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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 Annona muricata 잎 추출물(Graviola Leaf Extracts, GLE)을 이용하여 화장품 소재로서의 가능성을 조사하고자 in vitro 상에서 항산화, 항균, 미백 및 주름 개선 효과 등을 분석하였으며, 더 나아가 in vivo 상에서 B16-F10 mouse melanoma cell에 대한 세포 생존율 및 melanin 생합성 억제 효과를 조사하여 보고하고자 한다.
- 본 연구에서는 Annona muricata 잎 추출물(Graviola Leaf Extracts, GLE)을 이용하여 화장품 소재로서의 가능성을 조사하고자 in vitro 상에서 항산화, 항균, 미백 및 주름 개선 효과 등을 실시하였으며, 더 나아가 in vivo 상에서 B16-F10 mouse melanoma cell에 대한 세포 생존율 및 melanin 생합성 억제 효과를 조사하여 살펴보았다. 항산화 능력에 대한 측정은 DPPH 분석 및 SOD 유사활성 측정을 통해 나타냈으며, 그 결과 GLE는 DPPH 저해 활성 및 SOD 유사활성에 있어서 농도 의존적으로 활성이 증가하였으며 또한 총 페놀 및 플라보노이드 함량에서는 각각 117 ± 0.
제안 방법
- 배양 후 각 well에 10 µL의 CCK-8 용액(Enzo Life Sciences, New York, USA)을 첨가하였다. 2 h 동안 CO2 incubator 안에서 반응을 시킨 뒤 Microplate Reader를 사용 하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 본 연구에서 사용된 그라비올라(Annona muricata, Philippines)는 필리핀에서 수입하여 사용하였다. Annona muricata 잎 시료를 100 g씩 정량하여 각각 ethanol 추출물은 10배 용량의 ethanol을 가하여 3일 동안 침지하고, 열수 추출물은 10배 용량의 증류수를 가한 후 고온가압 추출로 추출물을 제조하였다. 고온가압추출은 유리병에 분쇄 시료와 증류수를 혼합한 후 autoclave (WAC 60, Wise Clave, Korea)를 이용하여 121 ℃에서 4 h 동안 2회 반복 추출하였다.
- GLE에 의한 tyrosinase inhibition 효과를 측정하기 위하여 mushroom tyrosinase에 의한 L-tyrosine의 산화 정도를 측정하였다. Melanin의 생성은 melanocyte로부터 melanosome의 형태로 세포로부터 분비되어 표피를 구성하는 주변의 각질 세포(keratinocyte)로 이동하여 들어가게 된다[30,31].
- GLE의 B16-F10 melanoma cell에서의 세포 생존 능력을 발색측정으로 정량화하기 위해 WST [2-(4-lodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt] 분석을 통한 CCK-8 assay를 시행하였다. WST 분석은 tetrazolium 성분을 배양액에 첨가한 후 발색을 정량화하여 세포의 수, 증식 정도 등을 알 수 있는데, 이는 tetrazolium 성분이 세포 내의 미토콘드리아가 가진 탈수소효소에 의해 특정 색으로 변하게 되어 발색 정도에 따라서 세포 내의 미토콘드리아의 활성도를 알 수 있다[34].
- GLE의 농도에 따른 B16-F10 mouse melanoma cell의 생존율을 측정하기 위해 cell viability assay를 실시하였다. 100 µL (5,000 cells/ well)의 세포 부유액을 96 well plate에 분주 후, CO2 incubator 안에서 24 h 동안 전 배양(pre-incubation)을 한 후, 농도별로 희석한 시료 10 µL를 처리한 후 12 h 동안 배양하였다.
- 또한, 피부색소형성의 주요 원인인 자외선에 의해 발생한 활성산소가 피부색소 형성을 촉진한다는 메커니즘이 밝혀지면서 이들 활성산소를 소거하는 것이 melanin 색소 형성억제에 효과적이라는 연구보고가 있다[15,16]. GLE의 전자공여능을 측정하기 위해 DPPH 라디칼 소거 활성 측정을 수행하였다. GLE의 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 증가하였으며, 각각의 농도별 7.
- Tyrosinase 활성 억제 효과가 있는 GLE가 melanin 생성에 어떠한 영향을 미치는가를 알아보기 위해, B16-F10 melanoma cell에 GLE 추출물을 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 µg/mL의 농도별로 48 h 처리한 후, 세포 내에 생성된 melanin의 함량을 측정하였다(Figure 6).
- Annona muricata 잎 시료를 100 g씩 정량하여 각각 ethanol 추출물은 10배 용량의 ethanol을 가하여 3일 동안 침지하고, 열수 추출물은 10배 용량의 증류수를 가한 후 고온가압 추출로 추출물을 제조하였다. 고온가압추출은 유리병에 분쇄 시료와 증류수를 혼합한 후 autoclave (WAC 60, Wise Clave, Korea)를 이용하여 121 ℃에서 4 h 동안 2회 반복 추출하였다. 각각의 추출액은 여과지(Whatman No.
- 이들은 전통적으로 씨를 빻아 기생충을 없애는 데 사용하였다. 또한, 열을 낮추거나 출산 이후의 모유를 증가시키고 설사와 이질을 지혈하는 면역기능 개선보조나 면역 체계 강화를 위해 사용하였다. 특히 Annona muricata 잎은 항암, 진정제, 항경련제 그리고 저혈압제로 사용하였다[3-5].
- 멸균된 TSA 배지에 각각의 Bacillus subtilis PM125, MRSA CCARM3089, MRSA CCARM3115 그리고 MRSA CCARM3561 배양액 100 µL를 도말한 후, paper disc (직경 8 mm)를 plate에 놓고 500 µg/disc의 농도로 disc에 50 µL씩 흡수시키고 37 ℃ incubator에서 18 h 배양시켰다.
- 멸균된 TSA 배지에 각각의 Bacillus subtilis PM125, MRSA CCARM3089, MRSA CCARM3115 그리고 MRSA CCARM3561 배양액 100 µL를 도말한 후, paper disc (직경 8 mm)를 plate에 놓고 500 µg/disc의 농도로 disc에 50 µL씩 흡수시키고 37 ℃ incubator에서 18 h 배양시켰다. 배양 후 disc 주변에 생성된 clear zone의 크기로 활성을 측정하였다.
- 적정 농도별로 희석한 시료 20 µL와 WST working solution 200 µL를 첨가한 후, enzyme working solution을 20 µL 첨가하여 37 ℃, 20 min 반응 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 kit의 계산법에 따라 SOD 활성을 측정하였다(식 (2)).
- 총 페놀의 함량은 Folin-Ciocalteu 방법[8]을 일부 변형하여 측정하였다. 시료(10 mg/mL) 100 µL에 2% Na2CO3 용액 2 mL를 첨가 후, 3 min 간 실온에 정치한 다음, 50% Folin-Ciocalteu reagent (Sigma Co.
- 총 플라보노이드 함량은 Davis 방법[9]을 일부 변형하여 측정하였다. 시료(10 mg/mL) 100 µL에 diethylene glycol 용액 1 mL를 첨가후, 1 N NaOH 100 µL을 첨가하여 37 ℃, 1 h 반응시킨 후, 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 시료(10 mg/mL) 100 µL에 diethylene glycol 용액 1 mL를 첨가후, 1 N NaOH 100 µL을 첨가하여 37 ℃, 1 h 반응시킨 후, 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 naringin (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을 표준시약으로 검량곡선을 작성하고 그에 대한 당량으로 환산하였다.
대상 데이터
- B16-F10 mouse melanoma cell은 한국 세포주 은행에서 분양받아 사용하였으며, 100 units/mL penicillin-streptomycin과 10% FBS가 함유된 DMEM (Gibco, USA) 배지에서 37 ℃, 5% CO2 incubator로 배양하여 실험에 사용하였다.
- 측정에 사용한 균주는 다음과 같다. Gram-positive bacteria로는 Bacillus subtilis PM125을 항생제 내성 균주로는 Methicillin Resistance Staphylococcus aureus (MRSA) CCARM3561, CCARM3115, CCARM3089 균주를 항생제 내성 균주 은행(Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes, CCARM)에서 분양받아 사용하였다. 각각의 Bacillus subtilis PM125, MRSA CCARM3089, MRSA CCARM3115 그리고 MRSA CCARM3561은 37 ℃, Tryptic soy broth, TSB (Merck & Co.
- 본 연구에서 사용된 그라비올라(Annona muricata, Philippines)는 필리핀에서 수입하여 사용하였다. Annona muricata 잎 시료를 100 g씩 정량하여 각각 ethanol 추출물은 10배 용량의 ethanol을 가하여 3일 동안 침지하고, 열수 추출물은 10배 용량의 증류수를 가한 후 고온가압 추출로 추출물을 제조하였다.
- 2 mM DPPH 용액을 준비하고 농도별로 조제한 시료용액 50 µL에 DPPH stock 용액을 500 µL 넣어 total volume이 1 mL가 되도록 ethanol을 첨가하여 실온에서 30 min 간 반응시킨 후, 96 well plate에 넣어 ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시료로는 L-Ascorbic acid (Sigma chemical Co., Louis, MO, USA)를 사용하였으며 시료의 최종농도는 1 mg/mL가 되도록 제조하였다. 각 시료의 항산화 활성은 시료 첨가구와 무첨가구 간의 흡광도 차이를 백분율(%) 로 나타내었다(식 (1)).
데이터처리
- 통계적 유의성은 Student’s t-test로 하였으며, p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다.
이론/모형
- Free radical scavenging activity를 측정하기 위하여 2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 방법을 사용하였다. DPPH 8 mg을 ethanol 100 mL에 녹여 0.
- GLE의 superoxide dismutase (SOD) 유사활성 측정은 Marklund & Marklund (1975)를 응용한 SOD assay kit (Dojindo Molecular Technologies, Inc., USA)를 이용하여 superoxide anion radical (O2)의 소거 활성률을 측정하였다[7].
- GLE의 항균력은 disc 확장법[10]으로 측정하였다. 측정에 사용한 균주는 다음과 같다.
- 표준물질인 ampicillin과 GLE의 항균 활성은 paper disc법으로 측정하여 나타냈으며, 이때 사용된 균주는 Gram-positive인 B. subtilis PM125, 항생제 내성균주인 MRSA CCARM3089, MRSA CCARM3115 그리고 MRSA CCARM3561과 같다. MRSA CCARM3089에 대해서는 항균 활성을 보이지 않았으며, 나머지에 대해서는 MRSA CCARM3115 > MRSA CCARM3561 > B.
성능/효과
- 실험 결과 L-tyrosine을 DOPA로 바꾸는 데 관여하는 tyrosinase의 활성에 해당하는 결과는 Figure 4(a)와 같다. GLE와 표준물질인 arbutin의 tyrosinase 저해 활성은 농도 의존적으로 활성을 억제하는 경향을 나타내었다. 농도별 tyrosinase 활성 결과는 GLE 100, 125, 200, 250 µg/mL에서 각각 95.
- GLE와 표준시료인 ursolic acid 경우 같은 농도인 50 µg/mL의 농도에서 각각 10.5 ± 1.87%, 56.5 ± 0.7% 저해 활성을 나타냈으며, 표준시료인 ursolic acid에 비해 비교적 낮은 저해 활성 결과를 나타냈지만, 미백과 함께 주름 개선 효과에 영향을 미치는 좋은 소재임을 확인할 수 있었다.
- GLE의 농도 변화에 따른 세포의 생존율을 확인한 결과, 100 µg/mL의 농도까지는 94.7% 이상의 세포 생존율을 확인하였으나 그 이상의 농도에서 세포 독성을 보임을 확인하였다(Figure 5).
- GLE의 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 증가하였으며, 각각의 농도별 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125, 250, 500, 1000 µg/mL에서 7.73, 12.78, 15.82, 20.3, 27.25, 33.7, 55.33%의 라디칼 소거능을 나타내었으며, 대조군인 Ascorbic acid의 1000 µg/mL의 87.19%보다는 낮았지만 Ascorbic acid의 5.56, 12.15% 보다는 높은 활성도를 나타내었다(Figure 2).
- MRSA CCARM3089에 대해서는 항균 활성을 보이지 않았으며, 나머지에 대해서는 MRSA CCARM3115 > MRSA CCARM3561 > B. subtilis PM125의 순으로 활성을 나타내었다.
- Melanin 생합성 저해능은 농도가 증가함에 따라 감소하는 경향을 보였으며, 세포 독성을 보이지 않는 최대 농도인 100 µg/mL에서 76.7%의 저해능을 나타내었다.
- 4%로 나타내었고, 농도 의존적으로 활성을 억제하는 것을 확인하였다. 결과적으로 GLE는 기질로서 L-DOPA가 관여하는 반응보다 L-tyrosine 관여 반응에서 효소 활성 억제 능력을 더 크게 보여주었으며, 이는 melanin 생성에 있어 초기 속도결정 단계를 늦추는 것으로 알려져 있는 L-tyrosine을 DOPA로 바꾸는 반응에서 크게 작용함을 확인할 수 있었다.
- 그 결과 GLE는 농도 의존적으로 melanin 생합성 억제 효과를 나타내었으며, 세포 독성을 보이지 않는 최고 농도 100 µg/mL에서 76.7%의 melanin 억제 효과를 확인하였다.
- Louis, MO, USA)과 GLE의 항균 활성을 paper disc법으로 측정하여 clear zone의 크기를 비교한 결과는 Table 3에 나타내었다. 그 결과를 살펴보면 Gram-positive인 B. subtilis PM125에 대하여 항균 활성을 나타내었고 이들은 ampicillin에서 37 mm, GLE에서 20 mm clear zone을 나타내었다. 항생제 내성균 주인 MRSA CCARM3089에 대해서 GLE는 항균 활성을 보이지 않았으며, MRSA CCARM3115, CCARM3561에 대해서는 항균 활성을 나타내었다.
- 농도별 tyrosinase 활성 결과는 GLE 100, 125, 200, 250 µg/mL에서 각각 95.1 ± 2.1%, 85.5 ± 1.1%, 71.5 ± 2.0%, 68.7 ± 1.4%의 효소활성을 나타내었다.
- 농도별 결과는 GLE 100 µg/mL에서 11.5%, 200 µg/mL에서 23.4%로 나타내었고, 농도 의존적으로 활성을 억제하는 것을 확인하였다.
- Gupta 등[17]의 연구에 따르면 Superoxide dismutase(SOD)는 생체 내에서 superoxide radical을 산소로 산화시킴으로써 활성산소를 안정한 물질로 전환시켜 신소상해로부터 생체를 보호하는 작용을 나타내는 효소이고 이러한 효소의 작용으로 인해 산화방지는 물론 노화억제와도 밀접한 관계가 있다고 알려져 있다. 농도에 따른 GLE의 SOD 유사활성능을 측정한 결과, 각 추출물의 모든 농도에서 SOD 유사활성능이 있었으며 농도에 비례하여 높게 나타났다(Table 1). 8 µg/mL의 농도에서 11.
- 더 나아가 in vivo 상에서 B16-F10 mouse melanoma cell에 대한 세포 생존율을 조사한 결과, 200 µg/mL의 농도에서 74.9%, 500 µg/mL의 농도에서 44.5%로 세포 독성을 나타냈으며, 세포를 이용한 향후 추가 실험에서는 GLE가 독성을 보이지 않는 100 µg/mL 이하의 농도에서 실험을 진행하는 것이 적절하다고 판단하였다.
- subtilis PM125의 순으로 활성을 나타내었다. 미백 효과 역시 tyrosinase 저해 활성 측정을 통해 진행하였으며, 그 결과 시료의 농도가 증가함에 따라 tyrosinase 활성이 감소하는 것으로 나타났다. 시료의 농도에 따른 L-tyrosine을 DOPA로 바꾸는 데 관여하는 hydroxylation 반응과 관련한 mushroom tyrosinase의 저해 활성은 표준물질인 arbutin에 비해 125∼250 µg/mL 농도 범위에서 특히 억제 효과를 높게 나타내었다.
- 시료의 농도에 따른 L-tyrosine을 DOPA로 바꾸는 데 관여하는 hydroxylation 반응과 관련한 mushroom tyrosinase의 저해 활성은 표준물질인 arbutin에 비해 125∼250 µg/mL 농도 범위에서 특히 억제 효과를 높게 나타내었다.
- 3 mg로 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 기존의 다른 연구에서 제시된 물질들과의 비교를 통해 천연 항산화제를 포함한 기능성 소재로서 충분한 이용가치가 있음을 확인할 수 있었다.
- 시료의 농도에 따른 L-tyrosine을 DOPA로 바꾸는 데 관여하는 hydroxylation 반응과 관련한 mushroom tyrosinase의 저해 활성은 표준물질인 arbutin에 비해 125∼250 µg/mL 농도 범위에서 특히 억제 효과를 높게 나타내었다. 주름 생성과 관련하여서는 elastase 저해 활성 측정을 통해 진행하였으며, 그 결과 동일한 농도에서 GLE 및 표준시료 ursolic acid는 10.5, 56.5%로 나타났다. 더 나아가 in vivo 상에서 B16-F10 mouse melanoma cell에 대한 세포 생존율을 조사한 결과, 200 µg/mL의 농도에서 74.
- 특히 GLE 125∼250 µg/mL 농도에 서의 효소 활성 억제는 대조군인 arbutin보다 더 큰 활성 억제를 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 항산화 능력에 대한 측정은 DPPH 분석 및 SOD 유사활성 측정을 통해 나타냈으며, 그 결과 GLE는 DPPH 저해 활성 및 SOD 유사활성에 있어서 농도 의존적으로 활성이 증가하였으며 또한 총 페놀 및 플라보노이드 함량에서는 각각 117 ± 0.4 mg, 254 ± 1.3 mg로 나타났다.
- subtilis PM125에 대하여 항균 활성을 나타내었고 이들은 ampicillin에서 37 mm, GLE에서 20 mm clear zone을 나타내었다. 항생제 내성균 주인 MRSA CCARM3089에 대해서 GLE는 항균 활성을 보이지 않았으며, MRSA CCARM3115, CCARM3561에 대해서는 항균 활성을 나타내었다. 이들은 500 µg/mL의 GLE에서 각각 30, 26 mm의 clear zone을 나타내어 표준물질인 ampicillin과 비교하여 높은 항균 활성을 나타내었다.
후속연구
- 반면 200 µg/mL의 농도에서 74.9%, 500 µg/mL의 농도에서 44.5%까지 감소하여 세포에 독성을 보이므로, 세포를 이용한 이 후 추가 실험에서는 GLE가 독성을 보이지 않는 100 µg/mL 이하의 농도에서 실험을 진행하는 것이 옳은 것으로 사료된다.
- 27 mg/g) 등과 비교하여 매우 높은 것으로 분석되었다. 본 실험 결과에 따라 GLE의 폴리페놀 항산화 효능을 입증하는 것으로 천연 항산화제 화장품 소재로서 이용 가치가 있을 것으로 판단된다.
- 7%의 저해능을 나타내었다. 이러한 실험 결과를 바탕으로 Annona muricata 잎 추출물(Graviola Leaf Extracts, GLE)이 항산화 및 미백 활성에 상당한 효과가 있음을 확인할 수 있었으며, 미백 화장품 성분으로서 과색소침착 치료에 유용할 것으로 기대된다.
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