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문제 정의
- 식품원료 및 발효·가공식품 중 안식향산, 소브산 및 프로피온산의 천연유래 함량 모니터링에 관한 연구들이 다수 보고되고 있으나 향신료를 대상으로 천연유래 보존료함량 분석에 관한 연구는 많지 않아 향신료의 천연유래 여부를 판단할 수 있는 기초자료 확보가 필요한 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 국내에 유통되고 있는 향신료를 대상으로 안식향산, 소브산 및 프로피온산에 대한 모니터링을 실시하여 천연유래 여부를 판단할 수 있는 근거자료를 마련하고자 하였다.
제안 방법
- 또한, 시험용액의 정성 확인에서 프로피온산 표준용액의 특성이온(m/z)간의 이온세기의 비(response ratio)와 시험용액의 이온세기의 비를 비교하여 이온세기의 비가 국제식품위원회(CODEX)에서 제시하는 ± 30%29)이내에서 일치하고 GCMS 크로마토그램 상의 피크 머무름 시간(retention time)인 4.1분과 일치할 때 정성 확인하였다.
- 이러한 결과는 본 연구의 분석법이 타당함을 보여준다. 분석 결과의 불검출(not detected, ND)은 정량한계에 희석배수를 곱한 값을 적용하여 그 이하는 불검출로 처리하였다. 안식향산과 소브산은 희석배수 10배를 적용하여 각각 0.
- 3 × σ/s, 10 × σ/s (σ: standard deviation, s: slop)로 기준을 구하였다. 분석 방법의 정확한 평가를 위한 분석성분의 회수율 시험은 흑후추와 강황 시료에 3가지 농도로 표준물질을 첨가한 후 전처리 과정을 거쳐 3회씩 분석하여 각 농도를 구한 다음 첨가 농도 대비 회수된 농도를 계산하여 회수율을 측정하였다.
- 시험법의 유효성 검증을 위하여 직선성(linearity), 검출한계(limit of detection)와 정량한계(limit of quantification), 회수율(recovery)을 구하였다. 유효성 검증에 관련된 실험은 모두 3반복으로 수행하였다.
- 45 μm syringe filter로 여과 후 시험용액으로 사용하였다. 시험용액의 검출 농도가 검량선 범위를 초과 하였을 경우에는 에탄올로 검량선 내의 농도가 되게 희석하여 재 측정하였다.
- 안식향산, 소브산 및 프로피온산 표준품 100 mg을 정밀히 칭량하여 100 mL 용량 플라스크에 각각 넣고 에탄올을 가하여 완전히 혼합 후 100 mL로 정용하여 1,000 mg/L가 되도록 하였다. 이를 에탄올로 희석하여 안식향산과 소브산은 표준용액의 농도가 0.
- 분석 결과의 불검출(not detected, ND)은 정량한계에 희석배수를 곱한 값을 적용하여 그 이하는 불검출로 처리하였다. 안식향산과 소브산은 희석배수 10배를 적용하여 각각 0.3 mg/L, 0.5 mg/L이하는 불검출로 처리하였고, 프로피온산은 희석배수 2배를 적용하여 0.32 mg/L이하는 불검출로 처리하였다(Table 4, Fig. 1).
- 안식향산과 소브산을 분석하기 위하여 LC-MS/MS를 사용하였고 분석용 컬럼은 Zorbax XDB-C18 (4.6 i.d. × 150 mm, 1.8 μm, Agilent co.)을 사용하였으며 온도는 40ºC로 설정하였다.
- 오븐 온도는 40ºC에서 180ºC까지 분당 26ºC씩 승온한 후 180ºC에서 3분간 정지하는 오븐 온도조건으로 설정하였고 주입구와 검출기의 온도를 140ºC로 설정하였다.
- 시험법의 유효성 검증을 위하여 직선성(linearity), 검출한계(limit of detection)와 정량한계(limit of quantification), 회수율(recovery)을 구하였다. 유효성 검증에 관련된 실험은 모두 3반복으로 수행하였다. 안식향산과 소브산은 0.
- 안식향산, 소브산 및 프로피온산 표준품 100 mg을 정밀히 칭량하여 100 mL 용량 플라스크에 각각 넣고 에탄올을 가하여 완전히 혼합 후 100 mL로 정용하여 1,000 mg/L가 되도록 하였다. 이를 에탄올로 희석하여 안식향산과 소브산은 표준용액의 농도가 0.05-1.0 mg/L가 되도록 조제하여 사용하였고 프로피온산은 0.1-100 mg/L가 되도록 조제하여 사용하였다.
- 4 mL/min으로 흘려주며 시료는 1 μL를 주입하여 분석하였다. 질량분석기는 전자충격이온화(electron-impact ionization, EI) 방식을 이용하였으며, 70 eV 이온화에너지를 사용하였고 특성이온(m/z)으로 74, 57, 45를 정성 및 정량 분석에 이용하였고 이온들 중 가장 감도가 높은 특성이온(m/z) 74를 정량이온으로 선택하여 정량하였다(Table 2). 또한, 시험용액의 정성 확인에서 프로피온산 표준용액의 특성이온(m/z)간의 이온세기의 비(response ratio)와 시험용액의 이온세기의 비를 비교하여 이온세기의 비가 국제식품위원회(CODEX)에서 제시하는 ± 30%29)이내에서 일치하고 GCMS 크로마토그램 상의 피크 머무름 시간(retention time)인 4.
- 프로피온산 분석에는 GC-MS를 이용하였고 분석용 컬럼은 HP-FFAP (0.32 mm I.d. × 30 m, 0.25 μm, Agilent co.)를 사용하였다.
- 향신료 중 안식향산, 소브산 및 프로피온산을 HPLC와 GC로 분석할 경우 향신료 자체 matrix의 간섭이 심해서 분석하기가 쉽지 않고, 좀 더 낮은 함량을 분석하기 위하여 LC-MS/MS (6410 Triple Quad; Agilent Co., Santa Clara, CA, USA)와 GC-MS (QP2010 Plus; Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 이용하여 기기분석 하였다. 안식향산과 소브산을 분석하기 위하여 LC-MS/MS를 사용하였고 분석용 컬럼은 Zorbax XDB-C18 (4.
대상 데이터
- 대상 시료는 식품공전에 명시된 식품원재료 분류에 따라 겨자, 계피, 고수열매, 몰약, 바질, 박하, 사프란, 산초, 월계잎, 육두구, 정향, 차조기, 후추, 쿠민, 강황 등의 향신료와 식품공전의 향신료 분류에 속하지는 않으나 일반적으로 향신료로 많이 쓰이는 마늘, 양파, 고추, 파프리카도 대상 시료로 선정하여 33종 493건을 구입하였다27). 시료의 구입은 전국 산지 및 유통현황을 파악하여 전국 주요 도시의 백화점, 대형마트, 외국인 마트 및 약재시장에서 2015년 4월부터 10월경 구입하였고, 분쇄기(Blixer 5 plus, Robot Coupe, Vincennes, France)를 이용하여 잘게 분쇄 후 −20ºC 냉동고에 보관하면서 보존료 함유량 분석에 사용하였다.
- 보존료 함량 조사를 위해 안식향산(benzoic acid, BA), 소브산(sorbic acid, SA), 프로피온산(propionic acid, PA) 표준품은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 전처리용 추출용매로는 에탄올(ethanol), 이동상 용매로는 아세토니트릴(acetonitrile)을 Merck사(Frankfurt, Germany)의 제품을 사용하였고, 테트라뷰틸암모늄(tetrabutylammonium hydroxide, TBA-OH), 인산(phosphoric acid)은 Sigma-Aldrich사(St.
- 시료의 구입은 전국 산지 및 유통현황을 파악하여 전국 주요 도시의 백화점, 대형마트, 외국인 마트 및 약재시장에서 2015년 4월부터 10월경 구입하였고, 분쇄기(Blixer 5 plus, Robot Coupe, Vincennes, France)를 이용하여 잘게 분쇄 후 −20ºC 냉동고에 보관하면서 보존료 함유량 분석에 사용하였다.
- Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 전처리용 추출용매로는 에탄올(ethanol), 이동상 용매로는 아세토니트릴(acetonitrile)을 Merck사(Frankfurt, Germany)의 제품을 사용하였고, 테트라뷰틸암모늄(tetrabutylammonium hydroxide, TBA-OH), 인산(phosphoric acid)은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 정제수는 Mili-Q ultrapure water purification system (US/A56210-857, Milipore Co.
- 정제수는 Mili-Q ultrapure water purification system (US/A56210-857, Milipore Co., Billerica, MA, USA)을 이용한 18 MΩ-cm 수준으로 정제수를 사용하였다.
데이터처리
- 유효성 검증에 관련된 실험은 모두 3반복으로 수행하였다. 안식향산과 소브산은 0.05-1.0 mg/L, 프로피온산은 0.1-100 mg/L의 농도에서 직선성을 평가하였으며, 각 농도별로 세기(intensity)를 측정하여 검량선을 작성하여 결과는 상관계수(correlation coefficient, r2)로 표현하였다. 검출한계와 정량한계는 3.
이론/모형
- 2 mL/min 유속으로 흘려주었고 injection volume 10 μL로 분석하였다. 질량분석기로는 전기 분무 이온화(electrospray ionization, ESI) 방식을 이용하였으며, MRM 조건은 안식향산의 precursor ion (m/z)이 121, product ion (m/z)은 77이었고 소브산의 precursor ion (m/z)이 111, product ion (m/z)은 67을 선정하여 분석하였고 이외의 product ion은 감도가 낮아서 선정에서 제외하였다. LC-MS/MS 크로마토그램 상의 피크 머무름 시간(retention time)은 안식향산은 2.
성능/효과
- 7%로 건조하지 않은 생 파슬리를 제외하고는 모든 품목에서 프로피온산이 검출되었다. 검출범위는 생강(ND-188.21 mg/L), 백후추(1.28-171.97 mg/L), 월계수(ND-75.97 mg/L), 자소엽(ND-58.86 mg/L), 마늘(ND-53.88 mg/L) 순으로 높은 검출범위를 보였다. 평균 검출량은 백후추가 51.
- 이러한 결과로 보아 다른 문헌과 비교해 보면 품목별로 검출량이 유사하거나 상이한 것을 알 수 있었다. 그러나 기존의 연구는 품목별로 1-3건 내외를 분석한 결과로 이번 연구에서는 품목별로 최소 2건에서 최대 42건을 조사하여 품목별 검출 범위의 신뢰성을 높였다고 할 수 있겠다.
- 향신료 중 안식향산 함량은 소브산이나 프로피온산보다 높은 농도로 검출된 품목 및 시료가 많았다. 소브산은 88건(17.8%)에서 검출되어 안식향산이나 프로피온산에 비해 불검출률이 가장 높았다. 정량 한계 이상 검출되면서 10 mg/L이하의 낮은 농도로 검출된 건수는 69건(14.
- 향신료 시료에 대해 소브산의 검출률, 검출범위 및 검출량 결과를 품목에 따라 Table 4에 나타내었다. 소브산은 향신료 493건 중 88건에서 검출되어 검출률은 17.8%이며 바질잎(ND-57.70 mg/L)과 정향(ND-16.90 mg/L)이 높은 검출범위를 나타내었으나 그 이외에 강황, 고추, 몰략, 바질 씨, 샤프란, 양파, 육두구, 자소엽 등은 7 mg/L이하로 낮게 검출되었다. 또한, 겨자, 고수, 로즈마리, 마늘, 바질잎, 백후추, 산초, 생강, 양파, 월계수, 캐러웨이씨, 커리잎, 코리앤더, 큐민, 타임, 파슬리, 파프리카, 호로파씨, 회향 등에서는 소브산이 검출되지 않았다.
- 999 이상으로 우수한 직선성을 나타내었다. 안식향산, 소브산, 프로피온산의 검출한계는 각각 0.01 mg/L, 0.015 mg/L, 0.05 mg/L, 정량한계는 각각 0.03 mg/L, 0.05 mg/L, 0.16 mg/L으로 측정되었다. 회수율은 안식향산의 경우 81.
- 안식향산, 소브산과 프로피온산의 직선성은 상관계수(r2)값이 0.999 이상으로 우수한 직선성을 나타내었다. 안식향산, 소브산, 프로피온산의 검출한계는 각각 0.
- 1에 나타내었다. 안식향산은 총 493건 중 165건(33.5%)에서 검출되었으며, 정량한계 이상 검출되면서 10 mg/L이하의 낮은 농도로 검출된 건수는 81건(16.4%)이었고 100 mg/L이상 높은 농도로 검출된 건수는 계피 27건, 정향 12건, 카더몬 2건 등 총 41건(8.3%)으로 계피에서 최대 391.99 mg/L이 검출되었다. 향신료 중 안식향산 함량은 소브산이나 프로피온산보다 높은 농도로 검출된 품목 및 시료가 많았다.
- 향신료 시료에 대해 안식향산의 검출률, 검출범위 및 검출량 결과를 품목에 따라 Table 4에 나타내었다. 안식향산은 향신료 493건 중 165건에서 검출되어 33.5%의 검출률을 보였으며, 계피(54.40-391.99 mg/L), 정향(54.10-263.18 mg/L)과 카더몬(ND-104.75 mg/L)이 향신료 시료 중 가장 높은 검출범위를 나타내었고, 고수, 고추, 램프잎, 로즈마리, 마늘, 몰약, 바질잎, 생강, 양파, 오레가노, 월계수, 육두구, 캐러웨이씨, 타임, 파슬리, 호로파씨 등에서는 안식향산이 검출되지 않았다. 평균 검출량은 계피가 167.
- 8%)에서 검출되어 안식향산이나 프로피온산에 비해 불검출률이 가장 높았다. 정량 한계 이상 검출되면서 10 mg/L이하의 낮은 농도로 검출된 건수는 69건(14.0%)이었고 100 mg/L이상 높은 농도로 검출된 건수는 없었으며, 바질잎에서 최대 57.7 mg/L이 검출되었다. 프로피온산은 총 493건 중 398건(80.
- 7%)이 검출되었고 많은 시료에서 정량한계 이상 검출되었다. 정량한계 이상 검출되면서 10 mg/L이하의 낮은 농도로 검출된 건수는 361건(73.2%)으로 검출률이 높았고 100 mg/L 이상 높은 농도로 검출된 시료는 생강 2건과 백후추 1건이었으며 건조하지 않은 생강에서 최대 188.21 mg/L이 검출되었다.
- 75 mg/L)이 향신료 시료 중 가장 높은 검출범위를 나타내었고, 고수, 고추, 램프잎, 로즈마리, 마늘, 몰약, 바질잎, 생강, 양파, 오레가노, 월계수, 육두구, 캐러웨이씨, 타임, 파슬리, 호로파씨 등에서는 안식향산이 검출되지 않았다. 평균 검출량은 계피가 167.15 mg/L으로 가장 높았으며, 그 다음 정향 134.89 mg/L, 카더몬 66.04 mg/L, 박하 15.58 mg/L 순으로 높게 검출되었다. 이러한 결과는 다류와 향신료 중의 안식향산을 분석한 Kim 등17)의 연구결과와 비교 시 계피, 정향, 박하, 강황, 고추는 모두 이번연구결과의 검출범위 안에 들며, 겨자, 후추, 생강, 월계수의 경우 이번 연구결과보다 더 높게 검출되었다.
- 88 mg/L) 순으로 높은 검출범위를 보였다. 평균 검출량은 백후추가 51.48 mg/L으로 가장 높았으며, 그 다음 생강, 자소엽, 월계수, 몰약 순으로 높게 검출되었다. 건강기능식품원료 중 천연 유래 보존료 함유량조사29)에서 박하와 계피 중 프로피온산 함량이 이번 결과와 유사한 검출량을 보였다.
- 향신료 시료에 대해 프로피온산의 검출률, 검출범위 및 검출량 결과를 품목에 따라 Table 4에 나타내었다. 프로피온산은 향신료 493건 중 398건에서 검출되어 검출률은 80.7%로 건조하지 않은 생 파슬리를 제외하고는 모든 품목에서 프로피온산이 검출되었다. 검출범위는 생강(ND-188.
- 16 mg/L으로 측정되었다. 회수율은 안식향산의 경우 81.8-106.9%, 소브산은 92.3-104.9%, 프로피온산은 90.4-112.1%의 범위로 측정되어 양호한 결과를 보였다(Table 3). 이러한 결과는 본 연구의 분석법이 타당함을 보여준다.
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