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문제 정의
- 본 연구에서는 그라비올라 잎에 존재하는 생리활성 물질을 효과적으로 이용하기 위한 구체적인 연구로 그라비올라 잎에 존재하는 생리활성물질의 소재 개발을 위하여, 그라비올라 잎을 용매별로 추출하여 총 페놀성 화합물 함량 및 in vitro 실험계에서의 항산화 효과에 대하여 검토하였다.
제안 방법
- β-Carotene linoleate system을 이용한 항산화 효과의 측정은 Mattaus 의 방법[18]을 변형하여 측정하였다.
- 0.1% (w/v) 시료 용액에 5% NaNO2 용액 및 10% AlCl3·6H2O를 잘 혼합하여 반응시킨 용액을 spectrophotometer (Hitachi U-2900)의 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 각 용매별 추출물을 각 0.01%, 0.05% 및 0.10%의 농도로 만든 시료에서 α,α'-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging 활성을 528 nm에서 흡광도를 측정하여 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도차를 아래의 식에 넣어 백분율(%)로 표시하였다.
- 불포화 지방산인 linoleic acid를 이용하여 그라비올라 잎의 용매별 추출물과 함께 일주일동안 일정한 온도로 저장하여, 이 과정에서 나타나는 지질과산화를 TBA법으로 용매별 추출물의 항산화 활성을 측정한 결과를 나타내었다(Fig. 3). 반응 7일째에 대조구에 대한 상대 활성으로 나타낸 결과는 농도 의존적으로 농도가 높을수록 높은 항산화 활성을 보였으며, 수용성 추출물 1.
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시료의 추출 및 수율
수용성 추출물을 얻기 위하여 그라비올라 잎 분말 100 g을 각각 취해 10배의 정제수를 가한 후 37℃ 항온수조에서 3시간씩 교반 하면서 3회 반복 추출하였고, 95% 에탄올, 95% 메탄올 용매를 수용성 추출물과 동일한 방법으로 추출하였다. 추출액을 모아 여과지(Toyo 2A; Toyo Roshi, Tokyo, Japan)로 여과시켜 얻은 여과액을 감압 농축(Buchi Rotavapor R-215, Flawil, Switzerland)하여 각각의 용매를 제거 시켜 동결건조(Eyela FUD-2100, Tokyo Rikakikai Co.
- 이 때 함량은 tannic acid를 일정 농도(0-500 μg/ml)로 하여 시료와 동일한 방법으로 측정한 표준곡선으로부터 계산하였다.
- 이 때 함량은 표준 물질로서 (+)-catechin hydrate을 일정 농도(20-200 μg/ml)로 시료와 동일한 방법으로 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.
- 5 mM ethanolic neocuprorine solution 및 1 M NH4OAc buffer를 혼합하여 상온에서 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 환원력 비교를 위하여 기존에 항산화제로 많이 사용되고 있는 천연 항산화제 ascorbic acid와 합성 항산화제 BHT를 각각 시료와 동일 농도로 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다. 환원력은 시료 반응액에서 흡광도가 증가된 만큼 강한 환원력을 나타내어 준다.
- 10%의 농도로 만든 시료에서 α,α'-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging 활성을 528 nm에서 흡광도를 측정하여 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도차를 아래의 식에 넣어 백분율(%)로 표시하였다. 이때 활성 비교는 합성 항산화제 butylated hydroxytoluene(BHT)를 0.05% 농도로 첨가하여 시료와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다.
- 미네랄 함량은 AOAC 분석 방법[1]에 준하여 측정하였다. 즉, 그라비올라 잎 건조 분말 1 g을 정확히 취해 550℃에서 3시간 회화 시킨 후 6 N HCl에 용해시켜 완전히 산분해시켜 수욕상에서 산을 완전히 제거하고, 이 건조물에 3 N HCl를 가하여 여과한 후 원소 종류에 따라 각각 일정비율로 희석하여 원자 흡광 분광광도계(AAnalyst 300, Perkin Elmer, Norwalk CT, U.S.A.)를 이용하여 측정하였다.
- 수용성 추출물을 얻기 위하여 그라비올라 잎 분말 100 g을 각각 취해 10배의 정제수를 가한 후 37℃ 항온수조에서 3시간씩 교반 하면서 3회 반복 추출하였고, 95% 에탄올, 95% 메탄올 용매를 수용성 추출물과 동일한 방법으로 추출하였다. 추출액을 모아 여과지(Toyo 2A; Toyo Roshi, Tokyo, Japan)로 여과시켜 얻은 여과액을 감압 농축(Buchi Rotavapor R-215, Flawil, Switzerland)하여 각각의 용매를 제거 시켜 동결건조(Eyela FUD-2100, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)하여 추출 수율(%)을 구하였다.
- 50% ferric chloride (FeCl3)를 혼합한 후 실온에서 반응 시켜 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 한편, Cu-환원력 측정 또한 각 용매별 추출물 0.01%, 0.05%, 0.10%, 0.50% 및 1.00%의 시료 용액에 0.01 M CuCl2, 7.5 mM ethanolic neocuprorine solution 및 1 M NH4OAc buffer를 혼합하여 상온에서 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 환원력 비교를 위하여 기존에 항산화제로 많이 사용되고 있는 천연 항산화제 ascorbic acid와 합성 항산화제 BHT를 각각 시료와 동일 농도로 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- , Ltd.(2015년)에서 제공받아 사용하였다. 그라비올라 잎은 음건한 후, 분쇄기로 분말화하여 실험에 사용하였다.
- (2015년)에서 제공받아 사용하였다. 그라비올라 잎은 음건한 후, 분쇄기로 분말화하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험으로부터 얻어진 결과치는 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차(mean ± SE)로 표시하였고, 각 실험군 간의 유의성 검증은 Duncan’s multiple range test로 나타내었다[9].
이론/모형
- 3. Antioxidant activities of water (W), ethanol (E), methanol (M) extracts from Annona muricata (Graviola) leaf on linoleic acid oxidation as measured by ferric TBA method. BHT : butylated hydroxytoluene (0.
- 2. Antioxidant activities of water (W), ethanol (E), methanol (M) extracts from Annona muricata (Graviola) leaf on lipid peroxidation using rat liver homogenate as measured by TBARS method. BHT : butylated hydroxytoluene(0.
- Fe-환원력 측정은 Zhu 등의 방법[24]에 따라 각 용매별 추출물 0.01%, 0.05%, 0.10%, 0.50% 및 1.00%의 시료 용액에 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.6) 및 1%(w/v) potassium ferricyanide [K3Fe(CN)6]를 혼합하여 50℃에서 반응 시키고 10% trichloroacetic acid (w/v) 상층액에 증류수 및 0.50% ferric chloride (FeCl3)를 혼합한 후 실온에서 반응 시켜 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 한편, Cu-환원력 측정 또한 각 용매별 추출물 0.
- Flavonoid 함량은 Jia 등의 방법[10]에 따라 측정하였다. 0.
- 간 microsome 분획을 이용한 지질 과산화 억제 활성은 Wong 등의 방법[21]에 따라 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 간 microsome 분획(1 ml 중 1 mg의 단백질 함유), 0.1 mM ascorbate와 5 mM FeSO4 반응액을 잘 혼합한 후 37℃에서 반응 시켜 과산화를 유도시켰다. 대조구는 시료를 첨가하지 않고 위와 동일한 방법으로 실시하였다.
- 미네랄 함량은 AOAC 분석 방법[1]에 준하여 측정하였다. 즉, 그라비올라 잎 건조 분말 1 g을 정확히 취해 550℃에서 3시간 회화 시킨 후 6 N HCl에 용해시켜 완전히 산분해시켜 수욕상에서 산을 완전히 제거하고, 이 건조물에 3 N HCl를 가하여 여과한 후 원소 종류에 따라 각각 일정비율로 희석하여 원자 흡광 분광광도계(AAnalyst 300, Perkin Elmer, Norwalk CT, U.
- 페놀성 화합물의 함량은 각 용매별 추출물 시료에 Folinciocalteu's phenol reagent를 이용한 Folin-Denis법[21]으로 비색시켜 spectrophotometer (Hitachi U-2900, Tokyo, Japan)의 760 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 항산화 활성 측정은 Blois 방법[4]에 따라 측정하였다. 각 용매별 추출물을 각 0.
성능/효과
- 43 mg/100 g으로 나타났으며, 메탄올 추출물에서 가장 높은 결과를 나타내었다. Flavonoid 함량은 수용성 추출물 181.27 mg/100 g, 에탄올 추출물 330.38 mg/100 g, 메탄올 추출물 315.86 mg/100 g의 함량을 나타내었고, 에탄올 추출물 및 메탄올 추출물은 수용성 추출물보다 높은 함량을 나타내었다(Table 1).
- 1과 같다. 각 용매별 추출물의 DPPH radical 소거 활성을 측정한 결과, 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가하는 결과를 나타내었다. 에탄올 추출물 0.
- 환원력의 세기가 높을수록 항산화 활성이 높다는 것을 나타낸다[2]. 각 용매별 추출물의 Fe-환원력은 수용성 추출물, 에탄올 추출물, 메탄올 추출물 각 1.00%에서 동일한 결과를 나타내었으나, 메탄올 추출물 0.10%에서 1.69로 에탄올 추출물 0.10%와 수용성 추출물 0.10%의 1.51, 1.03 보다 높은 결과를 나타내었다(Table 3). 반면, 각 용매별 추출물의 Cu-환원력은 수용성 추출물 1.
- 이 free radical에 의한 과산화반응은 전반적으로 세포독성을 초래하여 노화현상, 염증 및 암 등 여러 질환의 원인이 될 수 있다[15]. 과산화물 생성 정도를 나타내는 TBARS 함량은 각 조직 세포의 microsome에 Fe2+/ascorbate을 첨가하여 비효소적으로 유도하여 지질과산화 억제능(%)으로 나타낸 결과, 그라비올라 잎의 용매별 추출물에서 농도 의존적으로 높은 지질과산화 억제활성을 나타내었다(Fig. 2). 에탄올 추출물 1.
- 천연물 내 생리활성 물질들은 추출되는 용매의 종류, 추출 온도 및 시간 등에 따라 추출되는 성분들이 달라지며 추출 수율 또한 많은 차이를 나타낸다[6]. 그라비올라 잎의 수율은 수용성 추출물, 에탄올 추출물 및 메탄올 추출물이 각각 1.76%, 1.40% 및 1.67%으로 에탄올 및 메탄올 추출물 수율보다 수용성 추출물 수율에서 높게 나타났다(Table 1).
- 51%로 모두 양성 대조군 보다 흡광도가 낮았으나 높은 항산화 효과를 나타내었으며, 농도가 감소함에 따라 흡광도의 감소가 크게 나타났다. 따라서 그라비올라 잎 추출물은 항산화 기전 중 lipid peroxyl radical의 억제능이 있음을 확인할 수 있었으며, 항산화 소재로서 사용 가능성이 있는 것으로 사료된다.
- 21로 에탄올 추출물에서 수용성 추출물과 메탄올 추출물에 비해 높은 결과를 나타내었다. 따라서 총 페놀성 화합물 및 flavonoid 함량과 DPPH를 이용한 라디칼 소거 활성이 높게 나타난 에탄올 추출물에서 높은 항산화 효능을 나타낸 것으로 사료된다.
- 00%를 제외하고 대조구인 BHT보다 낮은 활성을 나타내어 그라비올라 잎의 에탄올 추출물에서 우수한 항산화 활성을 나타내었다. 따라서 페놀성 화합물 함량이 많으며 DPPH를 이용한 라디칼 소거 활성 및 Fe/Cu 환원력 활성이 높게 나타난 에탄올 추출물에서 우수한 항산화능을 나타내었다.
- 00%에서 BHT보다 높은 활성을 나타내었다. 또한 에탄올 추출물 0.50%, 0.10%, 0.05% 및 0.01%에서도 90.18%, 89.07%, 88.63% 및 87.77%로 대조구인 BHT보다 높은 활성을 나타내었다. 하지만 에탄올 추출물을 제외한 나머지 수용성 추출물, 메탄올 추출물 경우, 수용성 추출물 1.
- 그라비올라 잎의 미네랄 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 미네랄 성분 조성은 Ca, K, Mg, Na, Mn로 나타내었으며, 전체적으로 Ca, K, Mg 순으로 높은 비율을 차지하였다. Ca가 1.
- 03 보다 높은 결과를 나타내었다(Table 3). 반면, 각 용매별 추출물의 Cu-환원력은 수용성 추출물 1.00%에서 2.91, 에탄올 추출물 1.00%에서 3.61, 메탄올 추출물 1.00%에서 3.21로 에탄올 추출물에서 수용성 추출물과 메탄올 추출물에 비해 높은 결과를 나타내었다. 따라서 총 페놀성 화합물 및 flavonoid 함량과 DPPH를 이용한 라디칼 소거 활성이 높게 나타난 에탄올 추출물에서 높은 항산화 효능을 나타낸 것으로 사료된다.
- 3). 반응 7일째에 대조구에 대한 상대 활성으로 나타낸 결과는 농도 의존적으로 농도가 높을수록 높은 항산화 활성을 보였으며, 수용성 추출물 1.00%에서 63.29%, 에탄올 추출물 1.00%에서 82.13%, 메탄올 추출물 1.00%에서 78.40%로 에탄올 추출물에서 수용성 추출물과 메탄올 추출물보다 높은 산화 저해율을 나타내었다. 에탄올 추출물과 메탄올 추출물 0.
- 대부분의 식물체에서 총 페놀성 화합물 함량이 flavonoid보다 많이 함유하고 있으며, 대체로 총 페놀성 화합물 함량이 많은 식물체에서는 flavonoid의 함량도 많이 함유하고 있는 것으로 알려져 있다[11]. 본 실험에 사용한 그라비올라 잎의 총 페놀성 화합물 측정 결과 수용성 추출물에서 431.29 mg/100 g, 에탄올 추출물에서 401.68 mg/100 g, 메탄올 추출물에서 465.43 mg/100 g으로 나타났으며, 메탄올 추출물에서 가장 높은 결과를 나타내었다. Flavonoid 함량은 수용성 추출물 181.
- 각 용매별 추출물의 DPPH radical 소거 활성을 측정한 결과, 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가하는 결과를 나타내었다. 에탄올 추출물 0.10%와 메탄올 추출물 0.10%에서 각각 93.39%, 93.54%로 높은 radical 소거 활성을 나타내었으며, 대조구로 사용된 BHT 0.05%와 비슷한 항산화 활성을 나타내었다. DPPH radical 소거능은 phenolic compounds 및 flavonoids 화합물 및 기타 페놀성 물질에 대한 항산화능의 지표로서, 환원력이 클수록 라디칼 소거능은 상승하게 된다.
- 2). 에탄올 추출물 1.00%에서 91.62%의 지질과산화 억제능을 나타내었으며, 대조구인 BHT의 지질과산화 억제능은 87.11%를 나타내어 에탄올 추출물 1.00%에서 BHT보다 높은 활성을 나타내었다. 또한 에탄올 추출물 0.
- 40%로 에탄올 추출물에서 수용성 추출물과 메탄올 추출물보다 높은 산화 저해율을 나타내었다. 에탄올 추출물과 메탄올 추출물 0.50%는 1.00%와 큰 차이를 나타내지 않았으나, 수용성 추출물 0.50%는 1.00%와 큰 차이를 나타내어 농도가 낮아질수록 낮은 산화 저해율을 나타내었다. 이에 따라 그라비올라 잎의 에탄올 추출물은 항산화 소재의 가능성이 있는 것으로 사료된다.
- 58%로 높은 항산화력으로 처리시간 동안 변화가 거의 없었다. 한편, 그라비올라 잎의 수용성 추출물 0.10%(Fig. 4A), 에탄올 추출물 0.10%(Fig. 4B) 및 메탄올 추출물 0.10%(Fig. 4C)은 각각75.76%, 77.24% 및 76.51%로 모두 양성 대조군 보다 흡광도가 낮았으나 높은 항산화 효과를 나타내었으며, 농도가 감소함에 따라 흡광도의 감소가 크게 나타났다. 따라서 그라비올라 잎 추출물은 항산화 기전 중 lipid peroxyl radical의 억제능이 있음을 확인할 수 있었으며, 항산화 소재로서 사용 가능성이 있는 것으로 사료된다.
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