucosidase solution에 50 mL의 시료를 넣은 다음, 37℃에서 10분간 pre-incubation시켰다.
- 효소는 rat 유래의 intestinal acetone powder(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo., U.S.A.)를 사용하였고, 기질은 p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(pNPG)를 사용하였다.
- 한국식품의약품안전처에서 제시한 건강기능식품의 기능성 시험가이드에 제시된 방법을 변형하여 sucrase, maltase, glucoamylase의 저해 활성을 분석하였다. 효소는 rat 유래의 intestinal acetone powder를 사용하였고, 기질은 sucrose, maltose, starch를 사용하였다. Rat intestinal acetone powder 100 mg을 3 mL의 0.
데이터처리
- All parameter were compared between control and treatment groups by unpaired Student’s t-test ( * p<0.05; ** p<0.01; and *** p<0.001).
- 모든 실험결과의 측정치는 mean±S.D.로 나타내었고, 각 평균치 간의 유의성은 SPSS 12(Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램에 의한 Duncan의 다 범위 검정(Duncan's multiple range test)을 통하여 p< 0.05에서 각 시료간의 유의적인 차이를 분석하였고, Student’s t-test로도 분석하였다.
성능/효과
- Table 3에서와같이 포도당의 혈중최고 농도(Cmax)는 귀리 베타-글루칸 0.5 g/kg-body weight를 투여한 군에서 165.64±13.18 (p<0.01)로 Cmax 값이 유의적으로 약 10% 감소하였고, 식후 최고 혈당까지 도달하는 시간(Tmax) 또한 12~44% 유의적으로 지연시킨 것을 알 수 있었다.
- 귀리 베타-글루칸을 starch와 혼합하여 경구 투여 후 0.5~2hrs 동안 혈당을 측정한 결과, 식후 30분에 control군(212.06±35.3) 대비 0.1 g/kg-body weight(175.17±21.29)(p<0.05), 0.5 g/kg-body weight(170.33±14.25 mg/dL)(p<0.01)군에서 농도 의존적으로 약 17~20%의 식후 혈당 상승을 억제하는 것을 알수 있었다.
- 이러한 인비트로 결과를 인비보 동물모델에서 검증하기 위하여 식후혈당상승억제 효능평가 모델을 디자인하여 자당과 전분의 섭취에 따른 식후혈당 상승에 미치는 베타-글루칸의 영향을 조사한 결과, 베타-글루칸 투여군의 경우, 16~20%의 혈중포도당 농도 상승을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 약력학적 연구를 통해 혈중포도당 최고농도(Cmax) 역시 유의적으로 10~23% 감소하며, 소화흡수 지연의 지표인 Tmax의 경우도 유의적으로 약 10~44% 지연시키는 것을 알 수 있었다. 이로써 베타-글루칸의 섭취가 주요 인체섭취 탄수화물인 자당과 전분의 혈중유입을 적절하게 조절함으로써 지속적인 칼로리 제한을 통해 체내로 유입되는 칼로리를 제한할 수 있고, 이러한 탄수화물의 유입차단 기전이 결과적으로 콜레스테롤저하 및 체중저하를 유도할 수 있을 가능성을 보여주는 작용기전이라 사료된다.
- 실험결과, Fig. 1과 2에서 볼 수 있듯이 베타-글루칸은 랫트 소장 유래 α-glucosidase는 농도의존적으로 저해하나, 췌장 유래의 a-amylase는 저해하지 못하는 것을 알 수 있었다.
- 이들 식후 시간 별 혈당상승억제 효과는 약력학적 지표 분석을 수행한 Table 2에서와같이 포도당의 혈중최고 농도(Cmax)는 귀리 베타-글루칸을 투여한 군에서 190.44±13.18(p<0.05)로 Cmax 값이 유의적으로 감소하였고, 식후 최고 혈당까지 도달하는 시간(Tmax) 또한 30~40% 유의적으로 지연시킨 것을 알 수 있었다.
- 05)로 Cmax 값이 유의적으로 감소하였고, 식후 최고 혈당까지 도달하는 시간(Tmax) 또한 30~40% 유의적으로 지연시킨 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 랫트 소장 내 탄수화물 분해 효소저해 활성이 검증된 베타-글루칸의 섭취가 동물모델에서도 유효하게 랫트 소장 내 탄수화물분해효소를 저해하여 효과적으로 혈당을 낮추고, 탄수화물의 소화흡수를 적절하게 지연시킨 것을 의미한다.
- 4와 5에서 같이 maltase와 glucoamylase에 대해서는 농도의존적 저해활성을 보였다. 이러한 결과는, 베타-글루칸이 a-amylase에 의한 전분의 맥아당으로의 분해는 저해하지 못하나, 분해된 맥아당이 소장 융모막에 존재하는 maltase에 의한 포도당으로의 분해는 저해할 수 있을 가능성을 유추할 수 있었으며(Fig. 2, 4), 또한 glucoamylase에 의한 전분으로부터 포도당의 유리작용은 억제할 수 있음도 알 수 있었다(Fig. 5). 이러한 결과 및 예측은 동물실험을 통해 증명될 수 있을 것으로 사료된다.
- 01)로 Cmax 값이 유의적으로 약 10% 감소하였고, 식후 최고 혈당까지 도달하는 시간(Tmax) 또한 12~44% 유의적으로 지연시킨 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통해 전분 섭취 후 혈당감소 및 흡수지연 효과와 유사하게 자당섭취에서도 효과적으로 혈당의 흡수를 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
- 이러한 인비트로 결과를 인비보 동물모델에서 검증하기 위하여 식후혈당상승억제 효능평가 모델을 디자인하여 자당과 전분의 섭취에 따른 식후혈당 상승에 미치는 베타-글루칸의 영향을 조사한 결과, 베타-글루칸 투여군의 경우, 16~20%의 혈중포도당 농도 상승을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 약력학적 연구를 통해 혈중포도당 최고농도(Cmax) 역시 유의적으로 10~23% 감소하며, 소화흡수 지연의 지표인 Tmax의 경우도 유의적으로 약 10~44% 지연시키는 것을 알 수 있었다.
- 이상의 결과로 귀리 베타-글루칸의 작용기전은 탄수화물과 함께 섭취 시, 소장 내 탄수화물분해효소의 저해를 유발하며, 이를 통해 식후의 급격한 혈당 상승을 억제하는 것임을 확인할 수 있었고, 이러한 작용기전은 탄수화물의 흡수 저해로 인한 칼로리 제한(Calorie restriction)을 통해 이어지는 지방 합성 대사 감소 및 고콜레스테롤혈증 증상완화에 도움을 줄 수 있음을 시사하는 것이다.
- 저해활성이 확인된 α-glucosidase 효소들에 대하여 보다 특이적으로 저해하는 기전을 확인하기 위하여 Fig. 3~5와 같이 sucrase, maltase, glucoamylase에 대한 효소특이적 저해활성을 검토한 결과, 세 가지 효소 모두에 대하여 베타-글루칸은 농도의존적으로 저해하는 것을 알 수 있었다.
- 한편 귀리 베타-글루칸을 sucrose와 혼합하여 경구 투여 후 0.5~2 hrs 동안 혈당을 측정하였고, 그 결과, 식후 1시간에 Control 군(182.58±15.01 mg/dL) 대비 0.5 g/kg-body weight 투여군(154.67±11.16 mg/dL)(p<0.01)에서 농도 의존적으로 약 16%의 식후 혈당 상승을 억제하는 것을 알 수 있었다.
후속연구
- 5). 이러한 결과 및 예측은 동물실험을 통해 증명될 수 있을 것으로 사료된다.
- 83 mg/mL로 가장 우수한 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 베타-글루칸이 시판되는 대다수의 식품에서 선호하는 자당으로 인한 혈당상승억제에 도움을 줄 수 있을 것을 의미하며, 이는 추후 인체임상시험을 통해 증명될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이로써 베타-글루칸의 섭취가 주요 인체섭취 탄수화물인 자당과 전분의 혈중유입을 적절하게 조절함으로써 지속적인 칼로리 제한을 통해 체내로 유입되는 칼로리를 제한할 수 있고, 이러한 탄수화물의 유입차단 기전이 결과적으로 콜레스테롤저하 및 체중저하를 유도할 수 있을 가능성을 보여주는 작용기전이라 사료된다. 추후 인체임상 시험을 통해 베타-글루칸의 체중 및 콜레스테롤조절 효능을 검증하는 것이 필요하며, 이러한 작용기전이 적절하게 적용되었을 경우, 베타-글루칸은 식후 탄수화물의 소화흡수를 억제하여 혈당조절 및 칼로리 제한이 가능하고, 이러한 초기단계에서 칼로리 흡수 조절이 장기적으로 체중 및 콜레스테롤 조절에 유효할 것이라 사료된다.
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