[논문]활성 산소종으로 야기된 산화스트레스에 대한 와송 추출물의 신경세포 보호효과 및 주요 생리활성물질

박수빈; 이두상; 강진용; 김종민; 박선경; 강정은; 권봉석; 박상현; 이창준; 이욱; 허호진

doi:10.9721/kjfst.2017.49.5.524

활성 산소종으로 야기된 산화스트레스에 대한 와송 추출물의 신경세포 보호효과 및 주요 생리활성물질
Protective effect on neuronal cells of Orostachys japonicus A. Berger extract against reactive oxygen species-induced neuronal cytotoxicity and active compounds 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.49 no.5, 2017년, pp.524 - 531

초록
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본 연구에서는 와송(Orostachys japonicus A. Berger)의 산화방지 효과와 산화스트레스로부터의 신경세포 손상에 대한 보호효과 및 주요 생리활성물질을 분석하였다. 와송 아세트산에틸 분획물(ethylacetate fraction from Orostachys japonicus A. Berger extract: EFOJ)은 다른 분획물보다 높은 총 페놀화합물 함량을 나타냈으며, 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)로 ABTS, DPPH 라디칼 소거 활성과 FRAP 검정 및 지방질과산화물 억제력 분석을 실시한 결과, 우수한 라디칼 소거 활성, 총산화방지력과 과산화 지방질 생성물의 억제력을 확인하였다. 또한 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)은 과산화수소로 인한 신경세포 사멸에 대한 세포 생존율을 향상시켰으며, 신경 세포막 손상을 보호하는 능력이 우수한 것을 확인하였다. 이러한 생리 활성을 가진 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 주요물질을 분석하기 위하여 $LC-MS^e$를 실시하였으며, 주요 생리활성 물질은 퀘세틴 배당체와 캠페롤 배당체로 추정되었다. 본 연구 결과들을 바탕으로, 와송 추출물은 우수한 산화방지력을 가지고 있을 뿐만 아니라 산화적 스트레스로부터의 신경세포 보호효과를 통해 퇴행성 신경질환과 같은 질병을 예방 할 수 있는 건강기능성식품의 천연산화방지제 소재로써 고부가 가치가 있다고 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The study aimed to investigate the antioxidant activity and neuroprotective effect of the ethyl acetate fraction from Orostachys japonicus A. Berger extract (EFOJ) and its main constituent compounds. Among all fractions, the highest content of total phenolics was found in EFOJ. The antioxidant activity of EFOJ was confirmed through the 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS), 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), ferric reducing antioxidant power (FRAP) assays and the inhibitory effect of malondialdehyde (MDA). In addition, we ascertained that EFOJ not only decreased the intracellular ROS level, but also protected the neuronal cells against $H_2O_2$-induced oxidative stress. In liquid chromatography-mass spectrometry analysis, the following were found to be the main compounds of EFOJ: quercetin-3-O-glucoside, kaempferol-3-O-rutinoside, kaempferol-3-O-glucoside, and kaempferol-3-O-rhamnoside. Consequently, these results suggested that the protective effect on neuronal cells was based on the antioxidant activities of the physiologically active compounds of Orostachys japonicus A. Berger extract, which could therefore help to mitigate neurodegenerative diseases.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이에 반해, 와송의 산화스트레스에 의한 신경세포 손상의 보호효과에 대한 연구는 상대적으로 미비한 실정이다. 그러므로 본 연구에서는 와송 아세트산에틸 분획물의 in vitro 산화방지 활성 및 과산화수소로 유도된 산화 스트레스에 대한 신경세포 보호 효과를 검증하고, 고성능 액체 크로마토그래피 사중극 비행시간 질량 분광법(UPLC-QTOF/MS)을 이용하여 주요 생리활성 물질 분석을 통해서 와송 추출물의 고부가 자연 산화방지제로서의 이용 가능성을 검토하고자 하였다.
뇌 조직은 뇌신경세포의 신호전달 기능으로 인해 높은 함량의 불포화 지방산을 함유한 조직일뿐만 아니라 낮은 함량의 체내 산화방지 효소를 가지고 있어 활성 산소종의 존재에 매우 취약한 부위이다(2). 본 연구에서는 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)이 산화적 스트레스에 대한 지방 질과산화물 생성 억제효과를 측정하기 위하여 ICR 쥐에서 적출한 뇌 조직을 사용하여 실험을 진행하였다(Fig. 5). 와송 아세트 산에틸 분획물(EFOJ)의 1,000 μg/mL 농도에서 70.
본 연구에서는 와송(Orostachys japonicus A. Berger)의 산화방지 효과와 산화스트레스로부터의 신경세포 손상에 대한 보호효과 및 주요 생리활성물질을 분석하였다. 와송 아세트산에틸 분획물(ethylacetate fraction from Orostachys japonicus A.

제안 방법

24시간 방치 후, 200 μM 과산화수소를 3시간동안 반응시켰으며 대조구(control)에는 동일양의 인산완충식염수(phosphate buffer saline, PBS, pH 7.4)을 처리하였다.
PC12 신경세포를 1.0×104 cells/well로 분주하 였고, 샘플 및 양성대조구인 비타민C (200 μM)를 PC12 신경세 포에 처리하였다.
PC12 신경세포를 25 mM HEPES, 25 mM 탄산수소소듐, 10% 소태아혈청, 50 units/mL 페니 실린 및 100 mg/mL 스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640 배지에 접종하여 37°C, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
PC12 신경세포에 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)을 48시간동안 전 배양한 후, 200 μM 과산화수소를 처리하고 대조구에는 동일양의 인산완충식염수를 처리하였다.
그 후 3시간 배양하고, 5분간 원심분리(250×g)하여 100 μL 상층액을 새로운 well로 옮긴후 LDH 분석키트(Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 세포막 손상효과를 측정하였다.
2 거름종이 (Whatman Inc, Kent, UK)로 여과하여 농축하였다. 그 후 3차 증류수에 녹인 후, 동일한 비율의 노말헥세인(n-hexane)을 이용하여 극성차이로 분획하였고, 남은 3차 증류수 층은 클로로폼(chloroform) 및 아세트산에틸(ethylacetate: EtOAC) 용매를 사용하여 순차적으로 각각 분획하였다(Fig. 1). 각 분획물은 농축하여 냉동건조 시킨 후, −20 °C에서 보관하여 실험에 사용하였다.
뇌 조직을 이용한 지방질 과산화 생성물인 MDA 생성 억제활성측정은 Chang 등(11)의 방법을 변형하여 사용하였다. ICR(Institute of Cancer Research) 쥐(8주령, 숫컷)는 실험동물 공급업체(Santako, Osan, Korea)로부터 구입하여 7일간의 환경적응기간을 유지했다.
18%의 세포 생존율을 나타냈다. 다음으로, 세포막 손상에 대한 와송 아세트산에틸 분획물의 보호효과에 대한 효과를 알아보기 위하여 락트산수소떼기효소 실험을 진행하였다 (Fig. 7(B)).
뛰어난 산화방지 활성에 기인한 신경세포 보호효과를 가진 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)에 존재하는 주요 생리활성 물질을 확인하기 위하여 고성능 액체 크로마토그래피 사중극 비행시간 질량 분광법(UPLC-QTOF/MS)을 실시하였으며, 와송 아세트 산에틸 분획물(EFOJ)에서 얻어진 총 이온 크로마토그램(total ion chromatogram)의 peak들에 대해 상대적 함량의 50% 이상의 화합물을 주요물질로 판단하여 해당 물질 peak에 대한 질량 스펙트럼 분석을 통해 순차적으로 MS^e 분석을 진행하였으며, 결과는 Fig. 8과 같다. 음이온모드 [M-H]⁻ : 화합물 A, 463 m/z (머무름시간(retention time, RT): 5.
비형광 화합물인 DCF-DA가 탈 에스터화 과정을 거쳐 세포 내로 들어가게 되면, 세포 내 존재하는 활성 산소종에 의해 형광 물질인 DCF로 산화되는 원리(17)를 이용하여 PC12 신경세포에 있어 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 과산화수소로 유도된 활성 산소종 생성 억제 효과를 측정하기 위한 DCF-DA 실험을 진행하였으며, 실시한 결과는 다음과 같다(Fig. 6).
살아있는 세포는 미토콘드리아의 전자전달계를 통하여 생존에 필요한 에너지를 생산하는데, 세포 내의 환원 효소에 의해 쉽게환원되는 MTT의 색 변화를 통하여 미토콘드리아의 전자전달능력 및 세포의 활성 정도를 측정하여 세포 생존률을 확인할 수 있는 MTT assay(19)를 진행하였으며, 과산화수소로 유도된 산화적 스트레스 상태에서 PC12 신경세포의 생존율에 대한 와송 아세트 산에틸 분획물(EFOJ)의 효과를 MTT assay로 측정한 결과는 Fig.7(A)와 같다. 과산화수소를 처리한 그룹에서는 대조구와 대비하여 86.
혼합용액에 7% 탄산소듐(Na₂CO₃)용액 10 mL을 넣어 혼합한후, 3차 증류수로 25 mL 정량하였다. 상온에서 2시간 방치 후, 분광광도계(UV-spectrophotometer, Libra S32PC, Biochrom Ltd., Cambridge, UK)를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 측정된 흡광도는 갈산(gallic acid) 보정곡선을 이용하여 총 페놀화합물 함량을 환산하였다.
시료는 메탄올에 용해시킨 후 0.2 μm 필터로 여과하여 사용하였으며, ACQUITY UPLC BEH C18 column (2.1×100 mm, 1.7 μm particle size; Waters Corp.)으로 유속 0.4 mL/min 조건으로 생리활성 물질의 UPLC 분석하였다.
시료용액 20 μL에 흡광도 값을 맞춘 ABTS 용액 980 μL를 혼합하여 37°C에서 10분간 반응시킨 후, 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.
와송 아세트산에틸 분획물(ethylacetate fraction from Orostachys japonicus A. Berger extract:EFOJ)을 PC12 신경세포에 24시간동안 전 배양한 후, 200 μM 과산화수소를 3시간동안 처리하였으며 대조구에는 동일양의 인산완충식염수를 처리하였다.
4 mL/min 조건으로 생리활성 물질의 UPLC 분석하였다. 이동상 용매는 A (0.1 % 폼산) 및 용매 B (메탄올)로구성되었고, 기울기 용리 조건: 0-0.5 min, 0% B; 0.5-8 min, 0-100% B; 8-8.5 min 100% B; 8.5-10 min 100-0% B; 10-11 min 0% B으로 설정하였다. 이온화는 전기 분무 이온화(electrospray ionization, ESI) 음이온모드에서 수행되었다; ramp collision energy, 20-40 V; oven temperature, 40°C; capillary voltage, 3 kV; desolvation temperature, 350°C; pressure of nebulizer, 40 psi; fragmentor, 175 V; cone voltage, 40 V; 질량 범위, 50-1200 m/z.
또한 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)은 과산화수소로 인한 신경세포 사멸에 대한 세포 생존율을 향상시켰으며, 신경 세포막 손상을 보호하는 능력이 우수한 것을 확인하였다. 이러한 생리 활성을 가진 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 주요물질을 분석하기 위하여 LC-MS^e를 실시하 였으며, 주요 생리활성 물질은 퀘세틴 배당체와 캠페롤 배당체로 추정되었다. 본 연구 결과들을 바탕으로, 와송 추출물은 우수한 산화방지력을 가지고 있을 뿐만 아니라 산화적 스트레스로부터의 신경세포 보호효과를 통해 퇴행성 신경질환과 같은 질병을 예방 할 수 있는 건강기능성식품의 천연산화방지제 소재로써 고부가 가치가 있다고 판단된다.
DPPH 라디칼 소거 활성은 수소 공여 산화방지제를 측정하는 것으로, 산화방지제에 의해 수소나 전자를 받아 환원되면서 보라색이 탈색되어 나타나는 색 변화를 이용한 측정법으로 비교적 실험법이 간단하고 짧은 시간 내에 산화방지력을 측정할 수 있어 널리 이용되고 있는 방법이다(13). 이를 이용하여 와송 아세트산 에틸 분획물(EFOJ)의 산화방지력을 측정하였다(Fig. 3(B)).
총 페놀 화합물은 ABTS, DPPH 라디칼 소거 활성, 환원력 및 과산화 지방질 억제와 같은 산화방지 활성에 중요한 인자로 작용한다(10). 이에 따라 가장 높은 총 페놀화합물 함량을 나타낸 아세트산에틸 분획물(EFOJ)을 이용하여 이후 실험을 진행하였다.
이를 통한 수소공여로 라디칼과 반응하여공명구조를 통해 안정화됨으로써 산화를 방지하는 활성 및 항노화 등과 같은 생리효과를 가지게 된다(4). 이에 와송의 산화방지 효과를 알아보기 위한 실험의 시작점으로 와송의 분획물별(노말헥세인, 클로로폼, 아세트산에틸 및 증류수) 총 페놀화합물 함량을 측정하였으며, 결과는 다음과 같다(Fig. 2). 각각의 분획물의 총 페놀화합물 함량은 99.
이후, 50 μM DCF-DA를 넣어 50분간 배양하여 형광 마이크로플레이트 분석기(fluorescence microplate reader) (Infinite 200, Tecan Co. SanJose, CA, USA)를 사용하여 485 nm (excitation wave)과 535 nm (emission wave)에서 형광강도를 측정하였다.
와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 주요 생리활성물질은 초 고성능 액체 크로마토그래피 사중극 비행시간 질량 분광법(ultraperformance liquid chromatography-quadrupole time of flight tandem mass spectrometry, UPLC-QTOF/MS)을 사용하여 분석되었다. 크로마토그래피실험은 Waters ACQUITYTM UPLC^TM system (Waters Corp., Miford, MA, USA)로 수행되었다. 시료는 메탄올에 용해시킨 후 0.

대상 데이터

뇌 조직을 이용한 지방질 과산화 생성물인 MDA 생성 억제활성측정은 Chang 등(11)의 방법을 변형하여 사용하였다. ICR(Institute of Cancer Research) 쥐(8주령, 숫컷)는 실험동물 공급업체(Santako, Osan, Korea)로부터 구입하여 7일간의 환경적응기간을 유지했다. 뇌 부위 조직을 10배의 차가운 트리스-염산 완충용액(20 mM, pH 7.
와의 반응을 통해 하이드록실라디칼 단계를 거쳐 세포 내 거대분자를 비가역적으로 손상시키며, 신호전달경로에 관여하여 세포사멸을 유도하게 된다(16). 따라서, 본 실험에서는 PC12 신경세포에 산화적 스트레스를 가 DCF-DA가 탈 에스터화 과정을 거쳐 세포 내로 들어가게 되면,세포 내 존재하는 활성 산소종에 의해 형광 물질인 DCF로 산화되는 원리(17)를 이용하여 PC12 신경세포에 있어 산화적 스트레스를 가하기 위하여 과산화수소(H₂O₂)를 사용하였다. 비형광 화합물인 DCF-DA가 탈 에스터화 과정을 거쳐 세포 내로 들어가게 되면, 세포 내 존재하는 활성 산소종에 의해 형광 물질인 DCF로 산화되는 원리(17)를 이용하여 PC12 신경세포에 있어 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 과산화수소로 유도된 활성 산소종 생성 억제 효과를 측정하기 위한 DCF-DA 실험을 진행하였으며, 실시한 결과는 다음과 같다(Fig.
미리 제조된 아세트산나트륨 완충용액, TPTZ 용액 및 염화제2철(FeCl3) 용액을 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 37°C에서 10분간 방치시켜 FRAP 시약을 준비하였다.
본 실험에 사용된 와송(Orostachys japonicus A. Berger)은 경상 북도 문경시 산북면 대상리에 위치한 게르마늄 햇살와송으로부터 2015년 8월에 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 추출물은 냉동건조 시킨 와송을 80% 에탄올에 40 °C에서 2시간 동안 환류냉각 조건에서 50배 추출하였으며, 이 추출물은 No.
본 실험에서 사용한 PC12 신경세포(KCLB 21721, Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)는 신경세포의 특성을 나타내는 세포로쥐의 갈색 세포 종으로부터 유래하였다. PC12 신경세포를 25 mM HEPES, 25 mM 탄산수소소듐, 10% 소태아혈청, 50 units/mL 페니 실린 및 100 mg/mL 스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640 배지에 접종하여 37°C, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다.
실험에 사용된 추출물은 냉동건조 시킨 와송을 80% 에탄올에 40 °C에서 2시간 동안 환류냉각 조건에서 50배 추출하였으며, 이 추출물은 No.2 거름종이 (Whatman Inc, Kent, UK)로 여과하여 농축하였다.
양성대조구는 비타민C (200 μM)를 사용하였고, 세포 생존율은 대조구에 대한 % 농도로 나타내었다.
(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였으며, 페니실린(penicillin)과 스트 렙토마이신(streptomycin) 및 나머지 시약은 Sigma-Aldrich Co. 제품을 구입하여 사용하였다. 그 외 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.

데이터처리

각 평균값에 대한 유의성 검증은 SAS software (version 9.1. SAS Institute, Cary, NC, USA)를 사용하여 분산분석(analysis of variance, ANOVA)을 실시하고, Duncan의 다중 범위검정법(Duncan’s multiple range test)을 통해 각 시료 간의 유의적인 차이를 p<0.05 수준에서 검증하였다.
모든 실험은 3회 반복 시행하여 평균±표준편차로 나타내었다.

이론/모형

ABTS 라디칼 소거 활성 및 DPPH 라디칼 소거 활성 측정은 Kim 등(10)의 방법을 사용하였다. ABTS 용액은 734 nm에서 흡광도 값이 0.
FRAP 검정은 Kim 등(10)의 방법을 사용하였다. 미리 제조된 아세트산나트륨 완충용액, TPTZ 용액 및 염화제2철(FeCl₃) 용액을 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 37°C에서 10분간 방치시켜 FRAP 시약을 준비하였다.
과산화수소로 유도된 PC12 신경세포 내 산화 스트레스 생성량은 dihydrochlorofluoresein-diacetate (DCF-DA)를 이용한 측정방법으로 수행하였다. PC12 신경세포를 1.
과산화수소에 의해 유도된 PC12 신경세포 사멸에 대한 보호 효과는 MTT 검정법으로 측정하였다. 와송 아세트산에틸 분획물(ethylacetate fraction from Orostachys japonicus A.
와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 주요 생리활성물질은 초 고성능 액체 크로마토그래피 사중극 비행시간 질량 분광법(ultraperformance liquid chromatography-quadrupole time of flight tandem mass spectrometry, UPLC-QTOF/MS)을 사용하여 분석되었다. 크로마토그래피실험은 Waters ACQUITYTM UPLC^TM system (Waters Corp.

성능/효과

08%로 비타민C 그룹과 유사한 신경세포 막 보호효과를 나타냈다. MTT assay 결과에서, 과산화수소(H₂O₂)를 처리한 음성대조구과 대조구를 비교하였을 때, 대조구에서 세포 생존율이 더 높음을 확인하였으며, 이는 처리한 과산화수소 (H₂O₂)가 생체막을 투과하여 세포 내 거대분자를 손상시키고 신호전달경로에 관여하여 세포사멸을 유도한 것(16)이라 판단된다. 이에 와송 추출물을 처리한 그룹에서 세포생존율이 샘플 처리 농도에 의해 유의적으로 높아짐을 확인함에 따라 와송 추출물의 산화방지력이 신경세포 내의 산화적 스트레스를 감소시켜줌으로써 미토콘드리아 전자전달계에 관여되는 단백질 손상과 세포사멸로 유도되는 신호전달경로의 감소에 기여한 것이라 판단되며, 신경 세포 내 산화적 스트레스로 인한 세포막 손상을 감소시켜 줌으로써 신경세포를 보호하였다고 판단된다.
2). 각각의 분획물의 총 페놀화합물 함량은 99.00, 129.83, 222.92 및 81.58 mg GAE/g of dried Orostachys japonicus A. Berger으로, 아세트산에틸 분획물(EFOJ)에서 가장 우수한 함량을 나타냈다. 이는 분획을 통해 와송에 함유되어 있는 페놀성 성분들이 극성도에 따라 용매별로분획된 것으로 판단된다.
과산화수소를 처리한 그룹에서는 대조구와 대비하여 86.44%의 세포 생존율을 나타냈고, 과산화수소와 비타민C (200μM)를 함께 처리한 그룹에서는 105.13%의 세포 생존율을 나타냈다.
과산화수소만 처리한 그룹(103.28%)에서는 대조구(86.69%)와 대비하여 약 17% 정도 락트산수소떼기효소 방출량이 증가하였으며, 비타민C (200 μM) 처리 그룹(79.88%)은 락트산수소떼기효소 방출량이 과산화수소 그룹보다 약 23% 감소하였다.
과산화수소만 처리한 그룹에서는 대조구와 대비하여 170.90%의 활성산소 생성량이 나타났고, 과산 화수소와 비타민C (200 μM)를 함께 처리한 그룹에서는 47.79% 의 활성산소 생성량이 나타났다.
Berger extract: EFOJ)은 다른 분획물보다 높은 총 페놀화합물 함량을 나타냈으며, 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)로 ABTS, DPPH 라디칼 소거 활성과 FRAP 검정 및 지방질과산화물 억제력 분석을 실시한결과, 우수한 라디칼 소거 활성, 총산화방지력과 과산화 지방질 생성물의 억제력을 확인하였다. 또한 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)은 과산화수소로 인한 신경세포 사멸에 대한 세포 생존율을 향상시켰으며, 신경 세포막 손상을 보호하는 능력이 우수한 것을 확인하였다. 이러한 생리 활성을 가진 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 주요물질을 분석하기 위하여 LC-MS^e를 실시하 였으며, 주요 생리활성 물질은 퀘세틴 배당체와 캠페롤 배당체로 추정되었다.
88%)은 락트산수소떼기효소 방출량이 과산화수소 그룹보다 약 23% 감소하였다. 와송 아세트 산에틸 분획물(EFOJ)을 처리한 그룹은 모든 농도에서 유의적으로 과산화수소 처리군보다 락트산수소떼기효소 방출량이 낮으며 농도 의존적인 경향을 보였다. 100 μg/mL 농도에서 락트산수소 떼기효소 방출량이 80.
와송 아세트 산에틸 분획물(EFOJ)의 1,000 μg/mL 농도에서 70.26%의 MDA 생성 억제 효과를 보였으며 양성대조군인 카테킨(100 μg/mL) 농도에서의 72.28%와 유사한 MDA 생성 억제 효과를 보였다.
와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ) 을 처리한 그룹에서는 100 μg/mL 농도에서 46.07%의 활성산소 생성량을 나타내었으며, 높은 수준으로 활성산소 생성량을 억제하였음을 확인할 수 있었다.
와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 1,000 μg/mL 농도에서 총산화방지력은 1.77로, 양성대조구인 비타민C의 농도 500 μg/mL (2.74)와 비교하였을 때, 유의적으로 낮은 총산화방지력을 나타냈고, 농도가 증가함에 따라 총산화방지력이 증가하는 농도 의존적 경향도 확인되었다(Fig. 4).
와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 200 μg/mL 농도에서 ABTS 라디칼 소거 활성은 69.04%로 측정되었으며, 그 이상의 농도에서는 라디칼의 완전한 소거 활성을 나타냄으로써 매우 뛰어난 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타냈다.
와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 DPPH 라디칼 소거 활성은 농도 의존적으로 증가함을 확인하였으며, 1000 μg/mL 농도에서 DPPH 라디칼 소거 활성은 91.79%로 측정되었다.
Berger)의 산화방지 효과와 산화스트레스로부터의 신경세포 손상에 대한 보호효과 및 주요 생리활성물질을 분석하였다. 와송 아세트산에틸 분획물(ethylacetate fraction from Orostachys japonicus A. Berger extract: EFOJ)은 다른 분획물보다 높은 총 페놀화합물 함량을 나타냈으며, 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)로 ABTS, DPPH 라디칼 소거 활성과 FRAP 검정 및 지방질과산화물 억제력 분석을 실시한결과, 우수한 라디칼 소거 활성, 총산화방지력과 과산화 지방질 생성물의 억제력을 확인하였다. 또한 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)은 과산화수소로 인한 신경세포 사멸에 대한 세포 생존율을 향상시켰으며, 신경 세포막 손상을 보호하는 능력이 우수한 것을 확인하였다.
4). 이 결과를 통해, 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)은 라디칼 소거 활성뿐만 아니라 잠재적인 산화방지 활성의 척도인 환원력 또한 우수하다고 판단된다.
다양한 연구를 통해 총 페놀화합물은 반응성이 높은 라디칼 소거 활성을 지니는 것으로 보고되었다(4,5). 이를 고려할 때, 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ) 에 존재하는 높은 함량의 총 페놀화합물이 ABTS 라디칼 소거 활성과 DPPH 라디칼 소거 활성에 영향을 미쳤을 것이라 판단된다.
MTT assay 결과에서, 과산화수소(H₂O₂)를 처리한 음성대조구과 대조구를 비교하였을 때, 대조구에서 세포 생존율이 더 높음을 확인하였으며, 이는 처리한 과산화수소 (H₂O₂)가 생체막을 투과하여 세포 내 거대분자를 손상시키고 신호전달경로에 관여하여 세포사멸을 유도한 것(16)이라 판단된다. 이에 와송 추출물을 처리한 그룹에서 세포생존율이 샘플 처리 농도에 의해 유의적으로 높아짐을 확인함에 따라 와송 추출물의 산화방지력이 신경세포 내의 산화적 스트레스를 감소시켜줌으로써 미토콘드리아 전자전달계에 관여되는 단백질 손상과 세포사멸로 유도되는 신호전달경로의 감소에 기여한 것이라 판단되며, 신경 세포 내 산화적 스트레스로 인한 세포막 손상을 감소시켜 줌으로써 신경세포를 보호하였다고 판단된다. 결국 위 결과들을 고려할 때, 와송 추출물의 산화방지 효과에 기인한 뇌신경세포 보호 효과는 나아가 퇴행성 신경질환을 예방 할 수 있을 것이라 판단된다.

후속연구

이에 와송 추출물을 처리한 그룹에서 세포생존율이 샘플 처리 농도에 의해 유의적으로 높아짐을 확인함에 따라 와송 추출물의 산화방지력이 신경세포 내의 산화적 스트레스를 감소시켜줌으로써 미토콘드리아 전자전달계에 관여되는 단백질 손상과 세포사멸로 유도되는 신호전달경로의 감소에 기여한 것이라 판단되며, 신경 세포 내 산화적 스트레스로 인한 세포막 손상을 감소시켜 줌으로써 신경세포를 보호하였다고 판단된다. 결국 위 결과들을 고려할 때, 와송 추출물의 산화방지 효과에 기인한 뇌신경세포 보호 효과는 나아가 퇴행성 신경질환을 예방 할 수 있을 것이라 판단된다.
이러한 생리 활성을 가진 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 주요물질을 분석하기 위하여 LC-MS^e를 실시하 였으며, 주요 생리활성 물질은 퀘세틴 배당체와 캠페롤 배당체로 추정되었다. 본 연구 결과들을 바탕으로, 와송 추출물은 우수한 산화방지력을 가지고 있을 뿐만 아니라 산화적 스트레스로부터의 신경세포 보호효과를 통해 퇴행성 신경질환과 같은 질병을 예방 할 수 있는 건강기능성식품의 천연산화방지제 소재로써 고부가 가치가 있다고 판단된다.
신경세포 내 활성 산소종의 증가는 세포내 산화방지 효소인 글루타싸 이온(GSH)를 고갈시키고, 칼슘이온을 유입시켜 신경세포의 사멸 및 손상을 유도한다고 알려져 있으며, 식물성 화학물질인 폴리페놀 및 플라보노이드는 이러한 활성 산소종에 의한 손상이나 사멸을 막을 수 있다고 보고되고 있다(18). 이에 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ) 내의 폴리페놀성 생리활성물질이 세포내 과산화수소로 유도된 과도한 양의 활성 산소종을 감소시켜줌으로써 세포내 산화방지 시스템의 균형에 기여할 것이라 판단된다.
이에 와송에 존재하는 페놀성 화합물들이 산화방지력에 유효한 효과를 내재함으로써 지방질과산화물인 MDA의 생성을 억제한 것으로 판단된다. 퇴행성(알츠하이머성) 치매 환자들의 뇌에는 아크로레인(acrolein)과 같은 지방질과산화물의 생성이 증가된다는 보고(15)를 고려할 때, 상기 결과를 토대로, 와송의 아세트산에틸 분획물(EFOJ)이 뇌 조직에 생성되는 지방질과산화물 생성 억제효과를 기반으로 신경퇴행성질환의 예방에도 기여할 수 있을 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	과잉 생성된 활성 산소종이 일으키는 문제점은?	적정 량의 활성 산소종은 생체 내에서 세포내 신호전달 물질로 작용함 으로써, 미토콘드리아 내의 전자전달계 및 백혈구 세포의 활성화 등 세포기능을 유지하는데 중요한 역할을 담당한다(2). 반면, 과잉 생성된 활성 산소종은 생체 내의 산화방지 균형을 무너뜨림 으로써 산화적 스트레스를 야기한다. 활성산소의 독성이 세포 구성성분들인 지방질, 단백질, 당 및 DNA 등을 비선택적, 비가역적으로 손상시켜 암을 비롯하여 뇌졸중, 알츠하이머병 등과 같은 뇌질환과 심장질환, 동맥경화, 염증 및 자가면역질환 등의 각종 질병 및 노화를 일으킬 수 있다(3).
	활성 산소종의 긍정적 역할은?	인체에서 산소를 소비하는 과정으로 인해 불가피하게 발생하는 부산물인 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), 초과산화음이온(superoxide anion, O2−), 하이드록실라디칼(hydroxyl radical, OH') 등과 같은 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS)은 생체 내에서의 높은 반응성으로 인하여 독성을 유발한다(1). 적정 량의 활성 산소종은 생체 내에서 세포내 신호전달 물질로 작용함 으로써, 미토콘드리아 내의 전자전달계 및 백혈구 세포의 활성화 등 세포기능을 유지하는데 중요한 역할을 담당한다(2). 반면, 과잉 생성된 활성 산소종은 생체 내의 산화방지 균형을 무너뜨림 으로써 산화적 스트레스를 야기한다.
	와송에 있는 약리적 성분은?	Berger, 瓦松)은 둥근바위솔이라 하며 일명 암송 및 옥송 등으로 불리는 돌나물과의 다년생 초본식물로 산 위의 바위에서 자라며 민간에서는 와송의 뿌리를 제거한 전초를 건조하여 약용으로 사용해 왔다(6). 트리터페노이드(triterpenoid), 캠페롤(kaempferol), 퀘세틴(quercetin) 및 베타-시토스테롤(β-sitosterol) 등 다양한 약리적 성분이 존재하는 것으로 보고되고 있으며(7), 산화방지 효과(6), 항염증효과(8) 및 항당뇨(9) 등의 다양한 생리활성에 대한 연구가 많이 보고되었다. 이에 반해, 와송의 산화스트레스에 의한 신경세포 손상의 보호효과에 대한 연구는 상대적으로 미비한 실정이다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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