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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 인지 능력개선에 도움을 주는 건강기능식품 개발을 위하여 다양한 손바닥선 인장 에탄올 추출물을 제조하고 표준화를 위하여 함량이 높은 dihydrokaempferol(DHK)과 항산화 효능이 우수한 3-O-methylquercetin(3-MeQ)을 지표성분으로 선정하여 HPLC-PDA를 활용한 함량 분석법을 확립하고자 하였다. 또한, 손바닥선인장 에탄올 추출물로부터 다양한 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 추출물에서 항산화 효능을 나타내는 성분을 확인하고자 하였다.
- 또한, 본 연구팀에서 손바닥선인장 줄기의 뇌신경보호 효능과 기억력 개선 효능을 보고하였으며, 손바닥선인장 줄기로부터 분리된 플라보노이드 배당체(flavonoid glycosides)들이 효과적으로 항산화 활성을 나타낸다고 보고한 바 있다(14-17). 이에 본 연구에서는 인지 능력개선에 도움을 주는 건강기능식품 개발을 위하여 다양한 손바닥선 인장 에탄올 추출물을 제조하고 표준화를 위하여 함량이 높은 dihydrokaempferol(DHK)과 항산화 효능이 우수한 3-O-methylquercetin(3-MeQ)을 지표성분으로 선정하여 HPLC-PDA를 활용한 함량 분석법을 확립하고자 하였다. 또한, 손바닥선인장 에탄올 추출물로부터 다양한 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 추출물에서 항산화 효능을 나타내는 성분을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)와 resveratrol, ascorbic acid, Trolox는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, 효능검색에 사용한 검출기는 EpoCh microplate spectrophotometer(BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하여 억제효능을 분석하였다.
- DHK와 3-MeQ를 각각 1 mg씩 정밀히 취하여 메탄올 1 mL에 용해해 표준원액을 제조한 후, 메탄올로 희석하여 500, 250, 125, 62.5, 31.2, 15.6 및 7.80 μg/mL 농도에서 반복 측정하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정량한계(limit of quantitation, LOQ), 검출한계(limit of detection, LOD), 정확성(accuracy) 및 정밀성(precision)을 측정하여 분석법의 타당성을 검증하였다(18).
- 검출한계 및 정량한계: 검량선의 y 절편의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법으로, 표준용액을 단계별로 3회 반복 측정한 평균값으로 검량선을 작성하여 다음의 식에 따라 계산하여 검출한계와 정량한계를 확인하였다.
- 다양한 조건에서 추출한 에탄올 추출물 OFSEs의 항산화 효능검색을 하였다. 대조 약물은 항산화제로 잘 알려진 quercetin, resveratrol, ascorbic acid, Trolox를 사용하여 검색하였으며, 결과는 Table 5에 나타내었다.
- 0 mL/min의 유속으로 기울기 용출(gradient elution) 방법을 이용하였으며, 280 nm 파장에서는 DHK를, 360 nm 파장에서는 3-MeQ를 검출한 피크 면적을 이용하여 검량곡선을 작성하여 분석하였다. 본 연구에서 확립한 분석법으로 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 회수율을 검색하였다. DHK의 검량선으로부터 상관계수(R2) 0.
- 이동상으로는 아세토니트릴(A)과 1% 인산용액(B)을 사용하여 1 mL/min의 유속으로 시료 20 μL를 주입하여 gradient condition으로 분석하였으며, 분석 조건은 Table 1과 같다. 분석 시료는 280 nm에서 크로마토그램을 추출하여 DHK의 면적을 구하였으며, 360 nm에서 크로마토그램을 추출하여 3-MeQ 피크 면적을 구한 다음 표준화합물의 검량곡선으로부터 각 화합물의 함유량을 계산하였다.
- 37 g)은 sephadex LH-20을 사용하고 메탄올을 전개용매로 칼럼크로마토그래피를 실시하여 8개의 소분획(OFS70E3A~H)으로 나누었다. 소분획 OFS70E 3D(32.6 mg)는 분취용 HPLC를 실시하여 화합물 1(Rt 27 min, 23.9 mg)과 2(Rt 22 min, 2.3 mg)를 분리하였으며, 소분획 OFS70E3G로부터 화합물 3(Rt 33 min, 15.0 mg)을 얻었다. 소분획 OFS70E3C(39.
- 5 L씩 이동상으로 사용하여 6개의 분획(OFS70E1~OFS70E6)으로 나누었다. 소분획 OFS70E3(1.37 g)은 sephadex LH-20을 사용하고 메탄올을 전개용매로 칼럼크로마토그래피를 실시하여 8개의 소분획(OFS70E3A~H)으로 나누었다. 소분획 OFS70E 3D(32.
- 5 mg)을 순수하게 분리하였다. 소분획 OFS70E3B(770.0 mg)는 sephadex LH-20을 고정상으로 사용하고 70% 메탄올을 전개용매로 사용하여 화합물 1(9.0 mg)과 7(3.3 mg)을 추가로 분리하였으며, 화합물 6(Rt 24 min, 6.3 mg)과 9(8.0 mg)를 분리하였다. 소분획 OFS70E3E(36.
- 0 mg)을 얻었다. 소분획 OFS70E3C(39.0 mg)는 분취용 HPLC를 실시하여 화합물 1(19.1 mg)을 추가 분리하였으며, 화합물 7(Rt 23 min, 5.08 mg), 8(Rt 20 min, 2.11 mg), 10(2.5 mg)을 순수하게 분리하였다. 소분획 OFS70E3B(770.
- 0 mg)를 분리하였다. 소분획 OFS70E3E(36.6 mg)는 분취용 HPLC를 실시하여 화합물 1(11.6 mg), 2(Rt 22 min, 11.3 mg), 4(Rt 36 min, 1.3 mg), 11(Rt 25 min, 1.9 mg)을 순수하게 분리하였다. 소분획 OFS70E4는 분취용 RP-18 TLC 를 실시하여 화합물 5(Rt 42 min, 2.
- 손바닥선인장 70% 에탄올 추출물(OFS70E)로부터 diaion HP-20, sephadex LH-20, preparative HPLC 등 다양한 column chromatography를 실시하여 11종의 플라보노이드 유도체 dihydrokaempferol(1), dihydroquercetin(2), quercetin(3), 3-O-methylquercetin(4), isorhamnetin(5), isorhamnetin 3-O-glucoside(6), isorhamnetin 3-O-galactoside(7), quercetin 3-O-galactoside(8), narcissin(9), kaempferol 3-O-rutinoside(10), kaempferol 7-O-glucoside(11)를 분리하였다(Fig. 1).
- 6 μg/mL로 나타났다. 손바닥선인장 에탄올 추출물 (OFSEs)은 70과 80℃에서 50, 70, 80% 에탄올로 3, 4, 5, 6시간 동안 각각 추출하였으며, 지표물질의 검량곡선을 활용하여 각각의 OFSEs로부터 두 종의 지표물질 함량을 분석하였다. 본 시험법으로 분석한 지표물질의 함량은 80℃ 에서 추출한 70% OFSE가 DHK 26.
- 손바닥선인장 에탄올 추출물(OFSEs)로부터 기능성 원료 개발을 위해 50, 70, 80% 에탄올을 사용하여 70과 80℃에 서 3, 4, 5, 6시간 동안 환류 추출하여 각각의 OFSEs를 수득하였다. OFSEs에서의 추출수율과 DHK와 3-MeQ의 함량 분석은 3회 반복 실험하여 수득한 결과를 평균±표준편차로 Table 4에 나타내었다.
- 손바닥선인장 에탄올 추출물에 대하여 HPLC profiling을 실시하고 표준물질 DHK와 3-MeQ를 포함하여 11종의 플라보노이드와 비교한 크로마토그래피를 Fig. 3에 나타내었다. 그 결과 손바닥선인장 70% 에탄올 추출물의 주성분은 360 nm 파장에서 최대 피크를 나타내고 있는 narcissin으로 나타났으며, 이는 칼럼으로 분리한 경우에도 가장 높은 함량을 나타내었으나 여러 종의 화합물이 중첩되어 나타나 지표물질로 사용하기에는 부적당한 것으로 생각한다.
- 본 실험에 사용한 손바닥선인장은 2016년 3월에 제주도에서 줄기를 채취하여 세절한 후 열풍 건조하여 사용하였으며, 증거 시료(901-15-1603)는 한국과학기술연구원 표본실에 보관하고 있다. 손바닥선인장 에탄올 추출물의 validation에 사용한 DHK와 3-MeQ는 손바닥선인장 70% 에탄올 추출물에서 분리한 것으로 기기분석을 활용한 구조분석 후 에탄올 추출물의 지표성분으로 사용하였다.
- 손바닥선인장으로부터 기능성식품 개발을 위하여 최적의 에탄올 추출물 탐색과 HPLC-PDA 분석방법에 의한 validation을 실시하였다. 지표성분으로 dihydrokaempferol (DHK)과 3-O-methylquercetin(3-MeQ)을 선정하여 표준화를 실시하였으며 검출법 확립을 위한 정량분석은 Luna RP-18 칼럼(4.
- 정확성: 일정 농도의 DHK와 3-MeQ의 표준액을 조제하여 각각의 샘플로 일내 분석(intra-day)과 일간 분석(interday)의 변이성을 측정하였다. 시험농도의 100%에 해당하는 농도로 DHK와 3-MeQ의 표준액을 조제하여 분석법의 전 조작을 3회 반복 주입하여 검량선에 따라 구해진 값과 참값을 비교한 회수율로 나타내었다.
- 동물실험은 한국과학기술연구원의 동물실험윤리위원 회의 승인 후 진행하였다(2014-065). 에테르로 가볍게 마취 후 해부하여 간 문맥을 통하여 0.15 M ice cold KCl 용액을 관류시켜 간 내의 혈액을 제거하여 간을 적출하고 간 무게 10배량의 KCl 용액을 가한 후 homogenizing 하여 간 균질액을 만들었다. 단백질 농도는 bovine serum albumin 을 표준품으로 하여 Bradford protein method에 의하여 정량하였다(20).
- 6×250 mm, 5 μm)을 이용하여 1% 인산용액과 아세토니트릴을 전개 용매로 사용하였다. 용출은 1.0 mL/min의 유속으로 기울기 용출(gradient elution) 방법을 이용하였으며, 280 nm 파장에서는 DHK를, 360 nm 파장에서는 3-MeQ를 검출한 피크 면적을 이용하여 검량곡선을 작성하여 분석하였다. 본 연구에서 확립한 분석법으로 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 회수율을 검색하였다.
- 9 g을 수득하였다. 이 추출물 50 g은 diaion HP-20을 고정상으로 사용하여 분획을 실시하였다. 칼럼에 사용한 용매는 30, 50, 70, 90, 100% 메탄올, CH2Cl2 : MeOH(50:50)의 혼합용매를 각각 2.
- 이동상으로는 아세토니트릴(A)과 1% 인산용액(B)을 사용하여 1 mL/min의 유속으로 시료 20 μL를 주입하여 gradient condition으로 분석하였으며, 분석 조건은 Table 1과 같다.
- 자유라디칼 소거효능은 100 μM DPPH 에탄올 용액 190 μL에 손바닥선인장 에탄올 추출용액 10 μL를 가해 30분 동안 37℃에서 반응시킨 후, 515 nm에서 흡광도를 측정하여 IC50 값으로 구하였다(19).
- 정밀성: 성분피크 면적비의 표준편차를 각 성분피크 면적 비의 평균값으로 나눈 비의 백분율로서 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 확인하여 정밀성을 나타내었다.
- 정확성: 일정 농도의 DHK와 3-MeQ의 표준액을 조제하여 각각의 샘플로 일내 분석(intra-day)과 일간 분석(interday)의 변이성을 측정하였다. 시험농도의 100%에 해당하는 농도로 DHK와 3-MeQ의 표준액을 조제하여 분석법의 전 조작을 3회 반복 주입하여 검량선에 따라 구해진 값과 참값을 비교한 회수율로 나타내었다.
- 제조공정의 추출조건을 검토하기 위하여 손바닥선인장 건시료 10 g에 70 mL의 50, 70, 80% 에탄올을 사용하여 70 및 80℃에서 3, 4, 5, 6시간 동안 각각 환류 추출한 후 종료시점에 상층액을 취하고 0.45 μm PVDF syringe filter로 여과하여 HPLC 분석에 사용하였다.
- 01% butylated hydroxytoluene)을 가하여 95℃에서 30분 동안 반응시킨 후 냉각시켜 10분 동안 원심분리(5,000×g) 하여 상등액을 535 nm에서 흡광도를 측정한다. 지질과산화 저해효능을 비교하기 위한 약물로 Trolox를 이용하였고 control은 시험 약물 대신에 DMSO를 사용하였으며, 3회 반복 측정하여 과산화지질의 생성을 50% 저해하는 데 필요한 시료의 농도(IC50)를 측정 하였다.
- 지표성분으로 dihydrokaempferol (DHK)과 3-O-methylquercetin(3-MeQ)을 선정하여 표준화를 실시하였으며 검출법 확립을 위한 정량분석은 Luna RP-18 칼럼(4.6×250 mm, 5 μm)을 이용하여 1% 인산용액과 아세토니트릴을 전개 용매로 사용하였다.
- 45 μm PVDF syringe filter로 여과하여 HPLC 분석에 사용하였다. 추출물은 감압여과 후 농축하고 건조해 에탄올 추출물을 수득하였으며 동일한 방법으로 총 3회 실시하였다.
- 이 추출물 50 g은 diaion HP-20을 고정상으로 사용하여 분획을 실시하였다. 칼럼에 사용한 용매는 30, 50, 70, 90, 100% 메탄올, CH2Cl2 : MeOH(50:50)의 혼합용매를 각각 2.5 L씩 이동상으로 사용하여 6개의 분획(OFS70E1~OFS70E6)으로 나누었다. 소분획 OFS70E3(1.
- 특이성 확인을 위하여 표준용액과 같이 시료 전처리 방법으로 처리하여 분석한 손바닥선인장 추출액의 크로마토그램을 설정한 파장 280 nm에서 DHK 피크가 분리되는지를 확인하였다. 그 결과 다른 물질과의 간섭 없이 성분이 분리되어 특이성을 확인할 수 있었다.
- 특이성: DHK와 3-MeQ의 표준용액과 손바닥선인장 에탄올 추출물을 HPLC로 분석하여 크로마토그램상의 retention time과 UV spectrum을 비교하였다.
대상 데이터
- HPLC 기기는 Waters 1500 Series System, Waters 2998 PDA Detector(Waters Corp., Worcester, MA, USA), Luna C18(5 μm, 250×4.6 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) 칼럼을 사용하였으며, 분석에 사용된 모든 용매는 J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)로부터 구입한 HPLC급 용매를 사용하였다.
- IC50 값은 자유라디칼 소거효 능을 계산하여 50% 소거효능을 나타내는 농도(IC50)를 의미한다. 대조 약물은 라디칼 소거제로 잘 알려진 quercetin, resveratrol, ascorbic acid를 사용하였으며, 데이터는 3회 실시한 평균값을 제시하였다.
- 다양한 조건에서 추출한 에탄올 추출물 OFSEs의 항산화 효능검색을 하였다. 대조 약물은 항산화제로 잘 알려진 quercetin, resveratrol, ascorbic acid, Trolox를 사용하여 검색하였으며, 결과는 Table 5에 나타내었다. DPPH 자유라디칼 소거 효능은 에탄올의 함량이 70% 이상 사용한 경우에 우수한 효능을 나타내고 있는데, 70℃에서 70% 에 탄올로 6시간 동안 추출한 경우 IC50 값이 1.
- 본 실험에 사용한 손바닥선인장은 2016년 3월에 제주도에서 줄기를 채취하여 세절한 후 열풍 건조하여 사용하였으며, 증거 시료(901-15-1603)는 한국과학기술연구원 표본실에 보관하고 있다. 손바닥선인장 에탄올 추출물의 validation에 사용한 DHK와 3-MeQ는 손바닥선인장 70% 에탄올 추출물에서 분리한 것으로 기기분석을 활용한 구조분석 후 에탄올 추출물의 지표성분으로 사용하였다.
- 손바닥선인장 추출에 사용한 에탄올은 95% 에탄올(Samchun Chemical, Gyeonggi, Korea)을 사용하였다. 제조공정의 추출조건을 검토하기 위하여 손바닥선인장 건시료 10 g에 70 mL의 50, 70, 80% 에탄올을 사용하여 70 및 80℃에서 3, 4, 5, 6시간 동안 각각 환류 추출한 후 종료시점에 상층액을 취하고 0.
- 체중 200±20 g의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐(오리 엔탈바이오, 경기)는 실험 전 24시간 동안 상수만을 공급하였다.
데이터처리
- 기울기 S는 분석대상물질의 검량선으로부터 구하였으며 표준편차(σ)는 정량한계 내에 있는 분석대상물질을 포함한 검체를 사용하여 특이적인 검량선을 작성한 후 y 절편의 표준편차를 표준편차 σ로서 이용하였다.
- 손바닥선인장 에탄올 추출물의 건강기능성 원료 개발을 위한 기준규격인정 및 품질관리 validation은 식품의약품안 전처의약품등의 분석법 validation 가이드라인에 기초하여 수행되었다(18). 표준품으로 사용한 DHK와 3-MeQ의 분석은 최대 흡광도를 나타내는 280 nm와 360 nm에서 각각의 크로마토그램을 3회 반복 실험하여 얻은 평균값으로 계산하여 검량곡선을 구하였다. DHK의 경우 y=10626x－14734, 상관관계(R2)=0.
이론/모형
- 15 M ice cold KCl 용액을 관류시켜 간 내의 혈액을 제거하여 간을 적출하고 간 무게 10배량의 KCl 용액을 가한 후 homogenizing 하여 간 균질액을 만들었다. 단백질 농도는 bovine serum albumin 을 표준품으로 하여 Bradford protein method에 의하여 정량하였다(20). 지질과산화 시험은 Sanz 등(21)의 방법을 약간 변형하여 이용하였다.
- 손바닥선인장 에탄올 추출물의 건강기능성 원료 개발을 위한 기준규격인정 및 품질관리 validation은 식품의약품안 전처의약품등의 분석법 validation 가이드라인에 기초하여 수행되었다(18). 표준품으로 사용한 DHK와 3-MeQ의 분석은 최대 흡광도를 나타내는 280 nm와 360 nm에서 각각의 크로마토그램을 3회 반복 실험하여 얻은 평균값으로 계산하여 검량곡선을 구하였다.
성능/효과
- 1H NMR에서 δ 5.84(1H, J=2.0 Hz)와 5.79(1H, J=2.0 Hz)의 doublet peaks는 A ring에서 기인하는 peak로 서로 meta coupling을 하고 있음을 알 수 있었으며, δ 4.89와 4.46에서의 peaks는 C ring에서 기인하는 peak로 coupling constants가 각각 11.6 Hz로 나타나 두 개의 수소는 trans 결합을 하는 flavanol 구조임을 알 수 있었다.
- 9998의 우수한 직선성과 intra-day와 inter-day 분석에서 97% 이상의 회수율과 3% 미만의 RSD를 나타내 정밀성과 정확성을 입증하였다. 3- MeQ의 검량선으로부터 상관계수(R2) 1의 우수한 직선성과 intra-day와 inter-day 분석에서 95% 이상의 회수율과 7% 미만의 RSD를 나타내 정밀성과 정확성을 입증하였다. DHK의 검출한계는 1.
- 그 결과 다른 물질과의 간섭 없이 성분이 분리되어 특이성을 확인할 수 있었다. 360 nm에서는 3-MeQ의 피크가 분리되는지를 확인한 결과 다른 물질과의 간섭 없이 성분이 잘 분리되어 특이성을 확인할 수 있었다. 표준용액 DHK의 머무름 시간(Rt)은 27.
- 7%로 낮은 수율을 보인다. 70℃에서 추출한 경우에도 에탄올의 함량이 낮을수록 높게 측정되었으며, OFS50E의 경우 20% 정도의 높은 수율을 나타내었다. 그러나 같은 용매를 사용하고 추출시간을 달리한 추출물 간의 수율은 추출시간과 무관한 수율을 나타내 효율적인 에탄올 추출물을 얻기 위한 추출 변수로 작용하지 못하였다.
- 본 연구에서 확립한 분석법으로 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 회수율을 검색하였다. DHK의 검량선으로부터 상관계수(R2) 0.9998의 우수한 직선성과 intra-day와 inter-day 분석에서 97% 이상의 회수율과 3% 미만의 RSD를 나타내 정밀성과 정확성을 입증하였다. 3- MeQ의 검량선으로부터 상관계수(R2) 1의 우수한 직선성과 intra-day와 inter-day 분석에서 95% 이상의 회수율과 7% 미만의 RSD를 나타내 정밀성과 정확성을 입증하였다.
- 76%를 나타내 6% 이내의 정밀성을 나타내었다. Inter-day 분석에서의 회수율은 95.9 ~115.2%를 나타내었으며, RE는 0.62~15.2%와 RSD는 0.08~6.37%로 나타나 정확성과 정밀성을 확인할 수 있었다.
- 표준용액들의 intra-, inter-day 분석의 정밀성, 정확성 및 회수율을 측정한 결과는 Table 3에 나타내었다. Intra-day 분석에서 회수율은 시료 면적을 검량선에 근거하여 회수되는 시료량을 백분율로 계산한 값이 97.0~115.9%의 범위로 나타났으며, RE는 DHK의 가장 낮은 농도를 제외하고 모두 10% 이내로 나타났고 RSD는 0.14~5.76%를 나타내 6% 이내의 정밀성을 나타내었다. Inter-day 분석에서의 회수율은 95.
- 50 mg/OFS 100 g으로 높은 함량을 나타내고 있다. OFS 50E와 OFS70E의 경우에도 높은 함량이 측정되었으며 추출 시간에 따른 함량 변화도 비교적 적게 나타났다. 한편 70% 에탄올을 사용하여 4시간 이상 추출할 경우에 지표물 질의 함량이 높은 추출물을 수득할 수 있으며, 80% 에탄올을 사용할 경우에는 6시간 이상 추출하는 것이 효과적일 것으로 예상한다.
- 특이성 확인을 위하여 표준용액과 같이 시료 전처리 방법으로 처리하여 분석한 손바닥선인장 추출액의 크로마토그램을 설정한 파장 280 nm에서 DHK 피크가 분리되는지를 확인하였다. 그 결과 다른 물질과의 간섭 없이 성분이 분리되어 특이성을 확인할 수 있었다. 360 nm에서는 3-MeQ의 피크가 분리되는지를 확인한 결과 다른 물질과의 간섭 없이 성분이 잘 분리되어 특이성을 확인할 수 있었다.
- 3에 나타내었다. 그 결과 손바닥선인장 70% 에탄올 추출물의 주성분은 360 nm 파장에서 최대 피크를 나타내고 있는 narcissin으로 나타났으며, 이는 칼럼으로 분리한 경우에도 가장 높은 함량을 나타내었으나 여러 종의 화합물이 중첩되어 나타나 지표물질로 사용하기에는 부적당한 것으로 생각한다.
- 10 mg/mL로 유사하게 나타나고 있다. 다만 50% 에탄올을 사용하여 추출한 추출물은 6시간으로 추출시간이 길어진 경우에 효능이 다소 감소하는 경향을 나타내었다. 그러므로 50% 에탄올을 사용 할 경우에는 4시간 이내로 추출하는 것이 효율적이라 사료된다.
- 29 mg/OFS 100 g의 함량을 나타내 가장 우수하게 나타났다. 다양한 OFSEs에 대하여 DPPH 자유 라디칼 소거효능과 쥐의 간 균질액을 이용한 지질과산화 저해 효능에 대한 항산화 효능은 지표물질의 함량이 가장 높은 70% OFSE에서 우수한 효능을 나타내 본 연구에서 확립한 원료 표준화를 위한 적합한 분석법임이 검증되었다. 따라서 본 연구를 통하여 HPLC-PDA를 이용한 손바닥선인장 에탄올 추출물의 DHK와 3-MeQ의 분석법은 개별인정형 건강 기능식품 기능성 원료 개발을 위한 유용한 자료로 활용될 것으로 생각한다.
- 그러므로 지표성분 함량이나 항산화 효능을 비교하여 적절한 용매와 온도를 설정하여 추출시간을 선정하는 것이 효율적인 추출물 제조를 위해 필요할 것으로 생각한다. 따라서 효율적인 추출물 제조는 80℃에서 6시간 동안 추출한 OFS70E가 가장 효율적인 추출조건으로 사료되며, OFSEs에서의 표준화를 위해서는 지표성분으로 DHK와 3-MeQ를 선정함이 타당할 것으로 생각한다.
- 본 시험법으로 분석한 지표물질의 함량은 80℃ 에서 추출한 70% OFSE가 DHK 26.42±0.65 mg/OFS 100 g, 3-MeQ 3.88±0.29 mg/OFS 100 g의 함량을 나타내 가장 우수하게 나타났다.
- 이상의 결과를 종합하면 손바닥선인장은 80℃에서 70% 에탄올로 추출한 OFSE가 DHK의 경우 26.42±0.65 mg/ OFS 100 g, 3-MeQ의 경우 3.88±0.29 mg/OFS 100 g으로 함량이 높게 측정되었으며, 지표물질의 함량이 높은 추출물에서 우수한 항산화 효능을 보인다.
- 쥐의 간 균질액을 이용하여 검색한 지질과산화 저해 효능 은 추출온도와 사용한 추출 용매 간에 효능 차이가 크게 없었으며 IC50 값이 0.87±0.14~0.99±0.10 mg/mL로 유사하게 나타나고 있다.
- 360 nm에서는 3-MeQ의 피크가 분리되는지를 확인한 결과 다른 물질과의 간섭 없이 성분이 잘 분리되어 특이성을 확인할 수 있었다. 표준용액 DHK의 머무름 시간(Rt)은 27.218분이고 3-MeQ의 머무름 시간(Rt)은 36.368분으로 나타나 손바닥선인장 추출액에서의 DHK의 머무름 시간(Rt) 27.219분과 3-MeQ의 머무름 시간 35.572분으로 피크 유지시간이 표준용액에서의 머무름 시간과 거의 일치하였다(Fig. 3).
- OFS 50E와 OFS70E의 경우에도 높은 함량이 측정되었으며 추출 시간에 따른 함량 변화도 비교적 적게 나타났다. 한편 70% 에탄올을 사용하여 4시간 이상 추출할 경우에 지표물 질의 함량이 높은 추출물을 수득할 수 있으며, 80% 에탄올을 사용할 경우에는 6시간 이상 추출하는 것이 효과적일 것으로 예상한다.
후속연구
- 다양한 OFSEs에 대하여 DPPH 자유 라디칼 소거효능과 쥐의 간 균질액을 이용한 지질과산화 저해 효능에 대한 항산화 효능은 지표물질의 함량이 가장 높은 70% OFSE에서 우수한 효능을 나타내 본 연구에서 확립한 원료 표준화를 위한 적합한 분석법임이 검증되었다. 따라서 본 연구를 통하여 HPLC-PDA를 이용한 손바닥선인장 에탄올 추출물의 DHK와 3-MeQ의 분석법은 개별인정형 건강 기능식품 기능성 원료 개발을 위한 유용한 자료로 활용될 것으로 생각한다.
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