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문제 정의
- 여주는 다양한 생리 효능을 지니고 있으나 아직 우리나라의 경우 여주 관련 연구와 소비는 적은 수준이다. 따라서 본 연구에서는 여주 분말을 첨가하여 간장을 제조하고 항산화 및 항당뇨 효과를 측정함으로써 기능성 식품 개발과함께 여주 이용성 증대를 위해 실시하였다.
가설 설정
- 2)ND, not detected.
제안 방법
- Forest Hill, Vic, Australia)을 이용하여 분석하였다. 0.2% 초산 함유 HPLC water(A 용매)와 0.2% 초산 함유 HPLC acetonitrile(B 용매)를 사용하였고 40분으로 60-100% linear gradient한 것은 30℃에서1 mL/min의 흐름률을 적용하였다. 시료는 20 μL로 주입하였고 UV 검출기(Agilent 1200 series, Agilent Co.
- DPPH 및 ABTS의 음성대조구는 시료 대신 증류수를 사용하였고·OH 라디칼 소거능의 음성 대조구는 PBS 완충액(NaCl 8.76g, NaH2PO3 0.11 g, Na2HPO3 0.596 g)을 사용하여 시료첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도의 차이를 백분율(%)로 나타내었다.
- Phenolic acid 함량 분석은 XTerraTM RP C8 칼럼(4.6×250mm, 5 μm, Waters Corp., Milford, MA, USA)과 HPLC(Agilent 1200 series, Agilent Co. Forest Hill, Vic, Australia)을 이용하여 분석하였다.
- 시료는 20 μL를 주입하였으며, 이동상 속도는 30℃에서 1 mL/min으로 유지하였다. 검출기는 diode arraydetector(DAD)를 사용하여 UV 254 nm에서 검출하였다.
- 농축 후 건조물에 대하여 pH 2.2 lithium buffer 2 mL씩 첨가하여 용해후 0.45 μm membrane filter로 여과시킨 것을 아미노산 자동분석기로 분석하였다.
- 본 연구는 여주 분말 첨가 간장의 기능성 화합물인 phenolic acid(p-hydrobenzoic acid)와 이소플라본(daidzein 및 genistein) 함량 및 항산화 효과를 측정하였다. 여주 분말 10% 첨가 간장의 pH 변화는 5.
- 분석에 사용된 칼럼은 Lichrophore 100 RP C18 column(4.6×250 mm, 5 μm, Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하였고 이동상 용매는 0.2% 초산이 함유된 HPLC water (solution A)와 0.2% 초산이 함유된 acetonitrile(solution B)로분석하였다.
- 콩은 정선 및 수세하여 12시간 수침한 후 물기를 제거하고 121℃에서 1시간 증자 처리를 하였다. 상온(15-25℃)으로 식힌 후 미리 배양해둔 Bacillus subtilis CSY191(16) 균주 배양액을 2.5% 접종하여 3일간 청국장을 띄운 후 55℃에서 2-3일간 건조하여 분말 형태로 제조하였다. 한편 청국장 분말과 소맥 코오지 분말은 15% 염수에 용해시킨 후 여주 첨가량은 간장 총 부피에 무첨가(대조구)와 5% 그리고 10%에 해당하는 양을 분말 형태로 첨가하여 여주 간장을 제조하였다.
- 소맥 코오지는 밀가루 3 kg에 Aspergillus oryzae 현탁액을 골고루 분사시켜 가며 반죽한 후 사각형 틀에 얇게 피고 25℃에서 48시간 배양하고 55℃에서 48시간 건조 및 분쇄시켜 제조하였다. 콩은 정선 및 수세하여 12시간 수침한 후 물기를 제거하고 121℃에서 1시간 증자 처리를 하였다.
- 시료는 20 μL로 주입하였고 UV 검출기(Agilent 1200 series, Agilent Co.)의 280nm에서 측정하였다.
- 3까지 중화시킨 후 젖산양으로 환산하였다. 염도는 적당히 희석한 간장을 염도계(Atoga ES-421, Atago Co., Tokyo, Japan)로 측정하였다. 한편 각각의 미생물 배양과 생균수 확인은 고초균의 경우 tryptic soy broth/agar(TSB/TSA) 배지를 사용하였고 효모는 chloramphenicol이 함유된 potato dextrose broth/agar(PDB/PDA) 배지를 사용하였으며 생균수 확인은 평판 도말법으로 도말한 후 30℃에서 48시간 배양한 후 30-300개 사이의 집락수를 선정 및 계수하여 log CFU/mL로 나타내었다.
- 이 반응물에 100 mM Na2CO3 750 μL를 첨가하여 반응을 정지시키고 420 nm에서 흡광도를 측정하고 저해율을 계산하였다.
- 5 mL를 첨가하여 3분간 정치시켰다. 이어서 2 N Folin-Ciocalteu phenol 시약 0.25 mL를 첨가하여 혼합한 다음 상온에서 1시간 동안 발색시키고 750 nm에서 분광광도계(Spectronic 2D, Thermo Co., Califonia, CL, USA)를 이용하여 측정하였다.
- , Tokyo, Japan)로 측정하였다. 한편 각각의 미생물 배양과 생균수 확인은 고초균의 경우 tryptic soy broth/agar(TSB/TSA) 배지를 사용하였고 효모는 chloramphenicol이 함유된 potato dextrose broth/agar(PDB/PDA) 배지를 사용하였으며 생균수 확인은 평판 도말법으로 도말한 후 30℃에서 48시간 배양한 후 30-300개 사이의 집락수를 선정 및 계수하여 log CFU/mL로 나타내었다.
- 5% 접종하여 3일간 청국장을 띄운 후 55℃에서 2-3일간 건조하여 분말 형태로 제조하였다. 한편 청국장 분말과 소맥 코오지 분말은 15% 염수에 용해시킨 후 여주 첨가량은 간장 총 부피에 무첨가(대조구)와 5% 그리고 10%에 해당하는 양을 분말 형태로 첨가하여 여주 간장을 제조하였다. 제조된 여주 간장은 총 90일간 상온에서 보관하며 본 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- Isoflavone 비배당체(daidzein, glycitein 및 genistein) 역시 Sigma-Aldrich사에서 구입하였고 Folin-Cicalteuphenol, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), potassium ferricyanide, trichloroacetic acid(TCA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTs), 2,4,6-tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazine(TPTZ), 2-thiobarbituric acid, trichloroacetic acid, 2-deoxyribose, ρ-nitrophenyl-α-Dglucopyranoside(NPG), α-glucosidase(Type I : from Bakers Yeast) 또한 Sigma-Aldrich사에서 구입하여 사용하였다.
- Phenolic acid 표준품(gallic acid, chlorogenic acid, p-hydrolbenzoic acid,protocatechuic acid, vanillic acid, veratric acid 및 t-cinnamic acid(t-CnA))은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- 간장 제조에 사용된 콩은 함양군 농협가공사업소에서 장류용 노란콩을 구입하여 사용하였으며 여주는 경상남도 함양군 소재 천령식품에서 건조분말 형태로 공급받아 사용하였다. 소맥 코오지 제조에 사용한 밀가루는 경상남도 진주시 대형마트에서 구입하여 사용하였다.
- 간장 제조에 사용된 콩은 함양군 농협가공사업소에서 장류용 노란콩을 구입하여 사용하였으며 여주는 경상남도 함양군 소재 천령식품에서 건조분말 형태로 공급받아 사용하였다. 소맥 코오지 제조에 사용한 밀가루는 경상남도 진주시 대형마트에서 구입하여 사용하였다. Phenolic acid 표준품(gallic acid, chlorogenic acid, p-hydrolbenzoic acid,protocatechuic acid, vanillic acid, veratric acid 및 t-cinnamic acid(t-CnA))은 Sigma-Aldrich사(St.
- Isoflavone 비배당체(daidzein, glycitein 및 genistein) 역시 Sigma-Aldrich사에서 구입하였고 Folin-Cicalteuphenol, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), potassium ferricyanide, trichloroacetic acid(TCA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTs), 2,4,6-tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazine(TPTZ), 2-thiobarbituric acid, trichloroacetic acid, 2-deoxyribose, ρ-nitrophenyl-α-Dglucopyranoside(NPG), α-glucosidase(Type I : from Bakers Yeast) 또한 Sigma-Aldrich사에서 구입하여 사용하였다. 한편 배당체(daidzin, glycitin 및 genistin)는 Indofine사(Hillsborough, NJ, USA)에서 구입하여 본 연구에 사용하였다.
데이터처리
- 2)All values within a column with different superscript letters are significantly different from each other at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- 3)All values within a column with different superscript letters are significantly different from each other at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- All values within a column with different superscript letters are significantly different from each other at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- 실험 결과는 SPSS 12.0 package를 사용하여 분산 분석을 수행하였고 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- Isoflavone 함량 분석은 Cho 등(17)의 방법에 따라 High performance liquid chromatography(HPLC, Agilent 1200 series, Agilent Co., Forest Hill, Vic, Australia)로 분석하였다. 분석에 사용된 칼럼은 Lichrophore 100 RP C18 column(4.
성능/효과
- 67 mg/100 mL가 검출되었다. 90일째 역시 비필수 아미노산 총 함량이 여주 첨가량에 비례적으로 여주를 첨가하지 않은 간장의 경우 11,239.62 mg/100 mL로 증가하였고 여주 5.0% 첨가 간장은 14,006.49 mg/100 mL, 여주 10% 첨가 간장은 19,229.86 mg/100 mL로 가장 크게 증가하였다.Glutamic acid(GA)는 모든 간장에서 가장 많은 양을 차지하고 있었으며 90일째 여주를 첨가하지 않은 간장은 1,341.
- ABTS 라디칼 소거활성 역시 여주 첨가량에 따라 증가하였고 여주를 첨가하지 않은 간장은 68.97% → 95.63%의 라디칼 소거활성을보였고 5% 및 10% 첨가 간장은 각각 71.76% → 96.42%및 75.76% → 97.27%의 소거활성을 나타내었다(Fig. 2B).
- Glutamic acid(GA)는 모든 간장에서 가장 많은 양을 차지하고 있었으며 90일째 여주를 첨가하지 않은 간장은 1,341.33→ 4,094.78 mg/100 mL로 증가하였다.
- 2B). Hydroxyl 라디칼 소거활성 및 FRAP 환원력 역시 10% 첨가 여주 간장이 90일째 가장 우수하였으며 각각 59.47%와 1.98의 환원력을 나타내었다(Fig. 2C-D).
- 간장 담금 직후에는 여주를 첨가하지 않은 간장의 경우 1.84 mg/mL를 나타내었고 5% 첨가 시에는 2.99mg/mL, 10% 첨가 시에는 3.76 mg/mL로 여주 첨가량이높을수록 함량 또한 높았으며 이는 본 연구의 phenolic acid 결과와 완벽히 일치하는 경향을 나타내었다(Fig. 1).
- Pratt 등(25)과 Seo와 Morr(26)는 본 연구에서 검출되었던 vanillic acid나 p-hydrobenzoic acid와 같은 여러 phenolics 화합물들은 일반적으로 원료 콩에서는 매우 적은 양만이 존재한다 하였으며 Boo 등(27)은 품종별 여주의 phenolics 함량을 측정한 결과 한국 재래종이 가장 많은 양을 함유한다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서 phenolic acid 증가 현상은 본래 여주가 함유하고 있는 것에 기인하여 phenolics 화합물들이 90일째에 점차적으로 증가한 것으로 판단된다.
- 또한 90일째 여주를 첨가하지 않은 간장의 경우 gallic acid 함량은 140.88 μg이었고 5% 첨가 시 141.24 μg, 10% 첨가 시 150.55 μg을 나타내었으며 전체적으로 여주 분말 첨가량이 많을수록 gallic acid를 포함한 대부분의 phenolic acids 함량이 90일째에 증가하는 경향을 나타내었다(Table 3).
- 전체적인 결과로는 DPPH 라디칼 소거활성과 경향이 일치하는 것으로 나타났으며 여주 첨가량이 높을수록 초기 탄수화물 저해활성이 증가하였다. 또한 90일째에는 탄수화물 저해활성이 더욱 증가하여 여주를 첨가하지 않은 경우 68.51%의 비교적 우수한 활성을 나타내었고 5% 첨가 시에는 76.62%를 보였고 10% 첨가 시에는 79.96%로 가장 우수한 혈당 강화 효과를보였다(Fig. 3).
- 여주 첨가 간장은 공통적으로 urea가 검출되지 않았다. 비필수 아미노산은 여주 첨가량이 높을수록 총 함량 역시 증가하는 것으로 나타났다. 여주를 첨가하지 않은 간장의 경우에는 4,156.
- 여주 간장의 isoflavone 함량 분석 결과 배당체(daidzin,glycitin, genistin)와 비배당체(daidzein, glycitein, genistein)형태의 6종류의 isoflavone이 검출되었다(Table 4). 여주 첨가 간장은 공통적으로 여주 첨가량이 높을수록 초기 배당체총 함량은 낮은 것으로 나타났고 90일째 모두 감소하는 것으로 나타났다.
- 본 연구는 여주 분말 첨가 간장의 기능성 화합물인 phenolic acid(p-hydrobenzoic acid)와 이소플라본(daidzein 및 genistein) 함량 및 항산화 효과를 측정하였다. 여주 분말 10% 첨가 간장의 pH 변화는 5.83(0% BMP), 5.47(5% BMP) 및 5.32(10% BMP)에서 5.28, 5.36 및 5.16으로 감소하였고, 총산은 반대로 0.06%, 0.07% 및 0.09%에서 0.30%, 0.28% 및 0.36%로 증가하였다. 한편 염도는 감소하였고, Bacillus와 효모의 생균수는 증가하였다.
- 한편 염도는 감소하였고, Bacillus와 효모의 생균수는 증가하였다. 여주 분말 첨가 간장은 모두 공통적으로 90일째 isoflavone 배당체 형태가 감소하는 반면, total phenolics 및 isoflavone 비배당체 함량과 phenolic acid 함량, 항산화 활성 및 탄수화물 분해효소 저해활성은 증가하였다. 특히 10% 여주 분말 첨가 간장의 경우 glutamic acid(GA, 9,876.
- 여주 간장의 isoflavone 함량 분석 결과 배당체(daidzin,glycitin, genistin)와 비배당체(daidzein, glycitein, genistein)형태의 6종류의 isoflavone이 검출되었다(Table 4). 여주 첨가 간장은 공통적으로 여주 첨가량이 높을수록 초기 배당체총 함량은 낮은 것으로 나타났고 90일째 모두 감소하는 것으로 나타났다. 여주를 첨가하지 않은 간장의 경우 초기 배당체 총 함량은 80.
- 여주분말 함유 간장의 phenolic acid 함량 변화는 Table3에 나타낸 바와 같았다. 여주분말 함유 간장에서는 모두 7종류의 화합물인 gallic acid, protocatechuic acid,p-hydrobenzoic acid, chlorgenic acid, vanillic acid, vetaric acid, 및 t-cinnamic acid가 검출되었다. 또한 vanillic acid를 제외한 나머지 phenolic acid 화합물들은 모두 90일째에 증가한 것으로 나타났다.
- 36%로 산도가 가장 높게 측정되어졌으나 큰 차이는 없었다. 염도는 전체적으로 90일째 조금씩 감소하는 경향을 나타내었고 10%(11.39%), 0%(11.06%), 5%(10.95%) 첨가 순으로 염도가 높은 것으로 나타났다. 한편 간장의 생균수 변화는 여주분말 첨가량에 따른 큰 차이는 보이지 않았고 대체적으로 90일째 증가하는 결과를 나타내었다(Table 1).
- 한편 Park 등(46)은 여주 발효 추출물은 항당뇨활성을 나타내었으나 여주 열수 추출물(339 mg/dL) 또는 여주 에탄올 추출물(329 mg/dL)의 경우에는 명백한 혈당강화 효과를 나타내지 않는다고 보고하였다. 이러한 결과는 발효 과정에서 항당뇨 기능을 가지는 물질, 즉 charantin 또는 momordicin등의 유효성분이 증가된 결과로 추측하였다. 따라서 본 연구 역시 여주에 함유된 charantin 또는 momordicin 물질 함량에 의해 α-glucosidase 저해활성을 보인 것으로 사료되며 향후 연구에서는 여주 유효성분 변화 확인과 같은 연구가 추가적으로 필요할 것으로 판단된다.
- 이러한 결과로 α-glucosidase 저해활성은 90일간의 숙성과정 중 생성된 phenolics 화합물 또는 비배당체 isoflavone인 daidzein과 genistein 화합물 함량과 높은 상관관계가 있는것으로 판단된다.
- 3에 나타낸 바와 같았다. 전체적인 결과로는 DPPH 라디칼 소거활성과 경향이 일치하는 것으로 나타났으며 여주 첨가량이 높을수록 초기 탄수화물 저해활성이 증가하였다. 또한 90일째에는 탄수화물 저해활성이 더욱 증가하여 여주를 첨가하지 않은 경우 68.
- Park 등(46)의 당뇨유발 모델을 이용한 연구에서는 여주발효 추출물의 항당뇨 효능을 보고하였다. 좀 더 상세한 결과로는 당뇨모델 마우스의 혈당 수치는 317 mg/dL였으며 유산균발효 여주 추출물 식이 후에는 183 mg/dL로 뚜렷한 혈당강화 효과를 나타내었다. 또한 Moon 등(47)은 70℃에서 70%주정으로 추출한 여주 추출물의 경우 81.
- 즉, 여주를 첨가한 간장 모두 배당체 함량이 감소함에 따라 비배당체 함량이 크게 증가하였으며 total isoflavone 함량 역시 증가하는 결과를 나타내었고 여주를 첨가하지 않은 간장의 total isoflavone 함량이 216.92 μg/mL로 가장 높았다.
- 한편 10% 여주 분말 첨가 간장은 90일째 항산화 활성(DPPH, ABTS, ·OH 라디칼 소거활성 및 FRAP 환원력)과 α-glucosidase 저해율은 각각 96.07%, 97.27%, 59.47%, 1.98, 및 79.96%로 아주 우수한 활성을 나타내었다.
- 33을 나타내었다. 한편 pH감소에 비례하여 산도는 조금씩 증가하였고 10% 여주 간장이 0.36%로 산도가 가장 높게 측정되어졌으나 큰 차이는 없었다. 염도는 전체적으로 90일째 조금씩 감소하는 경향을 나타내었고 10%(11.
- 95%) 첨가 순으로 염도가 높은 것으로 나타났다. 한편 간장의 생균수 변화는 여주분말 첨가량에 따른 큰 차이는 보이지 않았고 대체적으로 90일째 증가하는 결과를 나타내었다(Table 1).
- 한편 초기와 90일째까지 가장 함량이 높았던 p-hydrobenzoic acid는 주요 phenolic acid 화합물인 것으로 나타났으며 여주 첨가량이 많을수록 즉, 0%(334.76μg → 793.68 μg), 5%(398.67 μg → 909.04 μg), 10%(443.31μg → 1027.65 μg)로 첨가량이 높아질수록 초기 함량도 많았으며 90일째에도 많은 것으로 나타났다.
후속연구
- 이러한 결과로 α-glucosidase 저해활성은 90일간의 숙성과정 중 생성된 phenolics 화합물 또는 비배당체 isoflavone인 daidzein과 genistein 화합물 함량과 높은 상관관계가 있는것으로 판단된다. 그러므로 본 연구의 여주 분말 첨가 간장은 향상된 항산화 활성을 가지는 동시에 유용성분(phenolicacid 및 비배당체 isoflavone, 유리아미노산 등) 증대와 탄수화물 분해효소 저해활성 또한 있으므로 여러 기능성을 포함한 식품으로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.
- 따라서 본 연구 역시 여주에 함유된 charantin 또는 momordicin 물질 함량에 의해 α-glucosidase 저해활성을 보인 것으로 사료되며 향후 연구에서는 여주 유효성분 변화 확인과 같은 연구가 추가적으로 필요할 것으로 판단된다.
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