손바닥선인장 추출물의 플라보노이드 구조 규명 및 HPLC-PDA를 이용한 지표성분의 함량 분석 Identification of Flavonoids from Extracts of Opuntia ficus-indica var. saboten and Content Determination of Marker Components Using HPLC-PDA원문보기
손바닥선인장으로부터 기능성식품 개발을 위하여 최적의 에탄올 추출물 탐색과 HPLC-PDA 분석방법에 의한 validation을 실시하였다. 지표성분으로 dihydrokaempferol (DHK)과 3-O-methylquercetin(3-MeQ)을 선정하여 표준화를 실시하였으며 검출법 확립을 위한 정량분석은 Luna RP-18 칼럼($4.6{\times}250mm$, $5{\mu}m$)을 이용하여 1% 인산용액과 아세토니트릴을 전개 용매로 사용하였다. 용출은 1.0 mL/min의 유속으로 기울기 용출(gradient elution) 방법을 이용하였으며, 280 nm 파장에서는 DHK를, 360 nm 파장에서는 3-MeQ를 검출한 피크 면적을 이용하여 검량곡선을 작성하여 분석하였다. 본 연구에서 확립한 분석법으로 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 회수율을 검색하였다. DHK의 검량선으로부터 상관계수($R^2$) 0.9998의 우수한 직선성과 intra-day와 inter-day 분석에서 97% 이상의 회수율과 3% 미만의 RSD를 나타내 정밀성과 정확성을 입증하였다. 3-MeQ의 검량선으로부터 상관계수($R^2$) 1의 우수한 직선성과 intra-day와 inter-day 분석에서 95% 이상의 회수율과 7% 미만의 RSD를 나타내 정밀성과 정확성을 입증하였다. DHK의 검출한계는 $1.38{\mu}g/mL$, 정량한계는 $4.18{\mu}g/mL$로 나타났으며, 3-MeQ의 검출한계는 $3.49{\mu}g/mL$, 정량한계는 $10.6{\mu}g/mL$로 나타났다. 손바닥선인장 에탄올 추출물(OFSEs)은 70과 $80^{\circ}C$에서 50, 70, 80% 에탄올로 3, 4, 5, 6시간 동안 각각 추출하였으며, 지표물질의 검량곡선을 활용하여 각각의 OFSEs로부터 두 종의 지표물질 함량을 분석하였다. 본 시험법으로 분석한 지표물질의 함량은 $80^{\circ}C$에서 추출한 70% OFSE가 DHK $26.42{\pm}0.65mg/OFS100g$, 3-MeQ $3.88{\pm}0.29mg/OFS100g$의 함량을 나타내 가장 우수하게 나타났다. 다양한 OFSEs에 대하여 DPPH 자유 라디칼 소거효능과 쥐의 간 균질액을 이용한 지질과산화 저해 효능에 대한 항산화 효능은 지표물질의 함량이 가장 높은 70% OFSE에서 우수한 효능을 나타내 본 연구에서 확립한 원료 표준화를 위한 적합한 분석법임이 검증되었다. 따라서 본 연구를 통하여 HPLC-PDA를 이용한 손바닥선인장 에탄올 추출물의 DHK와 3-MeQ의 분석법은 개별인정형 건강 기능식품 기능성 원료 개발을 위한 유용한 자료로 활용될 것으로 생각한다.
손바닥선인장으로부터 기능성식품 개발을 위하여 최적의 에탄올 추출물 탐색과 HPLC-PDA 분석방법에 의한 validation을 실시하였다. 지표성분으로 dihydrokaempferol (DHK)과 3-O-methylquercetin(3-MeQ)을 선정하여 표준화를 실시하였으며 검출법 확립을 위한 정량분석은 Luna RP-18 칼럼($4.6{\times}250mm$, $5{\mu}m$)을 이용하여 1% 인산용액과 아세토니트릴을 전개 용매로 사용하였다. 용출은 1.0 mL/min의 유속으로 기울기 용출(gradient elution) 방법을 이용하였으며, 280 nm 파장에서는 DHK를, 360 nm 파장에서는 3-MeQ를 검출한 피크 면적을 이용하여 검량곡선을 작성하여 분석하였다. 본 연구에서 확립한 분석법으로 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 회수율을 검색하였다. DHK의 검량선으로부터 상관계수($R^2$) 0.9998의 우수한 직선성과 intra-day와 inter-day 분석에서 97% 이상의 회수율과 3% 미만의 RSD를 나타내 정밀성과 정확성을 입증하였다. 3-MeQ의 검량선으로부터 상관계수($R^2$) 1의 우수한 직선성과 intra-day와 inter-day 분석에서 95% 이상의 회수율과 7% 미만의 RSD를 나타내 정밀성과 정확성을 입증하였다. DHK의 검출한계는 $1.38{\mu}g/mL$, 정량한계는 $4.18{\mu}g/mL$로 나타났으며, 3-MeQ의 검출한계는 $3.49{\mu}g/mL$, 정량한계는 $10.6{\mu}g/mL$로 나타났다. 손바닥선인장 에탄올 추출물(OFSEs)은 70과 $80^{\circ}C$에서 50, 70, 80% 에탄올로 3, 4, 5, 6시간 동안 각각 추출하였으며, 지표물질의 검량곡선을 활용하여 각각의 OFSEs로부터 두 종의 지표물질 함량을 분석하였다. 본 시험법으로 분석한 지표물질의 함량은 $80^{\circ}C$에서 추출한 70% OFSE가 DHK $26.42{\pm}0.65mg/OFS100g$, 3-MeQ $3.88{\pm}0.29mg/OFS100g$의 함량을 나타내 가장 우수하게 나타났다. 다양한 OFSEs에 대하여 DPPH 자유 라디칼 소거효능과 쥐의 간 균질액을 이용한 지질과산화 저해 효능에 대한 항산화 효능은 지표물질의 함량이 가장 높은 70% OFSE에서 우수한 효능을 나타내 본 연구에서 확립한 원료 표준화를 위한 적합한 분석법임이 검증되었다. 따라서 본 연구를 통하여 HPLC-PDA를 이용한 손바닥선인장 에탄올 추출물의 DHK와 3-MeQ의 분석법은 개별인정형 건강 기능식품 기능성 원료 개발을 위한 유용한 자료로 활용될 것으로 생각한다.
This study aimed to establish an optimal extraction process and high-performance liquid chromatography (HPLC)-photodiode array (PDA) analytical method for determination of marker compounds, dihydrokaempferol (DHK) and 3-O-methylquercetin (3-MeQ), as a part of materials standardization for the develo...
This study aimed to establish an optimal extraction process and high-performance liquid chromatography (HPLC)-photodiode array (PDA) analytical method for determination of marker compounds, dihydrokaempferol (DHK) and 3-O-methylquercetin (3-MeQ), as a part of materials standardization for the development of health functional foods from stems of Opuntia ficus-indica var. saboten (OFS). The quantitative determination method of marker compounds was optimized by HPLC analysis, and the correlation coefficient for the calibration curve showed very good linearity. The HPLC-PDA method was applied successfully to quantification of marker compounds in OFS after validation of the method in terms of linearity, accuracy, and precision. Ethanolic extracts from stems of O. ficus-indica var. saboten (OFSEs) were evaluated by reflux extraction at 70 and $80^{\circ}C$ with 50, 70, and 80% ethanol for 3, 4, 5, and 6 h. Among OFSEs, OFS70E at $80^{\circ}C$ showed the highest contents of DHK and 3-MeQ of $26.42{\pm}0.65$ and $3.88{\pm}0.29mg/OFS100g$, respectively. Furthermore, OFSEs were determined for their antioxidant activities by measuring 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging and lipid peroxidation (LPO) inhibitory activities in rat liver homogenate. OFS70E at $70^{\circ}C$ showed the most potent antioxidant activities with $IC_{50}$ values of $1.19{\pm}0.11$ and $0.89{\pm}0.09mg/mL$ in the DPPH radical scavenging and LPO inhibitory assays, respectively. To identify active components of OFS, various chromatographic separation of OFS70E led to isolation of 11 flavonoids: dihydrokaempferol, dihydroquercetin, 3-O-methylquercetin, quercetin, isorhamnetin 3-O-glucoside, isorhamnetin 3-O-galactoside, narcissin, kaempferol 7-O-glucoside, quercetin 3-O-galactoside, isorhamnetin, and kaempferol 3-O-rutinoside. The results suggest that standardization of DHK in OFSEs using HPLC-PDA analysis would be an acceptable method for the development of health functional foods.
This study aimed to establish an optimal extraction process and high-performance liquid chromatography (HPLC)-photodiode array (PDA) analytical method for determination of marker compounds, dihydrokaempferol (DHK) and 3-O-methylquercetin (3-MeQ), as a part of materials standardization for the development of health functional foods from stems of Opuntia ficus-indica var. saboten (OFS). The quantitative determination method of marker compounds was optimized by HPLC analysis, and the correlation coefficient for the calibration curve showed very good linearity. The HPLC-PDA method was applied successfully to quantification of marker compounds in OFS after validation of the method in terms of linearity, accuracy, and precision. Ethanolic extracts from stems of O. ficus-indica var. saboten (OFSEs) were evaluated by reflux extraction at 70 and $80^{\circ}C$ with 50, 70, and 80% ethanol for 3, 4, 5, and 6 h. Among OFSEs, OFS70E at $80^{\circ}C$ showed the highest contents of DHK and 3-MeQ of $26.42{\pm}0.65$ and $3.88{\pm}0.29mg/OFS100g$, respectively. Furthermore, OFSEs were determined for their antioxidant activities by measuring 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging and lipid peroxidation (LPO) inhibitory activities in rat liver homogenate. OFS70E at $70^{\circ}C$ showed the most potent antioxidant activities with $IC_{50}$ values of $1.19{\pm}0.11$ and $0.89{\pm}0.09mg/mL$ in the DPPH radical scavenging and LPO inhibitory assays, respectively. To identify active components of OFS, various chromatographic separation of OFS70E led to isolation of 11 flavonoids: dihydrokaempferol, dihydroquercetin, 3-O-methylquercetin, quercetin, isorhamnetin 3-O-glucoside, isorhamnetin 3-O-galactoside, narcissin, kaempferol 7-O-glucoside, quercetin 3-O-galactoside, isorhamnetin, and kaempferol 3-O-rutinoside. The results suggest that standardization of DHK in OFSEs using HPLC-PDA analysis would be an acceptable method for the development of health functional foods.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 인지 능력개선에 도움을 주는 건강기능식품 개발을 위하여 다양한 손바닥선 인장 에탄올 추출물을 제조하고 표준화를 위하여 함량이 높은 dihydrokaempferol(DHK)과 항산화 효능이 우수한 3-O-methylquercetin(3-MeQ)을 지표성분으로 선정하여 HPLC-PDA를 활용한 함량 분석법을 확립하고자 하였다. 또한, 손바닥선인장 에탄올 추출물로부터 다양한 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 추출물에서 항산화 효능을 나타내는 성분을 확인하고자 하였다.
또한, 본 연구팀에서 손바닥선인장 줄기의 뇌신경보호 효능과 기억력 개선 효능을 보고하였으며, 손바닥선인장 줄기로부터 분리된 플라보노이드 배당체(flavonoid glycosides)들이 효과적으로 항산화 활성을 나타낸다고 보고한 바 있다(14-17). 이에 본 연구에서는 인지 능력개선에 도움을 주는 건강기능식품 개발을 위하여 다양한 손바닥선 인장 에탄올 추출물을 제조하고 표준화를 위하여 함량이 높은 dihydrokaempferol(DHK)과 항산화 효능이 우수한 3-O-methylquercetin(3-MeQ)을 지표성분으로 선정하여 HPLC-PDA를 활용한 함량 분석법을 확립하고자 하였다. 또한, 손바닥선인장 에탄올 추출물로부터 다양한 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 추출물에서 항산화 효능을 나타내는 성분을 확인하고자 하였다.
DHK와 3-MeQ를 각각 1 mg씩 정밀히 취하여 메탄올 1 mL에 용해해 표준원액을 제조한 후, 메탄올로 희석하여 500, 250, 125, 62.5, 31.2, 15.6 및 7.80 μg/mL 농도에서 반복 측정하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정량한계(limit of quantitation, LOQ), 검출한계(limit of detection, LOD), 정확성(accuracy) 및 정밀성(precision)을 측정하여 분석법의 타당성을 검증하였다(18).
검출한계 및 정량한계: 검량선의 y 절편의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법으로, 표준용액을 단계별로 3회 반복 측정한 평균값으로 검량선을 작성하여 다음의 식에 따라 계산하여 검출한계와 정량한계를 확인하였다.
다양한 조건에서 추출한 에탄올 추출물 OFSEs의 항산화 효능검색을 하였다. 대조 약물은 항산화제로 잘 알려진 quercetin, resveratrol, ascorbic acid, Trolox를 사용하여 검색하였으며, 결과는 Table 5에 나타내었다.
0 mL/min의 유속으로 기울기 용출(gradient elution) 방법을 이용하였으며, 280 nm 파장에서는 DHK를, 360 nm 파장에서는 3-MeQ를 검출한 피크 면적을 이용하여 검량곡선을 작성하여 분석하였다. 본 연구에서 확립한 분석법으로 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 회수율을 검색하였다. DHK의 검량선으로부터 상관계수(R2) 0.
이동상으로는 아세토니트릴(A)과 1% 인산용액(B)을 사용하여 1 mL/min의 유속으로 시료 20 μL를 주입하여 gradient condition으로 분석하였으며, 분석 조건은 Table 1과 같다. 분석 시료는 280 nm에서 크로마토그램을 추출하여 DHK의 면적을 구하였으며, 360 nm에서 크로마토그램을 추출하여 3-MeQ 피크 면적을 구한 다음 표준화합물의 검량곡선으로부터 각 화합물의 함유량을 계산하였다.
37 g)은 sephadex LH-20을 사용하고 메탄올을 전개용매로 칼럼크로마토그래피를 실시하여 8개의 소분획(OFS70E3A~H)으로 나누었다. 소분획 OFS70E 3D(32.6 mg)는 분취용 HPLC를 실시하여 화합물 1(Rt 27 min, 23.9 mg)과 2(Rt 22 min, 2.3 mg)를 분리하였으며, 소분획 OFS70E3G로부터 화합물 3(Rt 33 min, 15.0 mg)을 얻었다. 소분획 OFS70E3C(39.
5 L씩 이동상으로 사용하여 6개의 분획(OFS70E1~OFS70E6)으로 나누었다. 소분획 OFS70E3(1.37 g)은 sephadex LH-20을 사용하고 메탄올을 전개용매로 칼럼크로마토그래피를 실시하여 8개의 소분획(OFS70E3A~H)으로 나누었다. 소분획 OFS70E 3D(32.
6 μg/mL로 나타났다. 손바닥선인장 에탄올 추출물 (OFSEs)은 70과 80℃에서 50, 70, 80% 에탄올로 3, 4, 5, 6시간 동안 각각 추출하였으며, 지표물질의 검량곡선을 활용하여 각각의 OFSEs로부터 두 종의 지표물질 함량을 분석하였다. 본 시험법으로 분석한 지표물질의 함량은 80℃ 에서 추출한 70% OFSE가 DHK 26.
손바닥선인장 에탄올 추출물(OFSEs)로부터 기능성 원료 개발을 위해 50, 70, 80% 에탄올을 사용하여 70과 80℃에 서 3, 4, 5, 6시간 동안 환류 추출하여 각각의 OFSEs를 수득하였다. OFSEs에서의 추출수율과 DHK와 3-MeQ의 함량 분석은 3회 반복 실험하여 수득한 결과를 평균±표준편차로 Table 4에 나타내었다.
손바닥선인장 에탄올 추출물에 대하여 HPLC profiling을 실시하고 표준물질 DHK와 3-MeQ를 포함하여 11종의 플라보노이드와 비교한 크로마토그래피를 Fig. 3에 나타내었다. 그 결과 손바닥선인장 70% 에탄올 추출물의 주성분은 360 nm 파장에서 최대 피크를 나타내고 있는 narcissin으로 나타났으며, 이는 칼럼으로 분리한 경우에도 가장 높은 함량을 나타내었으나 여러 종의 화합물이 중첩되어 나타나 지표물질로 사용하기에는 부적당한 것으로 생각한다.
본 실험에 사용한 손바닥선인장은 2016년 3월에 제주도에서 줄기를 채취하여 세절한 후 열풍 건조하여 사용하였으며, 증거 시료(901-15-1603)는 한국과학기술연구원 표본실에 보관하고 있다. 손바닥선인장 에탄올 추출물의 validation에 사용한 DHK와 3-MeQ는 손바닥선인장 70% 에탄올 추출물에서 분리한 것으로 기기분석을 활용한 구조분석 후 에탄올 추출물의 지표성분으로 사용하였다.
손바닥선인장으로부터 기능성식품 개발을 위하여 최적의 에탄올 추출물 탐색과 HPLC-PDA 분석방법에 의한 validation을 실시하였다. 지표성분으로 dihydrokaempferol (DHK)과 3-O-methylquercetin(3-MeQ)을 선정하여 표준화를 실시하였으며 검출법 확립을 위한 정량분석은 Luna RP-18 칼럼(4.
정확성: 일정 농도의 DHK와 3-MeQ의 표준액을 조제하여 각각의 샘플로 일내 분석(intra-day)과 일간 분석(interday)의 변이성을 측정하였다. 시험농도의 100%에 해당하는 농도로 DHK와 3-MeQ의 표준액을 조제하여 분석법의 전 조작을 3회 반복 주입하여 검량선에 따라 구해진 값과 참값을 비교한 회수율로 나타내었다.
동물실험은 한국과학기술연구원의 동물실험윤리위원 회의 승인 후 진행하였다(2014-065). 에테르로 가볍게 마취 후 해부하여 간 문맥을 통하여 0.15 M ice cold KCl 용액을 관류시켜 간 내의 혈액을 제거하여 간을 적출하고 간 무게 10배량의 KCl 용액을 가한 후 homogenizing 하여 간 균질액을 만들었다. 단백질 농도는 bovine serum albumin 을 표준품으로 하여 Bradford protein method에 의하여 정량하였다(20).
6×250 mm, 5 μm)을 이용하여 1% 인산용액과 아세토니트릴을 전개 용매로 사용하였다. 용출은 1.0 mL/min의 유속으로 기울기 용출(gradient elution) 방법을 이용하였으며, 280 nm 파장에서는 DHK를, 360 nm 파장에서는 3-MeQ를 검출한 피크 면적을 이용하여 검량곡선을 작성하여 분석하였다. 본 연구에서 확립한 분석법으로 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 회수율을 검색하였다.
9 g을 수득하였다. 이 추출물 50 g은 diaion HP-20을 고정상으로 사용하여 분획을 실시하였다. 칼럼에 사용한 용매는 30, 50, 70, 90, 100% 메탄올, CH2Cl2 : MeOH(50:50)의 혼합용매를 각각 2.
이동상으로는 아세토니트릴(A)과 1% 인산용액(B)을 사용하여 1 mL/min의 유속으로 시료 20 μL를 주입하여 gradient condition으로 분석하였으며, 분석 조건은 Table 1과 같다.
자유라디칼 소거효능은 100 μM DPPH 에탄올 용액 190 μL에 손바닥선인장 에탄올 추출용액 10 μL를 가해 30분 동안 37℃에서 반응시킨 후, 515 nm에서 흡광도를 측정하여 IC50 값으로 구하였다(19).
정밀성: 성분피크 면적비의 표준편차를 각 성분피크 면적 비의 평균값으로 나눈 비의 백분율로서 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 확인하여 정밀성을 나타내었다.
정확성: 일정 농도의 DHK와 3-MeQ의 표준액을 조제하여 각각의 샘플로 일내 분석(intra-day)과 일간 분석(interday)의 변이성을 측정하였다. 시험농도의 100%에 해당하는 농도로 DHK와 3-MeQ의 표준액을 조제하여 분석법의 전 조작을 3회 반복 주입하여 검량선에 따라 구해진 값과 참값을 비교한 회수율로 나타내었다.
제조공정의 추출조건을 검토하기 위하여 손바닥선인장 건시료 10 g에 70 mL의 50, 70, 80% 에탄올을 사용하여 70 및 80℃에서 3, 4, 5, 6시간 동안 각각 환류 추출한 후 종료시점에 상층액을 취하고 0.45 μm PVDF syringe filter로 여과하여 HPLC 분석에 사용하였다.
01% butylated hydroxytoluene)을 가하여 95℃에서 30분 동안 반응시킨 후 냉각시켜 10분 동안 원심분리(5,000×g) 하여 상등액을 535 nm에서 흡광도를 측정한다. 지질과산화 저해효능을 비교하기 위한 약물로 Trolox를 이용하였고 control은 시험 약물 대신에 DMSO를 사용하였으며, 3회 반복 측정하여 과산화지질의 생성을 50% 저해하는 데 필요한 시료의 농도(IC50)를 측정 하였다.
지표성분으로 dihydrokaempferol (DHK)과 3-O-methylquercetin(3-MeQ)을 선정하여 표준화를 실시하였으며 검출법 확립을 위한 정량분석은 Luna RP-18 칼럼(4.6×250 mm, 5 μm)을 이용하여 1% 인산용액과 아세토니트릴을 전개 용매로 사용하였다.
45 μm PVDF syringe filter로 여과하여 HPLC 분석에 사용하였다. 추출물은 감압여과 후 농축하고 건조해 에탄올 추출물을 수득하였으며 동일한 방법으로 총 3회 실시하였다.
이 추출물 50 g은 diaion HP-20을 고정상으로 사용하여 분획을 실시하였다. 칼럼에 사용한 용매는 30, 50, 70, 90, 100% 메탄올, CH2Cl2 : MeOH(50:50)의 혼합용매를 각각 2.5 L씩 이동상으로 사용하여 6개의 분획(OFS70E1~OFS70E6)으로 나누었다. 소분획 OFS70E3(1.
특이성 확인을 위하여 표준용액과 같이 시료 전처리 방법으로 처리하여 분석한 손바닥선인장 추출액의 크로마토그램을 설정한 파장 280 nm에서 DHK 피크가 분리되는지를 확인하였다. 그 결과 다른 물질과의 간섭 없이 성분이 분리되어 특이성을 확인할 수 있었다.
HPLC 기기는 Waters 1500 Series System, Waters 2998 PDA Detector(Waters Corp., Worcester, MA, USA), Luna C18(5 μm, 250×4.6 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) 칼럼을 사용하였으며, 분석에 사용된 모든 용매는 J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)로부터 구입한 HPLC급 용매를 사용하였다.
IC50 값은 자유라디칼 소거효 능을 계산하여 50% 소거효능을 나타내는 농도(IC50)를 의미한다. 대조 약물은 라디칼 소거제로 잘 알려진 quercetin, resveratrol, ascorbic acid를 사용하였으며, 데이터는 3회 실시한 평균값을 제시하였다.
다양한 조건에서 추출한 에탄올 추출물 OFSEs의 항산화 효능검색을 하였다. 대조 약물은 항산화제로 잘 알려진 quercetin, resveratrol, ascorbic acid, Trolox를 사용하여 검색하였으며, 결과는 Table 5에 나타내었다. DPPH 자유라디칼 소거 효능은 에탄올의 함량이 70% 이상 사용한 경우에 우수한 효능을 나타내고 있는데, 70℃에서 70% 에 탄올로 6시간 동안 추출한 경우 IC50 값이 1.
본 실험에 사용한 손바닥선인장은 2016년 3월에 제주도에서 줄기를 채취하여 세절한 후 열풍 건조하여 사용하였으며, 증거 시료(901-15-1603)는 한국과학기술연구원 표본실에 보관하고 있다. 손바닥선인장 에탄올 추출물의 validation에 사용한 DHK와 3-MeQ는 손바닥선인장 70% 에탄올 추출물에서 분리한 것으로 기기분석을 활용한 구조분석 후 에탄올 추출물의 지표성분으로 사용하였다.
손바닥선인장 추출에 사용한 에탄올은 95% 에탄올(Samchun Chemical, Gyeonggi, Korea)을 사용하였다. 제조공정의 추출조건을 검토하기 위하여 손바닥선인장 건시료 10 g에 70 mL의 50, 70, 80% 에탄올을 사용하여 70 및 80℃에서 3, 4, 5, 6시간 동안 각각 환류 추출한 후 종료시점에 상층액을 취하고 0.
체중 200±20 g의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐(오리 엔탈바이오, 경기)는 실험 전 24시간 동안 상수만을 공급하였다.
데이터처리
기울기 S는 분석대상물질의 검량선으로부터 구하였으며 표준편차(σ)는 정량한계 내에 있는 분석대상물질을 포함한 검체를 사용하여 특이적인 검량선을 작성한 후 y 절편의 표준편차를 표준편차 σ로서 이용하였다.
손바닥선인장 에탄올 추출물의 건강기능성 원료 개발을 위한 기준규격인정 및 품질관리 validation은 식품의약품안 전처의약품등의 분석법 validation 가이드라인에 기초하여 수행되었다(18). 표준품으로 사용한 DHK와 3-MeQ의 분석은 최대 흡광도를 나타내는 280 nm와 360 nm에서 각각의 크로마토그램을 3회 반복 실험하여 얻은 평균값으로 계산하여 검량곡선을 구하였다. DHK의 경우 y=10626x-14734, 상관관계(R2)=0.
이론/모형
15 M ice cold KCl 용액을 관류시켜 간 내의 혈액을 제거하여 간을 적출하고 간 무게 10배량의 KCl 용액을 가한 후 homogenizing 하여 간 균질액을 만들었다. 단백질 농도는 bovine serum albumin 을 표준품으로 하여 Bradford protein method에 의하여 정량하였다(20). 지질과산화 시험은 Sanz 등(21)의 방법을 약간 변형하여 이용하였다.
손바닥선인장 에탄올 추출물의 건강기능성 원료 개발을 위한 기준규격인정 및 품질관리 validation은 식품의약품안 전처의약품등의 분석법 validation 가이드라인에 기초하여 수행되었다(18). 표준품으로 사용한 DHK와 3-MeQ의 분석은 최대 흡광도를 나타내는 280 nm와 360 nm에서 각각의 크로마토그램을 3회 반복 실험하여 얻은 평균값으로 계산하여 검량곡선을 구하였다.
성능/효과
1H NMR에서 δ 5.84(1H, J=2.0 Hz)와 5.79(1H, J=2.0 Hz)의 doublet peaks는 A ring에서 기인하는 peak로 서로 meta coupling을 하고 있음을 알 수 있었으며, δ 4.89와 4.46에서의 peaks는 C ring에서 기인하는 peak로 coupling constants가 각각 11.6 Hz로 나타나 두 개의 수소는 trans 결합을 하는 flavanol 구조임을 알 수 있었다.
9998의 우수한 직선성과 intra-day와 inter-day 분석에서 97% 이상의 회수율과 3% 미만의 RSD를 나타내 정밀성과 정확성을 입증하였다. 3- MeQ의 검량선으로부터 상관계수(R2) 1의 우수한 직선성과 intra-day와 inter-day 분석에서 95% 이상의 회수율과 7% 미만의 RSD를 나타내 정밀성과 정확성을 입증하였다. DHK의 검출한계는 1.
그 결과 다른 물질과의 간섭 없이 성분이 분리되어 특이성을 확인할 수 있었다. 360 nm에서는 3-MeQ의 피크가 분리되는지를 확인한 결과 다른 물질과의 간섭 없이 성분이 잘 분리되어 특이성을 확인할 수 있었다. 표준용액 DHK의 머무름 시간(Rt)은 27.
7%로 낮은 수율을 보인다. 70℃에서 추출한 경우에도 에탄올의 함량이 낮을수록 높게 측정되었으며, OFS50E의 경우 20% 정도의 높은 수율을 나타내었다. 그러나 같은 용매를 사용하고 추출시간을 달리한 추출물 간의 수율은 추출시간과 무관한 수율을 나타내 효율적인 에탄올 추출물을 얻기 위한 추출 변수로 작용하지 못하였다.
본 연구에서 확립한 분석법으로 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 회수율을 검색하였다. DHK의 검량선으로부터 상관계수(R2) 0.9998의 우수한 직선성과 intra-day와 inter-day 분석에서 97% 이상의 회수율과 3% 미만의 RSD를 나타내 정밀성과 정확성을 입증하였다. 3- MeQ의 검량선으로부터 상관계수(R2) 1의 우수한 직선성과 intra-day와 inter-day 분석에서 95% 이상의 회수율과 7% 미만의 RSD를 나타내 정밀성과 정확성을 입증하였다.
76%를 나타내 6% 이내의 정밀성을 나타내었다. Inter-day 분석에서의 회수율은 95.9 ~115.2%를 나타내었으며, RE는 0.62~15.2%와 RSD는 0.08~6.37%로 나타나 정확성과 정밀성을 확인할 수 있었다.
표준용액들의 intra-, inter-day 분석의 정밀성, 정확성 및 회수율을 측정한 결과는 Table 3에 나타내었다. Intra-day 분석에서 회수율은 시료 면적을 검량선에 근거하여 회수되는 시료량을 백분율로 계산한 값이 97.0~115.9%의 범위로 나타났으며, RE는 DHK의 가장 낮은 농도를 제외하고 모두 10% 이내로 나타났고 RSD는 0.14~5.76%를 나타내 6% 이내의 정밀성을 나타내었다. Inter-day 분석에서의 회수율은 95.
50 mg/OFS 100 g으로 높은 함량을 나타내고 있다. OFS 50E와 OFS70E의 경우에도 높은 함량이 측정되었으며 추출 시간에 따른 함량 변화도 비교적 적게 나타났다. 한편 70% 에탄올을 사용하여 4시간 이상 추출할 경우에 지표물 질의 함량이 높은 추출물을 수득할 수 있으며, 80% 에탄올을 사용할 경우에는 6시간 이상 추출하는 것이 효과적일 것으로 예상한다.
특이성 확인을 위하여 표준용액과 같이 시료 전처리 방법으로 처리하여 분석한 손바닥선인장 추출액의 크로마토그램을 설정한 파장 280 nm에서 DHK 피크가 분리되는지를 확인하였다. 그 결과 다른 물질과의 간섭 없이 성분이 분리되어 특이성을 확인할 수 있었다. 360 nm에서는 3-MeQ의 피크가 분리되는지를 확인한 결과 다른 물질과의 간섭 없이 성분이 잘 분리되어 특이성을 확인할 수 있었다.
3에 나타내었다. 그 결과 손바닥선인장 70% 에탄올 추출물의 주성분은 360 nm 파장에서 최대 피크를 나타내고 있는 narcissin으로 나타났으며, 이는 칼럼으로 분리한 경우에도 가장 높은 함량을 나타내었으나 여러 종의 화합물이 중첩되어 나타나 지표물질로 사용하기에는 부적당한 것으로 생각한다.
10 mg/mL로 유사하게 나타나고 있다. 다만 50% 에탄올을 사용하여 추출한 추출물은 6시간으로 추출시간이 길어진 경우에 효능이 다소 감소하는 경향을 나타내었다. 그러므로 50% 에탄올을 사용 할 경우에는 4시간 이내로 추출하는 것이 효율적이라 사료된다.
29 mg/OFS 100 g의 함량을 나타내 가장 우수하게 나타났다. 다양한 OFSEs에 대하여 DPPH 자유 라디칼 소거효능과 쥐의 간 균질액을 이용한 지질과산화 저해 효능에 대한 항산화 효능은 지표물질의 함량이 가장 높은 70% OFSE에서 우수한 효능을 나타내 본 연구에서 확립한 원료 표준화를 위한 적합한 분석법임이 검증되었다. 따라서 본 연구를 통하여 HPLC-PDA를 이용한 손바닥선인장 에탄올 추출물의 DHK와 3-MeQ의 분석법은 개별인정형 건강 기능식품 기능성 원료 개발을 위한 유용한 자료로 활용될 것으로 생각한다.
그러므로 지표성분 함량이나 항산화 효능을 비교하여 적절한 용매와 온도를 설정하여 추출시간을 선정하는 것이 효율적인 추출물 제조를 위해 필요할 것으로 생각한다. 따라서 효율적인 추출물 제조는 80℃에서 6시간 동안 추출한 OFS70E가 가장 효율적인 추출조건으로 사료되며, OFSEs에서의 표준화를 위해서는 지표성분으로 DHK와 3-MeQ를 선정함이 타당할 것으로 생각한다.
본 시험법으로 분석한 지표물질의 함량은 80℃ 에서 추출한 70% OFSE가 DHK 26.42±0.65 mg/OFS 100 g, 3-MeQ 3.88±0.29 mg/OFS 100 g의 함량을 나타내 가장 우수하게 나타났다.
이상의 결과를 종합하면 손바닥선인장은 80℃에서 70% 에탄올로 추출한 OFSE가 DHK의 경우 26.42±0.65 mg/ OFS 100 g, 3-MeQ의 경우 3.88±0.29 mg/OFS 100 g으로 함량이 높게 측정되었으며, 지표물질의 함량이 높은 추출물에서 우수한 항산화 효능을 보인다.
쥐의 간 균질액을 이용하여 검색한 지질과산화 저해 효능 은 추출온도와 사용한 추출 용매 간에 효능 차이가 크게 없었으며 IC50 값이 0.87±0.14~0.99±0.10 mg/mL로 유사하게 나타나고 있다.
360 nm에서는 3-MeQ의 피크가 분리되는지를 확인한 결과 다른 물질과의 간섭 없이 성분이 잘 분리되어 특이성을 확인할 수 있었다. 표준용액 DHK의 머무름 시간(Rt)은 27.218분이고 3-MeQ의 머무름 시간(Rt)은 36.368분으로 나타나 손바닥선인장 추출액에서의 DHK의 머무름 시간(Rt) 27.219분과 3-MeQ의 머무름 시간 35.572분으로 피크 유지시간이 표준용액에서의 머무름 시간과 거의 일치하였다(Fig. 3).
OFS 50E와 OFS70E의 경우에도 높은 함량이 측정되었으며 추출 시간에 따른 함량 변화도 비교적 적게 나타났다. 한편 70% 에탄올을 사용하여 4시간 이상 추출할 경우에 지표물 질의 함량이 높은 추출물을 수득할 수 있으며, 80% 에탄올을 사용할 경우에는 6시간 이상 추출하는 것이 효과적일 것으로 예상한다.
후속연구
다양한 OFSEs에 대하여 DPPH 자유 라디칼 소거효능과 쥐의 간 균질액을 이용한 지질과산화 저해 효능에 대한 항산화 효능은 지표물질의 함량이 가장 높은 70% OFSE에서 우수한 효능을 나타내 본 연구에서 확립한 원료 표준화를 위한 적합한 분석법임이 검증되었다. 따라서 본 연구를 통하여 HPLC-PDA를 이용한 손바닥선인장 에탄올 추출물의 DHK와 3-MeQ의 분석법은 개별인정형 건강 기능식품 기능성 원료 개발을 위한 유용한 자료로 활용될 것으로 생각한다.
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