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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 고구마 잎에 다량 함유되어 있는 지용성 성분인 lutein, β-carotene 및 수용성 성분인 페놀류의 이용도를 높이고 산업적으로도 이용할 수 있는 추출조건을 확립하고자 추출용매의 에탄올 농도 및 추출시간별로 유용성분 함량과 항산화 활성의 변화를 조사하였다.
- 본 연구는 고구마 잎에 함유된 carotenoids류인 lutein, β- carotene과 항산화 성분을 효과적으로 동시에 추출할 수 있는 방법을 연구하고 각 추출물에 대한 항산화 효과를 평가하였다.
가설 설정
- 1)Raw material was extracted by 70% ethanol.
- 3)ND is not detected.
제안 방법
- 추출시간에 따른 고구마 잎의 lutein, β-carotene, 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 페놀산 함량에 대한 결과는 Table 5와 같다. 1차 추출은 99.9% 에탄올로 추출하고 2차 추출은 농도별 에탄올 추출물의 유용성분 함량 결과를 바탕으로 60% 에탄올을 고정으로 하고 30, 60 및 90분 추출하였다. Lutein의 함량은 추출시간에 따라 각각 249.
- Column은 YMC-Pack Pro C18 column(4.6×250 mm, 5μm, YMC Co., Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하였고, column oven 온도는 25℃, 검출기는 UV(450 nm), 이동상은 acetonitrile(A)과 ethyl acetate(B)를 gradient 조건으로 흘려주었고 gradient 조건은 A:B를 초기 70:30(%, v/v)에서 5분에 60:40, 10분에 50:50, 15분에 25:75, 17분에 0:100, 27분에 70:30, 45분에 70:30으로 설정하였으며, 유속은 1.0mL/min으로 흘려주었으며 주입량은 20 μL로 하였다.
- Lutein 함량은 Choi 등(14)의 방법을 변형하여 사용하였다. 즉 lutein과 β-carotene의 산화적 파괴를 방지하기 위하여 일정량의 고구마 잎 분말과 잎 추출물에 6% pyrogallol을 함유한 에탄올을 첨가하고 8 mL의 60% KOH 용액을 가하였다.
- 시간에 대한 영향을 확인하기 위하여 2차 추출을 60%의 에탄올 농도로 고정하고 추출시간을 각각 30, 60, 90분간으로 설정하여 위와 같은 방법으로 추출하였다. 각각의 추출조건에 따른 에탄올 추출물의 추출 수율은 추출물을 농축 및 건조한 다음 중량을 측정하여 추출 전 고구마 잎 건물량에 대한 백분율로 나타내었다.
- 검출기는 UV 280nm에서 검출하였으며, column은 ODS column(5 μm, 4.6×250 mm, Agilent Technologies)을 사용하였고, column oven 온도는 30℃로 설정하였다.
- 9% 에탄올로 lutein 및 β-carotene을 1차 추출하고 여과박에 함유한 극성 성분인 폴리페놀 성분을 추출하기 위하여 2차로 에탄올 농도를 50~90%로 조절하여 초음파 추출기(frequency 40 Hz, power 300 W, SD-350 H; Seong Dong, Seoul, Korea)를 사용하여 30분 동안 추출한 다음 3,500 rpm에서 30분간 원심분리(HERMLE centrifuge Z380, Hermle AG, Gosheim, Germany) 한 후 상등액을 분석용 시료로 사용하였다. 시간에 대한 영향을 확인하기 위하여 2차 추출을 60%의 에탄올 농도로 고정하고 추출시간을 각각 30, 60, 90분간으로 설정하여 위와 같은 방법으로 추출하였다. 각각의 추출조건에 따른 에탄올 추출물의 추출 수율은 추출물을 농축 및 건조한 다음 중량을 측정하여 추출 전 고구마 잎 건물량에 대한 백분율로 나타내었다.
- 이동상은 0.1% acetic acid가 포함된 증류수(A)와 0.1% acetic acid가 포함된 아세토니트릴(B)을 gradient 조건으로 흘려주었고 gradient 조건은 A:B를 초기 92:8(%, v/v)에서 2분에 90:10, 27분에 70:30, 50분에 10:90, 51분에 0:100, 60분에 0:100, 70분에 92:8로 설정하였으며, 유속은 1 mL/min으로 하였고, 주입량은 20 μL로 설정하였다.
- 8mL를 첨가하고 교반하여 잘 혼합한 후 실온에서 30분간 방치하고 520 nm에서 흡광도 감소치를 측정하였다. 이때 전자공여능은 시료 첨가구와 비첨가구의 흡광도 차이를 백분율(%)로 하였으며, 각 시료의 농도에 따른 DPPH 라디칼을 소거하여 잔존하는 DPPH 라디칼을 50% 감소시키는 농도 IC50(inhibitory concentration)을 각 시료의 농도로 표현하였다.
- 즉 lutein과 β-carotene의 산화적 파괴를 방지하기 위하여 일정량의 고구마 잎 분말과 잎 추출물에 6% pyrogallol을 함유한 에탄올을 첨가하고 8 mL의 60% KOH 용액을 가하였다.
- 즉 각 추출물 100μL에 2% Na2CO3 용액 2mL를 가한 후 3분간 방치하였고, 50% Folin-Ciocalteu reagent 100 μL를 첨가 후 실온에서 30분 반응한 다음 750nm에서 반응액의 흡광도 값을 측정하였다.
- 즉 고구마 잎에 대하여 선행연구를 통하여 최적 가수량을 20배수로 설정하고, 지용성 성분을 효과적으로 추출하기 위하여 먼저 고농도인 99.9% 에탄올로 lutein 및 β-carotene을 1차 추출하고 여과박에 함유한 극성 성분인 폴리페놀 성분을 추출하기 위하여 2차로 에탄올 농도를 50~90%로 조절하여 초음파 추출기(frequency 40 Hz, power 300 W, SD-350 H; Seong Dong, Seoul, Korea)를 사용하여 30분 동안 추출한 다음 3,500 rpm에서 30분간 원심분리(HERMLE centrifuge Z380, Hermle AG, Gosheim, Germany) 한 후 상등액을 분석용 시료로 사용하였다.
- 즉 추출물 0.2mL에 2×10-4 M DPPH 용액 0.8mL를 첨가하고 교반하여 잘 혼합한 후 실온에서 30분간 방치하고 520 nm에서 흡광도 감소치를 측정하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 Lee 등(15)의 방법을 변형하여 사용하였으며 Folin-Ciocalteu reagent가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다. 즉 각 추출물 100μL에 2% Na2CO3 용액 2mL를 가한 후 3분간 방치하였고, 50% Folin-Ciocalteu reagent 100 μL를 첨가 후 실온에서 30분 반응한 다음 750nm에서 반응액의 흡광도 값을 측정하였다.
- 추출물을 0.20 μm PVDF membrane filter로 여과한 후 HPLC(ACME 9000 system, Younglin, Anyang, Korea)로 분석하였다.
- 페놀산은 일정량의 추출물을 취하여 감압 농축하고, 증류수로 녹인 후 diethyl ether/ethyl acetate(1:1) 혼합액을 가하여 3회 반복 추출한 후 농축하여 HPLC용 메탄올에 용해한 다음 0.20 μm syringe filter(Millipore, Billerica, MA, USA)로 여과하여 HPLC로 분석하였다.
- 희석된 ABTS용액 1mL에 추출액 50μL를 가하여 흡광도의 변화를 30분 후에 측정하였으며, 표준물질은 L-ascorbic acid를 동량 첨가하였고, 총 항산화력은 AEAC(L-ascorbic acid equivalent antioxidant capacity, mg AA eq/g)로 표현하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 고구마(Ipomoea batatas L.) 잎은 ‘Jinhongmi’ 품종으로 2014년 8월에 충청북도 농업기술원에서 수확 후 40℃ 열풍건조기로 건조한 시료를 제공받아 사용하였다.
데이터처리
- 2)Means in the same column with the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
- 2)Means in the same row with the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
- 3)Means in the same column with the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
- 7)Means in the same row with the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
- 고구마 잎의 추출조건별 유용성분 분석과 항산화 활성을 조사한 각 실험은 모두 3회 이상 반복 실시하였고 통계분석은 SPSS 통계프로그램(Statistical Package for the Social Science, Ver. 21.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 각 측정군의 평균과 표준편차를 산출하고 처리 간의 차이 유무를 one-way ANOVA(analysis of variation)로 분석한 후 Duncan’s multiple range test를 이용하여 P<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 총 플라보노이드 함량은 Choi 등(16)의 방법에 따라 추출물 250μL에 증류수 1mL와 5% NaNO2 75μL를 가한 다음 5분 후 10% AlCl3･H2O 150μL를 가하여 6분간 방치하고 1 M NaOH 500 μL를 가하여 11분간 방치한 다음, 반응액의 흡광도 값을 510nm에서 측정하였고, 표준물질로 (+)-catechin hydrate를 사용하여 standard 값을 구한 후 시료 g 중의 mg catechin으로 나타내었다.
- 추출물의 총 항산화력은 ABTS cation decolorization assay(19)에 의하여 측정하였다. ABTS 7.
- 추출물의 항산화 활성은 Blois(17)와 Okawa 등(18)의 방법에 따라 전자공여능(electron donating ability, EDA)으로 측정하였다. 즉 추출물 0.
성능/효과
- β-Carotene 함량은 1차 추출 시 128.5 μg/g이었으며, 2차 추출 시 추출용매의 에탄올 농도가 증가함에 따라 각각 126.7, 136.4, 141.0, 145.7 및 151.5 μg/g으로 증가하였으며, β-carotene 추출률은 각각의 추출농도에서 57.3~68.5% 범위를 나타내었다.
- 2% 범위를 나타내었다. 1차 추출 시 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 각각 6.8 및 1.2 mg/g이었지만, 2차 추출에서는 에탄올 농도 60%에서 각각 25.5 및 15.8 mg/g으로 최고값을 보인 후 에탄올 농도가 증가할수록 감소하는 경향을 나타내었다.
- 0% 범위였다. 2차 추출 시 추출용매의 에탄올 농도가 높아짐에 따라 감소하였는데 50% 에탄올 농도에서 20.0%로 가장 높은 추출 수율을 보였으며, 90% 농도에서는 8.3%로 낮게 나타났다. 이러한 결과는 산머루로부터 가용성 물질을 추출할 경우 용매의 에탄올 농도에 영향을 많이 받으며 50~70%의 농도에서 추출 수율이 가장 높았다고 보고(20)한 바와 같이 고구마 잎에도 지용성 성분 외에도 수용성 물질이 대량 존재하기 때문이라 판단된다.
- Chlorogenic acid 함량은 70% 에탄올 추출에서 1,517.8 mg/100 g으로 가장 높은 함량을 나타내었으며, caffeic acid, ρ-coumaric acid 및 ferulic acid, 4,5-diCQA 및 3,5-diCQA 함량은 60% 에탄올에서 각각 66.5, 6.1, 89.5, 225.3 및 845.5 mg/100 g으로 가장 높은 함량을 나타낸 후 에탄올 농도가 증가함에 따라 감소하는 경향을 나타내었다.
- Chlorogenic acid, caffeic acid, ρ-coumaric acid, ferulic acid, 4,5-diCQA, 3,5-diCQA 및 3,4-diCQA 등 7종의 페놀산이 검출되었다.
- Lu-tein과 β-carotene은 2차 추출 에탄올 농도 90%에서 각각 77.9% 및 68.5%로 가장 높은 추출률을 나타내었고 추출시간이 길어짐에 따라 감소하였다.
- Lutein 함량은 1차 추출 시 203.9μg/g이었으며, 2차 추출 시 에탄올 농도에 따라 각각 234.9, 249.4, 255.9, 261.8 및 262.7μg/g으로 추출용매의 에탄올 농도가 증가함에 따라 증가하였으며, lutein의 추출률은 각각의 추출농도에서 69.7~77.9%였다.
- Lutein의 함량은 추출시간에 따라 각각 249.4, 232.8 및 216.3 μg/g으로 추출시간이 길어짐에 따라 감소하는 경향을 보였으며, β-carotene 함량은 추출시간에 따라 각각 136.4, 127.2 및 113.6 μg/g으로 lutein과 마찬가지로 추출 시간이 길어짐에 따라 감소하는 경향을 나타내었다.
- 5%로 가장 높은 추출률을 나타내었고 추출시간이 길어짐에 따라 감소하였다. Polyphenol, flavonoid 및 DPPH, ABTS 라디칼 소거능은 2차 추출 에탄올 농도 60%에서 각각 32.3 mg gallic acid equivalent/g, 17.0 mg cat-echin equivalent/g 및 1.94 mg/mL(EDA, IC50), 17.0 mg AA eq/g(AEAC)으로 가장 높게 나타났으며, 추출시간이 길어짐에 따라 감소하였다. 또한, 총 페놀산 함량은 2차 추출을 에탄올 60~70%에서 추출 시 가장 높은 함량을 나타내었다.
- 2차 추출 시 에탄올 농도가 높아짐에 따라 함량이 증가하였는데 이는 β-carotene은 lutein보다 더 비극성을 띤 성분이며 에탄올 농도가 높아짐에 따라 추출이 더 용이한 것으로 판단된다. 검화법에 의한 carotenoid의 추출물은 식품소재로 사용하기는 어렵기 때문에 추출 수율은 낮지만 식용 가능한 에탄올로 추출할 경우 1회 추출로 루테인과 베타카로틴을 각각 69.7~77.9% 및 57.3~68.5% 정도 추출할 수 있으므로 항산화 성분과 함께 이용하기 위한 적절한 추출방법이라 판단된다.
- 5 mg/100 g으로 가장 높은 함량을 나타낸 후 에탄올 농도가 증가함에 따라 감소하는 경향을 나타내었다. 따라서 총 페놀산 함량은 1차 추출을 99.9%, 2차 추출을 에탄올 농도가 60~70%에서 추출 시 가장 높은 함량을 나타내었다. Jung 등(28)은 고구마 잎 3종의 총 페놀산 함량이 250.
- 0 mg AA eq/g(AEAC)으로 가장 높게 나타났으며, 추출시간이 길어짐에 따라 감소하였다. 또한, 총 페놀산 함량은 2차 추출을 에탄올 60~70%에서 추출 시 가장 높은 함량을 나타내었다. 지용성 물질인 carotenoids뿐만 아니라 대량으로 존재하는 수용성 물질인 페놀류를 동시에 추출하기 위해서는 99.
- 또한, 총 페놀산 함량은 2차 추출을 에탄올 60~70%에서 추출 시 가장 높은 함량을 나타내었다. 지용성 물질인 carotenoids뿐만 아니라 대량으로 존재하는 수용성 물질인 페놀류를 동시에 추출하기 위해서는 99.9%의 에탄올을 사용하여 1차 추출을 하고, 60% 정도의 에탄올로 2차 추출을 30분 동안 추출 시 높은 추출률을 나타내어 루테인, 베타카로틴 및 폴리페놀 동시 추출법으로 가장 적합할 것으로 판단되었다.
- 이러한 결과는 공액이중결합의 구조 때문에 빛, 산소 및 열에 장기간 노출되어 변화되었기 때문이라 판단되며, 이는 Gao 등(30)의 마리골드로부터 lutein을 추출할 경우 시간과 용매의 영향을 받는 것으로 나타난 연구와 유사하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출시간에 따라 각각 32.3, 32.4 및 31.0mg/g으로 그 추출률은 각각 90.6, 90.9 및 87.1%였다. 총 플라보노이드 함량도 추출시간이 길어짐에 따라 17.
- 1%였다. 총 플라보노이드 함량도 추출시간이 길어짐에 따라 17.0 mg/g에서 16.5 mg/g으로 감소하는 경향을 나타내었다. 추출시간에 따른 고구마 잎 추출물에 대한 DPPH 라디칼 소거 활성은 IC50 값이 각각 1.
- 추출시간별 chlorogenic acid, ρ-coumaric acid, 4,5-diCQA 및 3,5-diCQA는 추출시간이 길어짐에 따라 감소하는 경향을 보였고 3,4-diCQA 및 caffeic acid 함량은 오히려 증가하는 경향을 보였다.
- 5 mg/g으로 감소하는 경향을 나타내었다. 추출시간에 따른 고구마 잎 추출물에 대한 DPPH 라디칼 소거 활성은 IC50 값이 각각 1.94, 2.09 및 2.12 mg/mL로 추출시간이 길어짐에 따라 감소하였으며, ABTS 라디칼 소거능 역시 추출시간이 길어짐에 따라 17.1 mg AA eq/g에서 15.7 mg AA eq/g으로 감소하였다. 추출시간별 chlorogenic acid, ρ-coumaric acid, 4,5-diCQA 및 3,5-diCQA는 추출시간이 길어짐에 따라 감소하는 경향을 보였고 3,4-diCQA 및 caffeic acid 함량은 오히려 증가하는 경향을 보였다.
- 추출용매의 에탄올 농도별 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 각각 14.5~32.3 및 5.6~17.0 mg/g 범위를 나타내었고, 그 추출률은 각각 40.7~90.6 및 29.0~88.2% 범위를 나타내었다. 1차 추출 시 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 각각 6.
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