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문제 정의
- 본 연구에서는 건강기능식품 원료 천연 유래 보존료(소르빈산, 안식향산 및 프로피온산)의 함량 분석을 위하여 대표적인 식품 유형 시료 매트릭스 3가지(액상, 분말, 오일)를 선정하여 각각의 매트릭스별 method validation을 실시하였다.
- 본 연구에서는 다양한 건강기능식품의 기능성 원료 및 부원료에 대하여 천연 유래의 보존료(소르빈산, 안식향산, 프로피온산)의 문헌상의 함유량을 조사하며, 국내 유통 건강기 능식품 원료 중 천연 유래 보존료의 검출 가능성이 있는 원료를 선정하고 수집하여 천연 유래 보존료의 함유량 조사를 시행하고자 하였다. 식품공전상의 보존료 시험법의 건강기능식품의 기능성 원료에 대한 유효성을 검증하기 위해 액체, 분말, 유지시료를 선정하여 이에 대한 직선성, 정확성, 정밀성, 회수율, 검출한계 및 정량한계에 대한 시험법 검증을 실시하였다.
제안 방법
- 3가지 보존료의 회수율 측정을 위해 검량선 내의 농도 2가지를 선택하여 소르빈산 및 안식향산이 함유되어 있지 않은 액체, 분말, 오일 제형의 시료에 표준물질을 첨가하고 이를 3회 반복 분석하여 평균값으로 회수율을 산출하였다.
- Benzoic acid는 precursor ion(m/z)이 121, fragment ion(m/z)은 77이고, DP(50), CE(16), CXP(13), EP(10)를 이용하여 분석하였다(Fig. 4).
- MRM 조건은 ESI mode(negative ion)에서 sorbic acid의 precursor ion (m/z)이 111.0, fragment ion(m/z)은 67, DP(40), CE(12), CXP(11), EP(10)를 이용하여 분석하였다(Fig. 3).
- Validation 항목으로는 직선성, 정밀성, 정확도, inter-day, intra-day 그리고 회수율을 측정하여 건강기능식품원료 중 천연 유래 보존료 함량 분석의 유효성과 신뢰성을 확보하였다.
- 본 연구에서는 식품공전에서 제시한 시료 전처리 방법(15)을 적용하여 3가지 보존료인 sorbic acid, benzoic acid 및 propionic acid을 LC-MS/MS와 GC-MS를 이용하여 정성 분석하였다. 개발된 정성 분석법을 이용하여 추가적인 정성을 확인하였다. Sorbic acid과 benzoic acid의 LC-MS /MS 분석 조건은 아래와 같다.
- 따라서 본 연구에서는 국내 유통 중인 건강기능식품 원료 중 천연 유래 보존료의 검출 가능성이 있는 원료를 선정･수집하여 천연 유래 보존료(안식향산, 소르빈산, 프로피온산)를 분석하고 유효성 검증을 위해 매트릭스별 method validation을 실시한 후 이를 적용하여 수집된 시료의 함유량을 조사하였다.
- 또한, propionic acid의 경우 GC-MS를 이용하여 추가적인 정성 분석을 하였다. 분석에 사용된 GC-MS는 Agilent 5973 MSD(Agilent Co.
- 또한, 프로피온산 분석은 FID가 장착된 GC(HP-6890, Agilent Co., Palo Alto, CA, USA)를 이용하였다. 칼럼은 HP-FFAP(30.
- 본 연구를 위해 건강기능식품공전에 수록(14)되어 있는 기능성 원료 중 천연 유래가 될 수 있는 시료 선정을 위해 시료 선정 원칙을 수립하고 세워진 선정 원칙에 따라 시료를 구분하여, 그중 확보 가능한 시료를 수집하였다. 수집한 시료는 건강기능식품 기능성 원료 중 고시형 35품목 122건, 개별인정형 31품목 48건이었으며 부원료는 14품목 42건으로 총 212건이었다.
- 본 연구에서는 식품공전에서 제시한 시료 전처리 방법(15)을 적용하여 3가지 보존료인 sorbic acid, benzoic acid 및 propionic acid을 LC-MS/MS와 GC-MS를 이용하여 정성 분석하였다. 개발된 정성 분석법을 이용하여 추가적인 정성을 확인하였다.
- Sorbic acid과 benzoic acid의 LC-MS /MS 분석 조건은 아래와 같다. 분석 장비는 HPLC(Shiseido Nanospace SI 2 HPLC System, Shiseido, Tokyo, Japan), API 5000(AB Sciex Co., Framingham, MA, USA)을 사용하였고, sorbic acid의 경우 HPLC 조건은 이동상 A가 10mM ammonium acetate를 포함한 10% acetonitrile, B는 10mM ammonium acetate을 포함한 90% acetonitrile을 사용하여 gradient를 사용 분석하였다. 분석 칼럼은 C18(2.
- 분석 칼럼은 C18(2.0×150 mm, 5 μm) 주입량이 5 μL이고, 칼럼 온도는 40°C, 유량은 0.2 mL/min으로 분석하였다.
- 분석에 이용된 칼럼은 HP-Innowax(30 m×0.32 mm×0.25 μm)를 사용하였으며, 주입구 온도는 220 °C, 오븐은 50°C 에서 2분간 유지 후 분당 5°C로 100°C까지 승온하고 2분간 유지하였다.
- 시료 중의 소르빈산 및 안식향산의 분석(15)을 위하여 PDA 검출기가 장착된 HPLC(Shiseido Nanospace SI 2 HPLC System, Shiseido, Tokyo, Japan)를 이용하였으며, 칼럼은 Capcellpak MF C8(4.6 mm×150 mm, 5 μm)을 이용하였다.
- 본 연구에서는 다양한 건강기능식품의 기능성 원료 및 부원료에 대하여 천연 유래의 보존료(소르빈산, 안식향산, 프로피온산)의 문헌상의 함유량을 조사하며, 국내 유통 건강기 능식품 원료 중 천연 유래 보존료의 검출 가능성이 있는 원료를 선정하고 수집하여 천연 유래 보존료의 함유량 조사를 시행하고자 하였다. 식품공전상의 보존료 시험법의 건강기능식품의 기능성 원료에 대한 유효성을 검증하기 위해 액체, 분말, 유지시료를 선정하여 이에 대한 직선성, 정확성, 정밀성, 회수율, 검출한계 및 정량한계에 대한 시험법 검증을 실시하였다. 3가지 유형에 대하여 직선성은 0.
- 6 mm×150 mm, 5 μm)을 이용하였다. 이동상은 A용액의 경우 0.025% TBA-OH(0.1% 인산), B용액의 경우 아세토니트릴을 사용하여 23분간 농도 구배를 실시하였으며, 검출파장은 217 nm로 200~600 nm 를 scan 하였다. 주입량은 10 μL로 하였으며, 칼럼의 온도는 40°C, 유속은 1.
- 주입구 온도는 220°C, 검출기 온도는 230°C였으며, 유속은 1.0 mL/min, 캐리어 가스는 질소를 이용하여 분석을 실시하였다(Table 2).
- 칼럼은 HP-FFAP(30.0 m×320 µm×0.25 µm, Agilent Co.)를 사용하였으며, 오븐 온도는 최초 100°C로부터 10°C/min으로 150°C까지 승온한 후 5분간 유지하고 다시 20°C/min으로 승온하여 230°C까지 승온하였다.
- 프로피온산 분석용 시험용액의 조제를 위해 따로 증류액 100 mL를 분액여두에 취하여 NaCl 10 g 및 인산 1 mL와 내부표준물질 1 mL를 가한 후 진탕하여 혼합하고 디에틸에테르 50 mL를 이용하여 2회 추출한 다음 디에틸에테르 층을 무수황산나트륨을 통과시켜 수분을 제거하고 40°C의 rotary vacuum evaporator(BUCHI Labortechnik AG, Flawil, Switzerland)를 이용하여 증발 건고한 후 아세톤을 이용하여 10 mL로 한것을 프로피온산 분석용 시험용액으로 하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, USA) 제품을 사용하였으며, 시료의 전처리 시사용되는 주석산, 수산화나트륨, 인산은 Junsei Chemical Co.(Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다. 아세톤, 디에틸에테르, 아세토니트릴 등은 J.
- 그 외의 시약은 모두 특급을 사용하였다. 또한, 시험법의 회수율 검증을 위하여 한국표준과학연구원의 안식향산 인증표준물질인 차음료(KRISS CRM No. 108-06-001, 안식향산=116.2 mg/kg)를 구매하여 사용하였다.
- 본 연구를 위해 수집된 시료는 총 80품목으로 구분하여 시료를 수집하였고 총 시료 수집건수는 212건이다. 이중 건강기능식품 기능성 원료 중 고시형 35품목에 해당하는 시료는 122건, 개별인정형 31품목에 해당하는 시료는 48건이었으며 부원료 14품목에 해당하는 시료는 42건으로 수집하여 함유량 조사를 실시하였다(Fig.
- 또한, propionic acid의 경우 GC-MS를 이용하여 추가적인 정성 분석을 하였다. 분석에 사용된 GC-MS는 Agilent 5973 MSD(Agilent Co.)가 장착된 HP6890을 이용하였다.분석에 이용된 칼럼은 HP-Innowax(30 m×0.
- 본 연구를 위해 건강기능식품공전에 수록(14)되어 있는 기능성 원료 중 천연 유래가 될 수 있는 시료 선정을 위해 시료 선정 원칙을 수립하고 세워진 선정 원칙에 따라 시료를 구분하여, 그중 확보 가능한 시료를 수집하였다. 수집한 시료는 건강기능식품 기능성 원료 중 고시형 35품목 122건, 개별인정형 31품목 48건이었으며 부원료는 14품목 42건으로 총 212건이었다.
- 80 mg/kg으로 산출되었다. 시료는 총 80품목 212건을 수집하여 분석을 하였다. 그결과 48품목 85건의 시료에서 보존료 성분이 검출되었다.
- (Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다. 아세톤, 디에틸에테르, 아세토니트릴 등은 J.T Baker사(Phillipsburg, NJ, USA) 제품을 사용하였으며, LC 분석용 이동상에 이용된 TBA-OH 시약은 Alfa Aesar사(Lancashire, UK) 제품을 사용하였다. 그 외의 시약은 모두 특급을 사용하였다.
- 본 연구를 위해 수집된 시료는 총 80품목으로 구분하여 시료를 수집하였고 총 시료 수집건수는 212건이다. 이중 건강기능식품 기능성 원료 중 고시형 35품목에 해당하는 시료는 122건, 개별인정형 31품목에 해당하는 시료는 48건이었으며 부원료 14품목에 해당하는 시료는 42건으로 수집하여 함유량 조사를 실시하였다(Fig. 6).
- 0 mL/mim 으로 하였다. 프로피온산 정성을 위한 정성 및 정량 이온은 m/z=45, 57, 74를 선정하여 분석하였다(Fig. 5).
성능/효과
- 식품공전상의 보존료 시험법의 건강기능식품의 기능성 원료에 대한 유효성을 검증하기 위해 액체, 분말, 유지시료를 선정하여 이에 대한 직선성, 정확성, 정밀성, 회수율, 검출한계 및 정량한계에 대한 시험법 검증을 실시하였다. 3가지 유형에 대하여 직선성은 0.99 이상의 높은 직선성을 보였으며, 정밀성은 일간과 일내에서 0.5~9.2%, 정확성은 84.0~123.9%의 정확성을 보였다. 회수율은 각각의 보존료에서 88.
- 소르빈산은 7건의 시료에서 검출되었으며, 안식향산은 60건, 프로피온산은 47건에서 검출되어 안식향산이 가장 높은 검출률을 보였다. 검출된 보존료 성분의 함량 분포는 소르빈산의 경우 10 mg/kg 이하가 5건, 50 mg/kg 이하가 1건, 500 mg/kg 이하가 1건 검출되었으며, 안식향산의 경우 10 mg/kg 이하가 36건, 50 mg/kg 이하가 14건, 100 mg/kg 이하 및 500 mg/kg 이하가 각각 4건이었으며, 500 mg/kg 이상 검출된 경우도 2건이었다. 프로피온산의 경우 10 mg/kg 이하가 25건, 50 mg/ kg 이하가 13건, 100 mg/kg 이하가 3건, 500 mg/kg 이하가 6건이 검출되어 시료에서 검출된 보존료의 함량은 10 mg/kg 이하가 다수를 차지하고 있었다.
- 시료는 총 80품목 212건을 수집하여 분석을 하였다. 그결과 48품목 85건의 시료에서 보존료 성분이 검출되었다. 전체 보존료 성분의 검출률은 40.
- 그중 소르빈산은 212건의 시료 중 7건의 시료에서 검출되어 3.3%의 검출률을 보였으며, 검출 범위는 1.57(아라비 아검)~341.51(알로에베라겔 농축분말) mg/kg, 평균검출량 59.61 mg/kg이었다. 안식향산의 경우 212건의 시료 중 60건에서 검출되어 28.
- 4%의 높은 회수율을 보였다. 또한, 인증표준물질을 이용한 회수율 시험에서도 98.3%의 회수율을 보였다(Table 6).
- 또한, 일간 시험(inter-day) 분석 결과 정밀도는 0.1~5.3%, 정확도는 86.5~107.6%로 확인되었으며, 프로피온산의 경우 검량선 내의 서로 다른 농도 3개(5, 20, 100 μg/mL, n=3)에 대한 결과는 정밀도는 0.7~9.2%, 정확도는 94.8~123.4%로 확인되었다(Table 5).
- 58 mg/kg으로 검출되었다. 부원료의 경우 총 42건 중 sorbic acid는 1건 검출(4.00 mg/kg), benzoic acid는 15건 검출 범위가 0.60~41.02 mg/kg, propionic acid는 7건 검출 범위가 1.58~173.23 mg/kg으로 분석 결과 확인되었다(Table 7).
- 1%였으며, 26건의 시료에서 중복의 보존료 성분이 검출되었다. 소르빈산은 7건의 시료에서 검출되었으며, 안식향산은 60건, 프로피온산은 47건에서 검출되어 안식향산이 가장 높은 검출률을 보였다. 검출된 보존료 성분의 함량 분포는 소르빈산의 경우 10 mg/kg 이하가 5건, 50 mg/kg 이하가 1건, 500 mg/kg 이하가 1건 검출되었으며, 안식향산의 경우 10 mg/kg 이하가 36건, 50 mg/kg 이하가 14건, 100 mg/kg 이하 및 500 mg/kg 이하가 각각 4건이었으며, 500 mg/kg 이상 검출된 경우도 2건이었다.
- 수집된 시료를 3가지 형태 고시형, 개별인정형, 부원료로 각각 분류하여 sorbic acid, benzoic acid 및 propionic acid의 분석 결과 고시형 건강기능식품 기능성 원료 분석 결과 122건 중 sorbic acid는 6건 검출 범위가 1.57~341.51 mg/kg, benzoic acid는 31건 검출 범위가 0.34~786.64 mg/kg, propionic acid는 26건이 검출되었으며 그 범위는 1.55~169.50 mg/kg으로 검출되었다. 개별인정형 건강기능식품 기능성 원료의 경우 총 48건 중 sorbic acid는 불검출, benzoic acid는 14건 검출 범위가 1.
- 수집한 시료의 검출률을 확인한 결과 80품목 212건의 시료에 대하여 소르빈산, 안식향산, 프로피온산을 분석한 결과총 48품목 85건의 시료에서 보존료 성분이 검출되어 전체 보존료 성분의 검출률은 40.1%였으며. 26건의 시료에서는두 가지 이상의 보존료 성분이 검출되었다.
- 식품공전에서 제시한 시료 전처리 방법과 분석조건(15)을 적용하여 HPLC-PDA로 sorbic acid, benzoic acid를 분석한 결과 217 nm(PDA scan range 200~600 nm) 파장에서 retention time이 4.9분, 6.4분에서 검출되었고, GC-FID를 이용하여 propionic acid를 분석한 결과 propionic acid는 5.2분, crotonic acid(IS)는 7.5분으로 확인되었다(Fig. 1, 2)
- 검출량의 분포를 보면 소르빈산의 경우 전체 검출 건수 7건 중 10 mg/kg 이하로 검출된 시료는 5건, 50 mg/kg 이하와 500 mg/kg 이하로 검출된 시료가 각각 1건으로 나타나 주로 10 mg/kg의 소량이 검출되는 것으로 보인다. 안식향산의 경우 전체 검출 건수 60건 중 10 mg/kg 이하로 검출된 시료는 36건, 50 mg/kg 이하가 14건, 100 mg/kg 이하 및 500 mg/kg 이하가 각각 4건, 500 mg/kg 이상이 2건으로 나타나 주로 50 mg/kg 이하 농도로 검출되는 것으로 나타났다(Fig. 7). 그중 591.
- 액상과 분말시료 중 검출한계와 정량한계는 0.05~1.30 μg/mL, 0.15~3.80 μg/mL, 오일의 경우 검출한계와 정량한계는 0.03~1.22 μg/mL, 0.10~3.54 μg/mL로 확인되었다(Table 3).
- 그결과 48품목 85건의 시료에서 보존료 성분이 검출되었다. 전체 보존료 성분의 검출률은 40.1%였으며, 26건의 시료에서 중복의 보존료 성분이 검출되었다. 소르빈산은 7건의 시료에서 검출되었으며, 안식향산은 60건, 프로피온산은 47건에서 검출되어 안식향산이 가장 높은 검출률을 보였다.
- 정확도 산출을 위해 3가지 식품 유형 액상, 분말, 오일 상에서 검량선 내의 서로 다른 농도 3개(0.5, 1.0, 5.0 μg/ mL, n=3)를 선정하여 일내 시험(intra-day)을 측정한 결과 정밀도는 0.5~6.6%, 정확도는 84.0~107.6%로 확인되었 으며, 프로피온산의 경우 검량선 내의 서로 다른 농도 3개 (5, 20, 100 μg/mL, n=3)에 대한 결과는 정밀도는 0.5~6.8 %, 정확도는 96.4~123.9%로 확인되었다(Table 4).
- 직선성 결과 액상과 분말 시료 중 검량농도의 범위는 소르빈산, 안식향산 각각 0.3~100 μg/mL, 프로피온산의 경우 5~100 μg/mL 범위로 분석하였으며 직선성 결과 R2 =0.99 이상의 결과를 확인하였다.
- 프로피온산의 경우 212건 중 47건에서 검출되어 22.2%의 검출률을 보였으며, 검출 범위는 1.55(루테인OS20%)~173.23(감초 추출분말) mg/ kg, 평균검출량 33.20 mg/kg으로 나타나 검출량의 범위가 매우 큰 것으로 나타났다(Table 7).
- 9%의 정확성을 보였다. 회수율은 각각의 보존료에서 88.7~98.9%를 나타냈고, 검출한계는 0.03~ 1.30 mg/kg, 정량한계는 0.10~3.80 mg/kg으로 산출되었다. 시료는 총 80품목 212건을 수집하여 분석을 하였다.
후속연구
- 프로피온산의 경우 10 mg/kg 이하가 25건, 50 mg/ kg 이하가 13건, 100 mg/kg 이하가 3건, 500 mg/kg 이하가 6건이 검출되어 시료에서 검출된 보존료의 함량은 10 mg/kg 이하가 다수를 차지하고 있었다. 본 연구 결과를 통하여 건강기능식품의 기능성 원료에 대한 천연 유래 보존료의 DB를 마련하고, 향후 건강기능식품 중 보존료의 천연 유래 여부 판단 시 근거 자료로 활용이 가능할 것이며, 국가 간의 교역 시 보존료 사용기준 위반 등으로 인한 무역마찰에 대한 기초자료로 활용이 가능할 것으로 판단된다.
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