L. monocytogenes는 Listeriosis를 일으키는 중요한 식중독 균으로 현재 국내 식품공전에서는 증균배양을 기초로 검출하며, 규격은 불검출로 관리하고 있다. 그러나 Listeria종 간의 혼합오염시 증균 과정에서 경쟁생육이 존재하여 L. monocytogenes 위음성의 가능성이 있다고 보고되고 있다. 국내 식품공전은 L. monocytogenes 증균을 위한 1차 배지로 규정되어 있으나 LEB 배지에서의 Listeria 종 간의 생육 연구는 보고된 바 없다. 본 연구는 식품에서 주로 검출되는 Listeria 속 4종(L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri)을 LEB배지에 혼합배양하며 증균과정에서 생육의 차이가 존재하는 것을 확인하였다. 특히, L. innocua에 의해 L. monocytogenes의 생육이 저해되며, L monocytogenes가 L. innocua보다 초기균수가 2.0 log CFU/mL 이상 오염이 되어있어야지만 L. innocua보다 생육이 잘 되는 것을 확인하였다. Listeria 종 간의 혼합오염이 있을 경우 현재 검출법으로는 L. monocytogenes의 검출이 어려울 수 있다고 판단된다. 따라서 L. monocytogenes 검출율을 높이는 새로운 증균배지 개발의 필요성을 확인하였다. 향후 본 연구는 L. monocytogenes 검출률을 높여 국내 식품의 식품 안전에 기여 할 수 있으며 국내 식품 관리 규격 개정 시 기초가 되는 참고 자료로 활용 할 수 있을 것으로 생각된다.
L. monocytogenes는 Listeriosis를 일으키는 중요한 식중독 균으로 현재 국내 식품공전에서는 증균배양을 기초로 검출하며, 규격은 불검출로 관리하고 있다. 그러나 Listeria종 간의 혼합오염시 증균 과정에서 경쟁생육이 존재하여 L. monocytogenes 위음성의 가능성이 있다고 보고되고 있다. 국내 식품공전은 L. monocytogenes 증균을 위한 1차 배지로 규정되어 있으나 LEB 배지에서의 Listeria 종 간의 생육 연구는 보고된 바 없다. 본 연구는 식품에서 주로 검출되는 Listeria 속 4종(L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri)을 LEB배지에 혼합배양하며 증균과정에서 생육의 차이가 존재하는 것을 확인하였다. 특히, L. innocua에 의해 L. monocytogenes의 생육이 저해되며, L monocytogenes가 L. innocua보다 초기균수가 2.0 log CFU/mL 이상 오염이 되어있어야지만 L. innocua보다 생육이 잘 되는 것을 확인하였다. Listeria 종 간의 혼합오염이 있을 경우 현재 검출법으로는 L. monocytogenes의 검출이 어려울 수 있다고 판단된다. 따라서 L. monocytogenes 검출율을 높이는 새로운 증균배지 개발의 필요성을 확인하였다. 향후 본 연구는 L. monocytogenes 검출률을 높여 국내 식품의 식품 안전에 기여 할 수 있으며 국내 식품 관리 규격 개정 시 기초가 되는 참고 자료로 활용 할 수 있을 것으로 생각된다.
Monitoring of Listeria monocytogenes, the causative agent of listeriosis, in food is inportant for public health. The Korean Food Standards Codex has adopted a 'zero-tolerance' policy for L. monocytogenes. The standard detection method of L. monocytogenes is based on enrichment. Thus, proper enrichm...
Monitoring of Listeria monocytogenes, the causative agent of listeriosis, in food is inportant for public health. The Korean Food Standards Codex has adopted a 'zero-tolerance' policy for L. monocytogenes. The standard detection method of L. monocytogenes is based on enrichment. Thus, proper enrichment methods need to be instituted to ensure quality control of the detection procedures. In this study, the growth of L. monocytogenes and Listeria innocua as a mixed culture in Listeria enrichment broth (LEB) was monitored during artificial contamination of enrichment culture. We confirmed competitive growth or interspecies inhibitory activity of L. monocytogenes and L. innocua. Interspecies growth differences and the inhibitory activity of different inoculation and mixtures L. innocua against L. monocytogenes were examined. The concentration of L. monocytogenes must be 2.0 log CFU/mL or more than L. innocua to grow better than L. innocua. It is known that Listeria spp. and L. monocytogenes show growth difference during LEB, resulting in the risk of false-negative results. The inhibition of L. monocytogenes by L. innocua was always observed when present at lower concentrations. However, it was confirmed that L. innocua suppressed when L. monocytogenes was present at a higher concentration. Therefore if a mixture of Listeria spp. is present, detecting L. monocytogenes is difficult. Thus, a new enrichment broth to improve the detection rate of L. monocytogenes is needed.
Monitoring of Listeria monocytogenes, the causative agent of listeriosis, in food is inportant for public health. The Korean Food Standards Codex has adopted a 'zero-tolerance' policy for L. monocytogenes. The standard detection method of L. monocytogenes is based on enrichment. Thus, proper enrichment methods need to be instituted to ensure quality control of the detection procedures. In this study, the growth of L. monocytogenes and Listeria innocua as a mixed culture in Listeria enrichment broth (LEB) was monitored during artificial contamination of enrichment culture. We confirmed competitive growth or interspecies inhibitory activity of L. monocytogenes and L. innocua. Interspecies growth differences and the inhibitory activity of different inoculation and mixtures L. innocua against L. monocytogenes were examined. The concentration of L. monocytogenes must be 2.0 log CFU/mL or more than L. innocua to grow better than L. innocua. It is known that Listeria spp. and L. monocytogenes show growth difference during LEB, resulting in the risk of false-negative results. The inhibition of L. monocytogenes by L. innocua was always observed when present at lower concentrations. However, it was confirmed that L. innocua suppressed when L. monocytogenes was present at a higher concentration. Therefore if a mixture of Listeria spp. is present, detecting L. monocytogenes is difficult. Thus, a new enrichment broth to improve the detection rate of L. monocytogenes is needed.
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문제 정의
L. monocytogenes와 L. innocua의 초기 오염 비율이 생육에 영향을 미치는 정도를 확인하기 위해 초기 접종량을 비율별로 조절하여 배양해 보았다. 배양 결과에 사용한 ALOA 선택배지는 L.
monocytogenes의 검출이 어려울 수 있다고 판단된다. 따라서 L. monocytogenes 검출율을 높이는 새로운 증균배지 개발의 필요성을 확인하였다.
문헌 조사에 의하면 Tryptic Soy Broth (TSB), Fraser broth의 영양배지나 2차 증균배지에서의 Listeria 종 간의 생육에 대한 연구결과가 보고되어있으나6,10,12) 국내 식품공전에서 규정된 LEB 배지에서의 Listeria 종 간의 생육 연구는 보고된 바 없다. 따라서 국내 식품에서 주로 검출되는 Listeria 속 4종(L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii,L. seeligeri)을 선정하여 LEB에 혼합 배양하고 생육을 확인하여 현재 검출법의 적합성을 확인해보고자 하였다.
innocua의 성장이 빨라서 불검출로 판정이 된 식품이 시중에 유통 될 경우 식중독을 일으킬 수 있다고 판단된다. 따라서, 본 연구에서는 현재 국내 식품 관리 기준 규격으로 설정 된 LEB 배지에서 L. monocytogenes를 검출하는데 한계가 있음을 확인하였다. Dahshan 등1)에 따르면 L.
제안 방법
35 ± 2℃,70 rpm 진탕 배양하면서 0, 24, 48시간에 Agosti & Ottaviani Listeria Agar (ALOA; Biomériux, Marcy L’Etoile, France)에 도말하고 35 ± 2℃에서 24시간 배양하여 각 균의 전형적인 집락을 계수하였다.
4종의 Listeria 균주를 200 μL를 HiYieldTM Genomic DNA Mini Kit (RBC Bioscience Co., Taipei, Taiwan)를사용하여 추출하였다.
, Foster City, CA)로 확인하였다. 4종의 균을 단독 배양한 것을 대조구로 하였다. 같은 방법으로 L.
Listeria species 4종 혼합 배양 시 각 균의 생육을 확인하기 위해 TSA+YE 0.6% 배지에서 35 ± 2℃, 24 ± 2시간 활성화 시킨 L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L.seeligeri를 McFarland 1.0로 맞춘 후 희석하고 동량 혼합하여 시험액을 제조하였다.
PCR mixture는 template DNA 2 μL, taqman fast advanced master mix (Applied biosystems) 10.0 μL에 L. monocytogenes, L. ivanovii와 L. seeligeri, L. innocua 각 primer를 0.2 μL, taqman probe 0.2 μL를 넣고 nuclease-free water 6.8 μL로 하여 전체 20 μL로 하여 ABI 7500 (Applied biosystems)을 사용하여 2종씩(1set: L. monocytogenes, L.innocua, 2set: L. monocytogenes, L. ivanovii, 3set: L. monocytogenes, L. seeligeri) duplex real-time PCR을 수행하였다.
TSA+YE 0.6% 배지에서 35 ± 2℃, 24 ± 2시간 활성화 시킨 L. monocytogenes와 L. innocua를 McFarland 1.0 로 맞춘 후 희석하고 초기 균수를 비율 별 혼합하여 시험액을 제조하였다.
monocytogenes:L. innocua (1:1, 2:1, 10:1, 100:1)로 제조하였고, LEB에초기 균수가 100 CFU/mL이 되도록 접종하였다. 35 ± 2℃,70 rpm 진탕 배양하면서 0, 24, 48시간에 Agosti & Ottaviani Listeria Agar (ALOA; Biomériux, Marcy L’Etoile, France)에 도말하고 35 ± 2℃에서 24시간 배양하여 각 균의 전형적인 집락을 계수하였다.
증폭 효율성(amplification efficiency,AE)은 AE = 10−1/s−1 (s: slope of standard curve)으로 산출하였다. 각 균은 35 ng DNA를 양성 대조구로 nucleasefree water를 음성 대조구로 사용하였다.
4종의 균을 단독 배양한 것을 대조구로 하였다. 같은 방법으로 L. monocytogenes와 L. innocua (또는 L.ivanovii, L. seeligeri)을 1:1로 혼합한 2종 혼합배양액의 생육도 확인하였다.
35 ± 2℃,70 rpm 진탕 배양하면서 0, 24, 48시간에 Agosti & Ottaviani Listeria Agar (ALOA; Biomériux, Marcy L’Etoile, France)에 도말하고 35 ± 2℃에서 24시간 배양하여 각 균의 전형적인 집락을 계수하였다. 결과값은 log값으로 변환하여 분석하였으며 2종의 균을 단독 배양한 것을 대조구로 하였다.
균주를 접종한 배지는 35 ± 2℃, 70 rpm 진탕배양하면서 시간에 따른 각 균의 생육을 real-time PCR System (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)로 확인하였다.
사용 균주는 30% glycerol stock vial에 현탁 후 −70℃ deep freezer에 냉동 보관하였으며, 필요 시 tryptic soy agar(TSA; Merck., Darmstadt, Germany)에 0.6% yeast extract(YE; Becton-Dickinson., Erembodegem, Belgium) 포함한 배지에 35 ± 2℃, 24 ± 2시간, 3회에 걸쳐 계대 배양 하여 활성화 시킨 후 사용하였다.
증폭 효율성(amplification efficiency,AE)은 AE = 10−1/s−1 (s: slope of standard curve)으로 산출하였다.
대상 데이터
monocytogenes (ATCC 15313),L. innocua (ATCC 33090), L. ivanovii (ATCC 19119), L.seeligeri (ATCC 35967)로 American type culture collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양 받아 사용하였다. 사용 균주는 30% glycerol stock vial에 현탁 후 −70℃ deep freezer에 냉동 보관하였으며, 필요 시 tryptic soy agar(TSA; Merck.
본 시험에 사용된 균주는 L. monocytogenes (ATCC 15313),L. innocua (ATCC 33090), L.
데이터처리
정량 분석을 위해 표준 균주에 대한 standard curve는 PCR 3회 반복의 각 시료에 대한 Ct 평균값 ± 표준편차 값으로 작성 후 회귀분석을 통해 계산식을 산출하였다.
성능/효과
monocytogenes의 생육에 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있었다. L. innocua의 생육은 L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri의 영향을 받지 않으며 L. ivanovii, L. seeligeri는 L. monocytogenes와 L.innocua에 의해 생육이 저해된 결과를 얻었다.
Listeria 속 4종 혼합 배양 시 각 균의 생육을 확인한 결과 L. innocua의 균수가 가장 최고치에 도달한 21시간에서 단독배양액 대비 혼합배양액에서 97.95% 생육하여 거의 동일하였던 반면, L. monocytogenes는 24시간에 87.86%,L. ivanovii, L.
8%,L. monocytogenes를 21.7% 검출하였는데, L. innocua에 비해 L. monocytogenes의 prevalence가 매우 낮은 것을 볼 수 있다. 이는 L.
2균을 단독 배양한 결과는 접종량에 따른 두 균의 생육은 동일하였다. 그러나 2균을 동량 접종하여 혼합 배양한 결과 L. monocytogenes와 L. innocua의 차이는 24시간에 1.9 log CFU/mL, 48시간에 1.5 log CFU/mL으로 L. monocytogenes가 L. innocua에 비해 1.0 CFU/mL 이상 적게 생육하였다. L.
13%로 단독배양액에 비해 혼합배양액에서의 생육이 저해되었다. 따라서 Listeria 종 간의 혼합 배양 시 생육차이가 존재하는 것을 알 수 있었다(Fig. 1).
이는 Listeria 종 간의 혼합 배양 시 생육의 차이가 있다는 보고와 일치하였다6,10,12-15). 반면, L.ivanovii, L. seeligeri는 L. monocytogenes의 생육에 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있었다. L.
monocytogenes 증균을 위한 1차 배지로 규정되어 있으나 LEB 배지에서의 Listeria 종 간의 생육 연구는 보고된 바 없다. 본 연구는 식품에서 주로 검출되는 Listeria 속 4종(L. monocytogenes, L. innocua, L.ivanovii, L. seeligeri)을 LEB배지에 혼합배양하며 증균과정에서 생육의 차이가 존재하는 것을 확인하였다. 특히, L.
seeligeri)을 LEB배지에 혼합배양하며 증균과정에서 생육의 차이가 존재하는 것을 확인하였다. 특히, L. innocua에 의해 L. monocytogenes의 생육이 저해되며, L monocytogenes가 L. innocua보다 초기균수가 2.0 log CFU/mL 이상 오염이 되어있어야지만 L. innocua보다 생육이 잘 되는 것을 확인하였다. Listeria 종 간의 혼합오염이 있을 경우 현재 검출법으로는 L.
후속연구
따라서 향후 Listeria interspecies 간의 생육의 차이의 원인을 규명할 필요가 있으며, L. monocytogenes의 검출률을 높이기 위해 L. monocytogenes만을 선택적으로 증균할 수 있는 새로운 증균배지의 개발이 필요하다고 생각된다. 또한 L.
monocytogenes만을 선택적으로 증균할 수 있는 새로운 증균배지의 개발이 필요하다고 생각된다. 또한 L. monocytogenes 검사 시 배양시간을 반드시 지켜야 하며 L. innocua가 검출되었을 때는 반복 실험을 통해서 L. monocytogenes 검사를 비교 분석하여야 한다. 본 연구는 결과는 L.
monocytogenes 검사를 비교 분석하여야 한다. 본 연구는 결과는 L. monocytogenes 검출률을 높여 국내 식품의 식품 안전에 기여 할 수 있으며 국내 식품 관리 규격 개정 시 기초가 되는 참고 자료로 활용 할 수 있을 것으로 생각된다.
향후 본 연구는 L. monocytogenes 검출률을 높여 국내 식품의 식품 안전에 기여 할 수 있으며 국내 식품 관리규격 개정 시 기초가 되는 참고 자료로 활용 할 수 있을 것으로 생각된다
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
L. monocytogenes의 생육환경의 특징은?
최소 감염량은 면역력이 약한 위험군 혹은 식품별로 차이가 있으나 일반적으로 102~103CFU/g로 제시되고 있어 낮은 오염수준에서도 식중독이 발생할 수 있고, 특히 면역력이 약한 임산부에게 치명적인 균이다2,4). 토양, 물 등 자연환경에 흔히 존재하고 열, 염기, 산, 염에 강하여 식품에 쉽게 오염되며 최적 생육온도는 30~37oC이지만 0~4oC 냉장온도에서도 생육하는 저온균으로4,5) 국내에서 높은 소비량을 유지하고 있는 육류가공품, 치즈, 우유, 훈제연어, 채소류에서 주로 검출되기 때문에 이에 대한 관리가 중요하다2,3). 따라서 국내 식품의약품안전처를 비롯하여 World Health Organization (WHO) 와 Food and Drug Administration (FDA) 등 여러 기관은 L.
L. monocytogenes란 무엇인가?
Listeria monocytogenes는 통성혐기성 gram 양성 무아포단간균으로 30% 이상의 높은 치사율을 보이는 인수공통감염병 Listeriosis를 유발하기 때문에 임상적으로 중요한 위해균으로 분류된다1-3). 최소 감염량은 면역력이 약한 위험군 혹은 식품별로 차이가 있으나 일반적으로 102~103CFU/g로 제시되고 있어 낮은 오염수준에서도 식중독이 발생할 수 있고, 특히 면역력이 약한 임산부에게 치명적인 균이다2,4).
L. monocytogenes의 검출방법은 어떤 게 있는가?
L. monocytogenes의 검출방법은 증균배양을 이용한 culture-based 검출법, PCR 검출법, ELISA 검출법, DNAmicroarray, LAMP 검출법 등이 있지만7), 일반 산업체에서 PCR, ELISA 등으로 검출하기에는 분석 비용, 기술력 부족 등으로 어려움이 있으며, 결과 확인을 위해 순수한 분리주를 분리 후 동정해야 하기 때문에 증균배양 시험법을 선호하고 있다. 또한, 식품공전에는 culture-based 검출법이 등재되어 있으므로8) 품질관리시 증균배양은 필수 불가결하다.
참고문헌 (18)
Dahshan H, Merwad AM, Mohamed TS. Listeria Species in Broiler Poultry Farms: Potential Public Health Hazards. J. Microbiol. biotech. 26, 1551-1556 (2016).
Chong Y, Kim H, Lee S. Bacteriological characteristics of the Listeria monocytogenes isolated from a blood of an SLE patient. J. Kor. Soc. Microbiol. 8: 29. 32, (1973).
Vlaemynck G, Lafarge V, Scotter S. Improvement of the detection of Listeria monocytogenes by the application of ALOA, a diagnostic, chromogenic isolation medium. J. Appl. Microbiol. 88, 430-441 (2000).
Carvalheira A, Eusebio C, Silva J, Gibbs P, Teixeira P. Influence of Listeria innocua on the growth of Listeria monocytogenes. Food Control. 21, 1492-1496 (2010).
Ministry of Food and Drug Safty. Korea Food Standards Codex, from: http://www.foodsafetykorea.go.kr/foodcode/index.jsp (2016. 12.29).
Kim YS, Ha SD. Detection and Isolation of foodborne bacteria using conventional culture media. Safe Food. 1, 5-15 (2006).
Beumer R, Te Giffel M, Anthonie S, Cox L. The effect of acriflavine and nalidixic acid on the growth of Listeria spp. in enrichment media. Food Microbiol. 13, 137-148 (1996).
Besse NG, Audinet N, Kerouanton A, Colin P, Kalmokoff M. Evolution of Listeria populations in food samples undergoing enrichment culturing. Int. J. Food. Microbiol. 104, 123-134 (2005).
Cornu M, Kalmokoff M, Flandrois J-P. Modelling the competitive growth of Listeria monocytogenes and Listeria innocua in enrichment broths. Int. J. Food. Microbiol. 73, 261-274 (2002).
Besse NG, Barre L, Buhariwalla C, Vignaud ML, Khamissi E, Decourseulles E, et al. The overgrowth of Listeria monocytogenes by other Listeria spp. in food samples undergoing enrichment cultivation has a nutritional basis. Int. J. Food. Microbiol. 136, 345-351 (2010).
Yokoyama E, Shibusawa Y, Maruyama S, Katsube Y, Mikami T. Influence of bacteriocin-like substance, generation times, and genetic profiles of Listeria innocua on the isolation of Listeria monocytogenes. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases. 28, 177-186 (2005).
Jamali H, Radmehr B, Thong KL. Prevalence, characterisation, and antimicrobial resistance of Listeria species and Listeria monocytogenes isolates from raw milk in farm bulk tanks. Food Control. 34, 121-125 (2013).
Gu DW, Chung CI, Jeong DK, Nam ES. Contamination of Listera spp. in market beef. J. Food Hyg. Saf., 10, 89-95 (1995).
Hage E, Mpamugo O, Ohai C, Sapkota S, Swift C, Wooldridge D, et al. Identification of six Listeria species by realtime PCR assay. Letter. Appl. Microbiol. 58, 535-540 (2014).
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