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문제 정의
- 烏鷄卵 투여가 연골 손상 방어능이 확인됨에 따라 이에 대한 기전을 확인하고자 연골의 형성과 파괴에 관여하는 대표적인 바이오마커를 확인하였다.
- 이에 본 연구에서는 오계의 다양한 효능에 대한 연구결과17-19) 중 오계의 육질이 골관절염에 효능이 있다고 보고한 심 등20)의 연구에 착안하여 烏鷄卵 역시 골관절염에 효능이 있을 것이라 판단되어 MIA로 골관절염을 유발한 동물병태 모델을 통해 micro-CT, 조직병리학적 검사, 체중부하 및 혈청 내 바이오마커 등을 측정한 결과, 관절염에 대한 효능이 검증되었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 2주간의 경구 투여 이후 마취제 (케타민 0.4 ㎖ + 림푼 0.1 ㎖)로 실험동물을 마취하여 오른쪽 무릎관절 주변을 깨끗이 제모한 후, 골관절염 유발물질인 MIA를 생리식염수에 용해 시키고 제모한 무릎의 관절강 내에 60 ㎎/㎖의 농도로 50 ㎕씩 투여하여 유발하였다.
- Micro-CT 측정이 종료된 조직을 KPNT (Korea)에 H&E 염색과 Safranin-O 염색을 의뢰하였다.
- YOE의 투여 농도는 비임상 시험관리 기준(식약청고시 제2012-61)’을 바탕으로 500 ㎎/㎏/day, 1,000 ㎎/㎏/day, 2,000 ㎎/㎏/day로 농도로 설정하여 실험을 진행하였다.
- 본 연구는 골관절염에 대한 烏鷄卵의 예방 및 치료 효능을 과학적으로 검증하고자 烏鷄卵을 500, 1000, 2000 (㎎/㎏/day) 농도로 실험 동물에게 총 6주간 경구 투여하는 동안 투여 3주차에 MIA로 관절염을 유발함으로써 관절 손상에 대한 방어능을 micro-CT, 조직병리학적 검사, 체중부하 및 혈청 내 바이오마커 분석을 통해 확인한 결과, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 실험 종료 전 실험동물을 플라스틱 케이지에 비스듬히 세운 후, 10초 동안 각 뒷발에 가해진 세기를 Incapacitance Test Meter를 이용하여 측정하였다. 측정된 결과는 관절염을 유발한 우측 뒷발과 좌측 뒷발의 체중을 다음과 같은 방정식을 이용하여 계산한 뒤 다시 대조군을 기준으로 백분율로 표시하였다.
- 실험군은 관절염을 유발하지 않은 정상군과 관절염 유발 후 증류수만을 투여한 대조군 및 관절염을 유발하기 2주 전부터, 유발 후 4주간 YOE를 3개의 농도로 경구 투여 한 실험군 등 총 5개의 그룹으로 배분하였으며, 정상군 6마리를 제외한 나머지 그룹은 각 10마리씩 분류하고 MIA로 관절염을 유도한 후 유발되지 않은 동물과 그룹 당 필요한 마릿수인 6마리를 초과한 경우는 동물윤리준칙에 맞게 안락사를 진행하여 최종적으로 그룹 당 6마리로 실험을 진행하였다. YOE의 투여 농도는 비임상 시험관리 기준(식약청고시 제2012-61)’을 바탕으로 500 ㎎/㎏/day, 1,000 ㎎/㎏/day, 2,000 ㎎/㎏/day로 농도로 설정하여 실험을 진행하였다.
- 실험종료 후 우측 무릎 부위를 적출하여 포르말린에 고정한 뒤 동국대학교(Korea)에 의뢰하여 정면과 측면의 촬영결과를 3D로 변환하여 연골 부위를 판독하였다.
- 이에 본 저자는 이전 연구결과인 烏鷄의 다양한 효능17-19) 중 관절염에 대한 실험 결과와 심 등20)의 난각막 (Natural eggshell membrane, NEM)을 통한 결과에 준하여 烏鷄卵을 통한 관절염 효능을 확인하고자 烏鷄卵을 500, 1000, 2000 (㎎/㎏/day) 농도로 실험동물에게 총 6주간 경구 투여하는 동안 투여 3주차에 MIA로 관절염을 유발함으로써 관절 손상에 대한 방어능을 micro-CT, 조직병리학적 검사, 체중부하 및 혈청 내 바이오마커 분석을 통해 확인하였다.
- Micro-CT 측정이 종료된 조직을 KPNT (Korea)에 H&E 염색과 Safranin-O 염색을 의뢰하였다. 이후 염색된 조직을 광학현미경으로 관찰하여 조직병리 검사를 진행하였다.
- 실험 종료 전 실험동물을 플라스틱 케이지에 비스듬히 세운 후, 10초 동안 각 뒷발에 가해진 세기를 Incapacitance Test Meter를 이용하여 측정하였다. 측정된 결과는 관절염을 유발한 우측 뒷발과 좌측 뒷발의 체중을 다음과 같은 방정식을 이용하여 계산한 뒤 다시 대조군을 기준으로 백분율로 표시하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 烏鷄卵은 《東醫寶鑑 湯液編》16)에서 性微溫, 無毒. 主心病肚病, 除心腹惡氣, 及風濕攣痹.
- 본 연구에 사용된 시약은 MIA : Monosodium iodoacetate, ether, formaldehyde (Sigma Co., U.S.A.), Rat Calcitonin ELISA kit, Rat Glycosaminoglycans (GAGs) ELISA kit, Cartilage Oligomeric Matrix Protein (COMP) ELISA kit, Rat Cross-Linked C-Terminal Telopeptides of Type Ⅱ Collagen (CTX-Ⅱ) ELISA kit (MyBioSouce Co., U.S.A.), Total MMP-2 quantikine kit, Rat total MMP-9 quantikine kit (R&D system, U.S.A.) 등을 사용하였으며, 기기는 rotary vacuum evaporator (BüchiB-480 Co., Switzerland), ELISA reader (Molecular Devices Co., U.S.A.), freeze dryer (EYELA FDU-540 Co., Japan), Incapacitance Test Meter (IITC Life Science, california, U.S.A.) 등을 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 연산 烏鷄卵 (Yeonsan Ogye Egg, 이하, YOE로 표기)은 충남 논산에 위치한 지산농원 (Korea)에서 구입 하였고, 껍질을 제거한 YOE 500 g을 물 5 ℓ에 풀어 3시간 동안 교반하며 환류 추출하였다. 이후 여과액을 얻어 감압 농축하고 동결 건조하여 48.
- 수컷 6주령의 SD-Rat (170-200 g)을 ㈜라온바이오 (Korea)에서 공급 받았으며, 동물은 실험 당일까지 일반 고형사료를 충분히 공급하고, 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12시간 (light-dark cycle)의 환경에서 2 주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 연산 烏鷄卵 (Yeonsan Ogye Egg, 이하, YOE로 표기)은 충남 논산에 위치한 지산농원 (Korea)에서 구입 하였고, 껍질을 제거한 YOE 500 g을 물 5 ℓ에 풀어 3시간 동안 교반하며 환류 추출하였다. 이후 여과액을 얻어 감압 농축하고 동결 건조하여 48.1 g (수득율 9.62%)의 분말을 획득하였다. 획득한 분말은 초저온 냉동고 (-80℃)에서 보관하며 실험에 필요한 농도로 증류수에 희석하여 사용하였다.
데이터처리
- The statistical significance of differences between control and YOE groups(* : p <0.05) based on ANOVA with student's t –test determined.
- The statistical significance of differences between control and YOE groups(* : p<0.05) based on ANOVA with student's t-test determined.
- The statistical significance of differences between normal and control groups(++ : p <0.01) or control and YOE groups(* : p <0.05) based on ANOVA with student's t –test determined.
- The statistical significance of differences between normal and control groups(+++ : p <0.001) or control and YOE groups(** : p <0.01) based on ANOVA with student's t –test determined.
- The statistical significance of differences between normal and control groups(+++ : p <0.001) or control and YOE groups(** : p <0.01, * : p <0.05) based on ANOVA with student's t-test determined.
- The statistical significance of differences between normal and control groups(+++ : p <0.001) or control and YOE groups(*** : p <0.001, ** : p <0.01) based on ANOVA with student's t –test determined.
- 각 처리군의 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA) 방법을 이용하였고, Student’s t-test를 사용하여 통계적 유의성 (p<0.001, p<0.01, p<0.05)을 검증하였다.
- 본 연구의 실험 결과는 평균값±표준 편차 (mean±S.D.)로 표시하였다.
성능/효과
- 1. Micro-CT 촬영 결과, YOE 투여군은 대조군에 비해 골 손상이 적게 나타나 연골의 양이 보존되었다.
- 2. 조직병리검사 결과, YOE 투여군은 대조군에 비해 침윤세포의 감소와 활막 내 프로테오글리칸 층의 증가를 나타내었다.
- 3. 체중부하 측정 결과, YOE 투여군은 대조군에 비해 유의성 있는 증가를 나타내었다.
- 4. 연골의 재형성과 회복에 관련된 바이오마커 측정 결과, YOE 투여군은 calcitonin 생성량을 2,000 ㎎/㎏/day 투여군에서, glycosaminoglycan 생성량은 모든 투여군에서 대조군에 비해 유의성 있는 증가를 나타내었다.
- 5. 연골 파괴와 관련된 바이오마커 측정 결과, YOE 투여군은 MMP-2, MMP-9, COMP, CTXⅡ 생성량을 1,000과 2,000 ㎎/㎏/day 투여군에서 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 나타내었다.
- 연골 파괴에 관여하는 바이오마커 (MMP-2, MMP-9, COMP, CTXⅡ 등) 생성량을 측정한 결과, 烏鷄卵 투여는 대조군에 비해 1000, 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 유의성 있게 감소가 나타남으로써 연골 파괴에 의한 손실을 방어하는 것이 확인되었다. 다만, 500 ㎎/㎏/day 투여군에서는 유의성 있는 감소가 나타나지 않았는데, 이는 대조군보다 연골 보존이 되기는 했으나, 1000, 2000 ㎎/㎏/day에 비해 연골 파괴 마커들을 감소시키지 못함으로써 조직병리 검사 결과에서 상대적으로 대퇴골 부위의 연골 소실이 진행 된 것을 확인할 수 있었다.
- 뒷발 체중 부하를 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 체중 부하 비율이 감소하였다. 이에 비해 YOE는 모든 투여군에서 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 나타났다(Fig.
- 무릎 관절의 H&E 염색을 실시한 결과 ,정상군에 비해 대조군과 YOE 투여군의 대퇴골과 경골 사이의 연골의 양(Cartilage, 노란색 원형표기)이 감소하였고 연골 주변으로 침윤세포 (Infiltrative cell)가 많이 생성되어 있었으며, 상대적으로 YOE 투여군이 대조군에 비해 연골의 양이 더 보존되고 침윤세포의 범위나 밀집도의 감소를 확인할 수 있었다. 또한 Safranin-O 염색을 실시한 결과, 정상군에 비해 대조군과 YOE 투여군은 연골 주변과 활막 내에 붉은 색으로 염색된 프로테오글리칸 (proteoglycan, 노란색 화살표)이 고르게 형성되어 있지 않은 것을 확인할 수 있었으나 대조군은 프로테오글리칸이 소실된 개체를 보인 반면, YOE 투여군은 대조군에 비해 연골 주변과 활막 내 프로테오글리칸의 분포 증가를 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- 무릎 관절을 micro CT를 이용하여 촬영한 결과, 정상군에 비해 대조군과 YOE 투여군의 연골의 양 (Cartilage volume, 노란색 원형표기)이 감소하였으며, 상대적으로 YOE 투여군이 대조군에 비해 연골의 양이 더 보존되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
- 무릎 관절의 H&E 염색을 실시한 결과 ,정상군에 비해 대조군과 YOE 투여군의 대퇴골과 경골 사이의 연골의 양(Cartilage, 노란색 원형표기)이 감소하였고 연골 주변으로 침윤세포 (Infiltrative cell)가 많이 생성되어 있었으며, 상대적으로 YOE 투여군이 대조군에 비해 연골의 양이 더 보존되고 침윤세포의 범위나 밀집도의 감소를 확인할 수 있었다.
- 이와 같은 원인이 지속되면 연골을 구성하는 단백질은 분해된 후 혈액을 통해 순환되어 혈액 내 cartilage oligomeric matrix protein (COMP)의 증가가 나타는데, 혈액 내 COMP 농도는 임상에서 연골 손상 정도를 나타내는 지표로 활용되고 있다27). 연골 파괴에 관여하는 바이오마커 (MMP-2, MMP-9, COMP, CTXⅡ 등) 생성량을 측정한 결과, 烏鷄卵 투여는 대조군에 비해 1000, 2000 ㎎/㎏/day 투여군에서 유의성 있게 감소가 나타남으로써 연골 파괴에 의한 손실을 방어하는 것이 확인되었다. 다만, 500 ㎎/㎏/day 투여군에서는 유의성 있는 감소가 나타나지 않았는데, 이는 대조군보다 연골 보존이 되기는 했으나, 1000, 2000 ㎎/㎏/day에 비해 연골 파괴 마커들을 감소시키지 못함으로써 조직병리 검사 결과에서 상대적으로 대퇴골 부위의 연골 소실이 진행 된 것을 확인할 수 있었다.
- 우선, 烏鷄卵 투여 종료 후 골관절염의 주된 증상인 연골손상에 대한 여부를 판단하기 위해 Micro-CT 및 조직병리검사를 실시한 결과, 烏鷄卵 투여군은 대조군에 비해 대퇴골 (Femure)와 정강뼈 (Tibia) 사이의 연골의 양과 연골 주변의 프로테오글리칸(proteoglycan) 층의 면적이 넓게 나타났다. 이와 같은 결과는 烏鷄卵 투여가 골관절염으로 인한 연골 손상이 적은 것이 육안적으로 검증되었으며, 연골 손상으로 인해 하체의 중심이 관절염이 유발되지 않는 쪽으로 기울어지는 것을 확인한 뒷발 체중부하 측정 결과에서도 대조군에 비해 약 1.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때, 烏鷄卵은 골관절염에 대한 효능이 혈액, 방사선 및 조직학적인 다양한 실험을 통해 효능과 복용량을 확인하였다. 심 등16)의 결과와 비교하였을 때 烏鷄卵은 烏鷄肉에 비해 관절염에 대한 효능은 상대적으로 낮게 검증 되었으나, 농도 의존적인 결과를 나타냄으로써 골관절염에 대한 건강기능성 식품 소재 및 치료 처방의 구성 약으로 활용될 가능성을 확인하였다.
- 혈청 내 calcitonin 생성량을 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 calcitonin 생성량이 감소하였다. 이에 비해 YOE는 2,000 ㎎/㎏/day 투여군에서 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 나타났다(Fig. 4).
- 혈청 내 MMP-2 생성량을 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 MMP-2 생성량이 증가하였다. 이에 비해 YOE는 농도 의존적인 감소가 나타났으며, 1,000과 2,000 ㎎/㎏/day 투여군에서 대조군에 비해 유의성이 나타났다(Fig. 6).
- 뒷발 체중 부하를 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 체중 부하 비율이 감소하였다. 이에 비해 YOE는 모든 투여군에서 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 나타났다(Fig. 3).
- 혈청 내 glycosaminoglycan 생성량을 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 glycosaminoglycan 생성량이 감소하였다. 이에 비해 YOE는 모든 투여군에서 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 나타났다(Fig. 5).
- 우선, 烏鷄卵 투여 종료 후 골관절염의 주된 증상인 연골손상에 대한 여부를 판단하기 위해 Micro-CT 및 조직병리검사를 실시한 결과, 烏鷄卵 투여군은 대조군에 비해 대퇴골 (Femure)와 정강뼈 (Tibia) 사이의 연골의 양과 연골 주변의 프로테오글리칸(proteoglycan) 층의 면적이 넓게 나타났다. 이와 같은 결과는 烏鷄卵 투여가 골관절염으로 인한 연골 손상이 적은 것이 육안적으로 검증되었으며, 연골 손상으로 인해 하체의 중심이 관절염이 유발되지 않는 쪽으로 기울어지는 것을 확인한 뒷발 체중부하 측정 결과에서도 대조군에 비해 약 1.5배 정도 높게 나타나, 烏鷄卵이 연골 손상 방어를 통한 통증 감소 역시 효능이 있음을 보여주고 있다.
- 전체적인 결과를 종합해볼 때, 烏鷄卵은 micro-CT, 조직병리 결과, 연골의 손상 및 파괴 관련 바이오마커 측정 결과를 통해 골관절염의 예방 및 치료 효능이 규명되었으며, 농도 의존적인 효능을 나타내었다. 따라서 본 연구는 임상연구에 대한 기초적인 자료를 제공하고 한의학적 처방 및 기능성 식품 소재로 활용할 수 있음을 시사하고 있다.
- 체내의 칼슘 (Calcium) 농도의 항상성을 조절하여 혈액 내 칼슘을 뼈에 축적시키는 호르몬인 칼시토닌 (Calcitonin)과 외부의 충격으로부터 관절을 보호하고 프로테오글리칸을 구성하는 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan) 생성량을 측정한 결과, 烏鷄卵 투여는 대조군에 비해 칼시토닌은 2000 ㎎/㎏/day 그룹에서, 글리코사미노글리칸은 모든 투여군에서 유의성 있는 증가가 나타남으로써 연골 손상 시 연골의 재형성과 회복에 관여함이 나타났다. 특히, 글리코사미노글리칸 생성량 증가에 대한 유의적인 결과는 조직병리 검사를 통해 연골 주변에 프로테오글리칸 층이 넓게 형성된 결과와 부합되어 烏鷄卵 투여가 연골에 효과적임을 더욱 뒷받침하고 있다.
- 혈청 내 COMP 생성량을 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 COMP 생성량이 증가하였다. 이에 비해 YOE는 1,000과 2,000 ㎎/㎏/day 투여군에서 대조군에 비해 유의성 있는 감소가 나타났다(Fig.
- 혈청 내 CTXⅡ 생성량을 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 CTXⅡ 생성량이 감소하였다. 이에 비해 YOE는 1,000과 2,000 ㎎/㎏/day 투여군에서 대조군에 비해 유의성 있는 감소가 나타났다(Fig.
- 혈청 내 MMP-2 생성량을 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 MMP-2 생성량이 증가하였다. 이에 비해 YOE는 농도 의존적인 감소가 나타났으며, 1,000과 2,000 ㎎/㎏/day 투여군에서 대조군에 비해 유의성이 나타났다(Fig.
- 혈청 내 MMP-9 생성량을 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 MMP-9 생성량이 증가하였다. 이에 비해 YOE는 1,000과 2,000 ㎎/㎏/day 투여군에서 대조군에 비해 유의성 있는 감소가 나타났다(Fig.
- 혈청 내 calcitonin 생성량을 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 calcitonin 생성량이 감소하였다. 이에 비해 YOE는 2,000 ㎎/㎏/day 투여군에서 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 나타났다(Fig.
- 혈청 내 glycosaminoglycan 생성량을 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 glycosaminoglycan 생성량이 감소하였다. 이에 비해 YOE는 모든 투여군에서 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 나타났다(Fig.
후속연구
- 전체적인 결과를 종합해볼 때, 烏鷄卵은 micro-CT, 조직병리 결과, 연골의 손상 및 파괴 관련 바이오마커 측정 결과를 통해 골관절염의 예방 및 치료 효능이 규명되었으며, 농도 의존적인 효능을 나타내었다. 따라서 본 연구는 임상연구에 대한 기초적인 자료를 제공하고 한의학적 처방 및 기능성 식품 소재로 활용할 수 있음을 시사하고 있다.
- 심 등16)의 결과와 비교하였을 때 烏鷄卵은 烏鷄肉에 비해 관절염에 대한 효능은 상대적으로 낮게 검증 되었으나, 농도 의존적인 결과를 나타냄으로써 골관절염에 대한 건강기능성 식품 소재 및 치료 처방의 구성 약으로 활용될 가능성을 확인하였다. 또한, 심 등20)이 난각막을 통한 관절염 효능을 보고함에 따라 烏鷄卵의 난각막 역시도 가능성이 있을 것으로 사료되므로 추 후 연구를 통해 기초적 자료를 확립해보고자 한다.
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