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문제 정의
- 본 연구는 미생물 분비물질 자체가 곤충 면역반응을 유도하는지에 대한 조사로서 흰점박이꽃무지(P. brevitarsis seulensis)에 대한 병원성 세균과 공생균을 이용하였다. 본 연구자들은 최근 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.
제안 방법
- brevitarsis seulensis) 유충에서 발생한 멜라닌화가 면역반응과 직접 연관이 있는 것인지를 혈구세포 면역 활성화 여부로 재확인하였다. Fig. 1의 방법과 같이 대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media), 단순 배양액(LB media), 공생균인 크리세오박테리움(Chryseobacteriumsp.) 배양액(Ch media)을 주입한 후 혈구세포를 채혈하여 세포성면역반응 여부를 확인 하였다(Fig. 2). 본 연구자들은 이전 연구에서 흰점박이꽃무지(P.
- 상층액은 다시 한 번 같은 조건으로 원심분리하여 배양액만 주입에 사용하였다. 균들이 완전히 제거가 되었는지 여부는 상층액을 1 ml를 고체배지에도포하여 48시간 배양하여 콜로니(colony)생성 여부를 재확인하여 배양액만 있는지를 다시 한 번 확인 확인하였다. 분리된 배양액 10~40 µl를 직접 유충 혈강내 주입하여 생존율, 병원성 여부, 혈구세포들의 면역 활성화를 관찰 하였다.
- , 2015). 그러므로 배양액들이 주입된 유충들 과립 혈구세포질 내 리소좀 활성화 여부가 세포성면역반응 지표로 활용하여 확인 하였다. 주입 1시간 후 모든 그룹에서 과립혈구 세포 리소좀의 활성화는 관찰 되지 않았다(Fig.
- 대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media), 단순 배양액(LB media), 공생균인 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.)배양액(Ch media)을 주입 비교하여 면역 활성화 여부를 확인하였다(Fig. 1A). Fig.
- 대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media), 단순 배양액(LB media),공생균인 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) 배양액(Ch media)을 주입한 후 혈구세포를 채혈하여 활성화 되는 리소좀에 대하여 유세포분석을 수행하였다(Fig. 3A-D).
- 배양균 제거 여부는 세균이 제거된 배양액 500 µl를 고체배지에 도포하여 72시간 재 배양하여 콜로니 형성 여부를 확인하였고 72시간 이후에도 콜로니가 전혀 형성되지 않는 것을 확인 한 후 아래 실험을 진행하였다.
- 분리된 배양액 10~40 µl를 직접 유충 혈강내 주입하여 생존율, 병원성 여부, 혈구세포들의 면역 활성화를 관찰 하였다.
- , 2014). 시약과 30분간 실온에서 배양 한 후 3분 간격으로 3반복 PBS buffer(137 mM Sodium Chloride; 10 mM phosphate; 2.7 mM PotassiumChloride; pH = 7.4)로 세척 후 현미경으로 관찰하고 유세포분석기(BD Bioscience; San Jose, CA)를 사용하여 혈구세포를 분석하였다(Kwon et al., 2014). 배양액 주입 후 면역반응 유도 시간은 12~180시간으로 정하였으며 표준통계 소프트웨어 프로그램을 사용하여 통계 분석하였다(IBM SPSS statistics 22.
- 현미경 관찰 결과들의 신뢰도를 높이고 리소좀의 활성화를 정량적으로 측정하기 위하여 유세포분석기(Flowcytometry)를 통하여 분석하였다. 유충 한 마리당 10,000개의 혈구세포를 읽고 염색되는 혈구세포수를 측정한 후 통계분석을 실시하였다.
- , 2016). 이러한 결과와 정보를 바탕으로 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.)과 대장균(E. coli K-12)을 24시간 동일한 조건, 동일한 양을 배양하였다(106 CFU). 배양 후 3번의 원심분리를 통하여 배양된 세균자체를 완전히 제거 하였다.
- ,2016). 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.)과 대장균(E.coli K-12)을 동일한 조건에서 배양 하고 배양된 세균들은 제거한 후 다양한 분비물질들이 존재 할 거라 예상되는 배양액만을 유충에 주사하여 면역반응 여부를 조사하였다. 추후에 대장균(E.
- 간단히 설명하면, 장이 적출될 4령 유충은 95% 알코올에 서 10분간 큐티클(Cuticle) 표면을 소독하였다. 해부현미경(Leica DM IL LED)하에서 중장(Midgut)과 종장(Hindgut)을 적출하고 초음파분쇄기에서 분쇄 한 후 PBS 버퍼(NaH2PO4, Na2HPO4 and NaCl (pH = 7.2))에서 3반복 하여 세척하였다. 약 ~500 µl 상층액은 4℃에서 15분간3,000 rpm으로 원심분리 하여 상층액과 조직을 분리하였다.
- 현미경 관찰 결과들의 신뢰도를 높이고 리소좀의 활성화를 정량적으로 측정하기 위하여 유세포분석기(Flowcytometry)를 통하여 분석하였다. 유충 한 마리당 10,000개의 혈구세포를 읽고 염색되는 혈구세포수를 측정한 후 통계분석을 실시하였다.
- 혈림프 채혈은 4령 유충의 등(Dorsal) 부분을 70% 에탄올(Etanol)을 사용하여 멸균 한 뒤 유리 파스츄어피펫(Pasteurpipette; > 2mm) 채혈기를 사용하여 약 ~500 µl의 혈림프(Hemolymph)를 추출하였다. 혈림프는 항응고제(98 mM NaOH, 186mM NaCl, 17 mM EDTA, 4 1 mM citric acid, pH 4.5)를 이용하여 약 1:1 비율로 혼합하였고 4℃, 1,000 g 에서 10 분 간 원심분리 한 후 혈구세포들을 관찰 하였다. 혈구세포들은 세포내 리소좀(Lysosome)만 특별히 염색하는 LysoTracker Red (7.
대상 데이터
- 5 mM KCl, ddH2O to 1000 mL,10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 30 mM glucose)에서 37℃에서 48시간 배양하여 미생물을 분리하였다. Lee (2016) 등에 의하여보고 된 바와 같이 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.;KX371567)을 분리하여 공생균주로 사용하였다. 대장균(E.
- 본 연구는 미생물 분비물질 자체가 곤충 면역반응을 촉발하는지에 대한 연구로서 재료 및 방법에 묘사한 것과 같이 두 종류의미생물을 배양, 이용하였다. 크리세오박테리움(Chryseobacteriumsp.
- 본 연구에 이용한 흰점박이꽃무지(P. brevitarsis seulensis) 유충은 Kwon (2009)에 의한 방법으로 사육하였다. 사육 온도는 25 ± 1℃, 광조건은 16:8 (L:D) h, 상대습도는 60 ± 10%로서 살균된 오크나무 톱밥을 먹이로 제공하면서 사육하였다.
- 혈구세포들 관찰을 위하여 라이카 현미경(Leica DM2500 upright and Leica DMI 3000B inverted fluorescence microscopes), 컨포컬(Olympus FV1000 confocal microscope)현미경을 사용하였다.
- 혈림프 채혈은 4령 유충의 등(Dorsal) 부분을 70% 에탄올(Etanol)을 사용하여 멸균 한 뒤 유리 파스츄어피펫(Pasteurpipette; > 2mm) 채혈기를 사용하여 약 ~500 µl의 혈림프(Hemolymph)를 추출하였다.
데이터처리
- , 2014). 배양액 주입 후 면역반응 유도 시간은 12~180시간으로 정하였으며 표준통계 소프트웨어 프로그램을 사용하여 통계 분석하였다(IBM SPSS statistics 22.0).
이론/모형
- 분리된 배양액 10~40 µl를 직접 유충 혈강내 주입하여 생존율, 병원성 여부, 혈구세포들의 면역 활성화를 관찰 하였다. 병원성 여부 및 생존율 분석은 카플란-마이어 분석(Kaplan Meier survival) 방법을 사용하였고 혈구세포들의 면역반응은 혈구세포의 리소좀(Lysosome) 활성화를 지표로 사용하였다.
성능/효과
- 3C-1). 24시간 후 46.49%로 리소좀의 활성화가 지속적으로 유지되었고(Fig. 3C-2), 48시간 후 염색량 6.80%로 다시 감소하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 3C-3). 그러나 단순 배양액(LB media) 주입 유충들은 평균적으로 0.
- (A, B, C) After 1 hour of injection, lysosomes were not activated in any medium-challenged group. (A-1, B-1, and C-1) After 12 hours, the staining level in LB medium- or Ch medium-challenged larva remained very low at 2,70% or 4.78%, but the staining level in Ec medium-challenged larva soared to 53.09%. (A-2, A-3, B-2, and B-3) After 24 hours and 48 hours, larva injected with LB medium or Ch medium still maintained low activation of lysosomes.
- 1A). Fig. 1A와 같이 병원균 배양액(Ec media)을주입 한 그룹은 주입 150시간 이후 ~60% 이상의 유충이 사망하였으나 공생균 배양액(Ch media) 주입 유충은 주입 150시간 이후 ~60% 이상 생존하고 있음을 확인하였다(Fig. 1A). 단순배양액(LB media) 주입 그룹은 ~80% 이상 생존하는 것을 관찰하였다.
- Fig. 1B의 결과와 같이 흰점박이꽃무지(P. brevitarsis seulensis) 유충에서 발생한 멜라닌화가 면역반응과 직접 연관이 있는 것인지를 혈구세포 면역 활성화 여부로 재확인하였다. Fig.
- 1A). 결론적으로,단순 배양액(LB media), 크리세오박테리움(Chryseobacteriumsp.) 배양액과 비교하여병원균인 대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media)에는 곤충의 병원성을 야기하는 분비물질(Metabolites;pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)들이 다량으로 존재하고 이러한 분비물질들이 곤충의 면역반응을 촉발하여 곤충이 생존하거나 또는 이러한 물질들에 의하여 사망하는 것으로 판단 할 수 있었다.
- 3C-3). 그러나 단순 배양액(LB media) 주입 유충들은 평균적으로 0.9% (Fig. 3A - A-3),크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) 배양액(Ch media)주입 유충들의 경우도 주입 12시간 후 최대 4.78%만 염색되는 것을 알 수 있었다(Fig. 3B - B-3). Fig.
- 2A-C). 그러나 주입 12시간 이후 대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media) 주입 곤충 그룹에서만 리소좀이 활성화 되는 것을 관찰 하였다(Fig.2C-1). 주입 48시간이 지나면서 대장균(E.
- 특히, 식균작용을 통하여 세포질내로 들어온 외래물질들은 활성화된 리소좀과 결합하여 리소좀내 다양한 효소들에 의하여 외래물질이 제거된다. 따라서 병원균인 대장균(E. coli K-12)배양액(Ec media) 내에는 곤충면역을 활성화 시키는 물질들이 다량으로 존재하고 이들을 제거하기 위하여 과립혈구세포의리소좀 활성화가 관찰 된 것으로 추정 할 수 있었다. 반대로 공생균인 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.
- coli K-12)배양액(Ec media) 내에는 곤충면역을 활성화 시키는 물질들이 다량으로 존재하고 이들을 제거하기 위하여 과립혈구세포의리소좀 활성화가 관찰 된 것으로 추정 할 수 있었다. 반대로 공생균인 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) 배양액(Ch media)에는 기주의 면역을 활성화 시키는 물질이 없거나 매우 적게 존재하는것으로 추정 할 수 있었다.
- 비록 본 연구에서는 많은 비용과 시간이 필요로 하는 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) 배양액에 존재하는 수 천종 이상의 분비물질들을 일일이 조사하지 못 하였으나 병원균인 대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media)에 존재하는 분비물질들과 분명한 차이가 있음을 추측 할 수 있었다. 이러한 차이가 흰점박이꽃무지(P.
- 위의 결과들은 병원성 미생물들이 성장하면서 배출하는 다양한 분비물질(Metabolites)들이 곤충에서는 면역 촉발 인자로 사용되고 있음을 나타낸다. 앞으로 공생균인 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.
- 1B에서도 확인 할 수 있었다. 유충에서 대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media)을 주입한 주사 자리가 72시간 이후부터 멜라닌화(melanization)화강하게 진행되었고 180시간까지 지속적으로 유지되면서 유충이 죽거나 강한 면역반응으로 건강하지 못 한 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 1B). 그러나 단순 배양액(LB media)과 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.
- coli K-12) 배양액(Ec media)에 존재하는 분비물질들과 분명한 차이가 있음을 추측 할 수 있었다. 이러한 차이가 흰점박이꽃무지(P. brevitarsis seulensis) 유충의 생존율과 면역반응에 영향을 주는 것으로 유추 할 수 있었다.
- 단순배양액(LB media) 주입 그룹은 ~80% 이상 생존하는 것을 관찰하였다. 주입 180시간 후 병원균 배양액(Ec media) 주입 그룹은 ~30% 이하, 공생균 배양액(Ch media) 주입 그룹은 ~60% 이상 생존율을 나타냈으며 컨트롤 그룹은(LB media) ~80% 이상 생존하고 있음을 최종적으로 확인하였다(Fig. 1A). 결론적으로,단순 배양액(LB media), 크리세오박테리움(Chryseobacteriumsp.
- 2C-1). 주입 48시간이 지나면서 대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media) 유충은 리소좀의 활성화가 점차 줄어드는 것을 확인 하였고 이는 병원성 물질들이 리소좀에 의하여 제거가 완료되는 것으로 추측 할 수 있었다(Fig. 2C-2). 단순 배양액(LB media)이나 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.
후속연구
- ) 분비물질들 차이를 비교하여 면역과 관련된 분비물질들을 모두 동정한다면 미생물 분비물질들 하나하나에 대한 곤충 면역 신호전달체계를 연구할 수 있는 기초를 제공 할 것이다. 동시에, 미생물 대사물질만 이용 면역 활성화, 억제, 질병예방, 치료 등 다양한 병리학 분야에도 적용 가능할 것으로 판단한다.
- 위의 결과들은 병원성 미생물들이 성장하면서 배출하는 다양한 분비물질(Metabolites)들이 곤충에서는 면역 촉발 인자로 사용되고 있음을 나타낸다. 앞으로 공생균인 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) 배양액(Ch media)내 존재하는 수 천 종 이상의 분비물질들 분석을 통하여 각각의 곤충 면역촉발 인자를 정확히 특정 한다면 원인 물질들에 의한 체계적인 곤충 면역 신호전달 연구, 미생물 감염 없이 면역 활성화, 면역 억제, 질병예방, 치료 등 다양한 병리학 분야에도 적용이 가능 할 것으로 판단한다.
- coli K-12)을 동일한 조건에서 배양 하고 배양된 세균들은 제거한 후 다양한 분비물질들이 존재 할 거라 예상되는 배양액만을 유충에 주사하여 면역반응 여부를 조사하였다. 추후에 대장균(E. coli K-12)에 의하여 분출되는 분비물질들과 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) 분비물질들 차이를 비교하여 면역과 관련된 분비물질들을 모두 동정한다면 미생물 분비물질들 하나하나에 대한 곤충 면역 신호전달체계를 연구할 수 있는 기초를 제공 할 것이다. 동시에, 미생물 대사물질만 이용 면역 활성화, 억제, 질병예방, 치료 등 다양한 병리학 분야에도 적용 가능할 것으로 판단한다.
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