증균배지 및 DNA 추출법 개량을 통한 Listeria monocytogenes의 검출기법 개선 연구 Improvement of the Detection Technique of Listeria monocytogenes through Modification of the Enrichment Medium and DNA Extraction Buffer원문보기
기존의 L. monocytogenes 증균배지를 개량함으로써 증균배지를 개발하여 L. monocytogenes의 증균 효율을 높이며, DNA 추출에 사용되는 용해버퍼 및 용해조건을 개발함으로써 식육 및 식육가공품에서 L. monocytogenes를 효율적이고 신속하게 검출하고자 하였다. 식품공전에 등재되어 있는 L. monocytogenes 증균배지의 증균 효율을 비교하였으며, Listeria Enrichment Broth (LEB)가 가장 우수한 증균 효율을 보였다. LEB에 탄소원, 질소원, 미네랄 등 다양한 성분을 첨가하여 증균배지를 개발하였으며, 그 결과 LEB에 0.1% pyruvate, 0.1% ferric citrate를 첨가한 개발 증균배지에서 L. monocytogenes가 가장 빠르게 증균되었다. L. monocytogenes의 DNA를 신속하고 효율적으로 추출하기 위해 용해버퍼와 용해조건을 개발하였으며, 그 결과 0.5% 또는 1% N-lauroylsarcosine sodium salt에 0.5 N NaOH와 0.5 M EDTA가 혼합된 용해버퍼를 이용하여 실온에서 30분 간 L. monocytogenes 세포를 용해시키는 것이 DNA의 순도와 수율, 신규성과 경제적 측면에서 가장 우수한 것으로 확인되었다. 결론적으로 본 연구에서 개발된 증균배지 및 DNA 추출법을 활용한다면 식육 및 식육 가공품에서 L. monocytogenes를 보다 신속하게 검출할 수 있을 것이다.
기존의 L. monocytogenes 증균배지를 개량함으로써 증균배지를 개발하여 L. monocytogenes의 증균 효율을 높이며, DNA 추출에 사용되는 용해버퍼 및 용해조건을 개발함으로써 식육 및 식육가공품에서 L. monocytogenes를 효율적이고 신속하게 검출하고자 하였다. 식품공전에 등재되어 있는 L. monocytogenes 증균배지의 증균 효율을 비교하였으며, Listeria Enrichment Broth (LEB)가 가장 우수한 증균 효율을 보였다. LEB에 탄소원, 질소원, 미네랄 등 다양한 성분을 첨가하여 증균배지를 개발하였으며, 그 결과 LEB에 0.1% pyruvate, 0.1% ferric citrate를 첨가한 개발 증균배지에서 L. monocytogenes가 가장 빠르게 증균되었다. L. monocytogenes의 DNA를 신속하고 효율적으로 추출하기 위해 용해버퍼와 용해조건을 개발하였으며, 그 결과 0.5% 또는 1% N-lauroylsarcosine sodium salt에 0.5 N NaOH와 0.5 M EDTA가 혼합된 용해버퍼를 이용하여 실온에서 30분 간 L. monocytogenes 세포를 용해시키는 것이 DNA의 순도와 수율, 신규성과 경제적 측면에서 가장 우수한 것으로 확인되었다. 결론적으로 본 연구에서 개발된 증균배지 및 DNA 추출법을 활용한다면 식육 및 식육 가공품에서 L. monocytogenes를 보다 신속하게 검출할 수 있을 것이다.
In this study we developed an enrichment medium and lysis buffers to detect Listeria monocytogenes in meat and processed meat products under various lysis conditions. The enrichment efficiency of L. monocytogenes medium listed in the Food Standards was compared, and thus, Listeria Enrichment Broth (...
In this study we developed an enrichment medium and lysis buffers to detect Listeria monocytogenes in meat and processed meat products under various lysis conditions. The enrichment efficiency of L. monocytogenes medium listed in the Food Standards was compared, and thus, Listeria Enrichment Broth (LEB) was modified by adding supplements such as carbon source and minerals. The lysis buffers were developed to extract L. monocytogenes DNA quickly and efficiently under various lysis conditions. L. monocytogenes was most rapidly grown in LEB containing 0.1% pyruvate and 0.1% ferric citrate. A lysis buffer mixed with 0.5% or 1% N-lauroylasrcosine sodium salt, 0.5 N NaOH and 0.5 M EDTA for 30 min at room temperature was found to be the best in terms of DNA purity and yield. These results indicate that developed enrichment medium and lysis buffer can be used to detect L. monocytogenes in meat and processed meat products rapidly and efficiently.
In this study we developed an enrichment medium and lysis buffers to detect Listeria monocytogenes in meat and processed meat products under various lysis conditions. The enrichment efficiency of L. monocytogenes medium listed in the Food Standards was compared, and thus, Listeria Enrichment Broth (LEB) was modified by adding supplements such as carbon source and minerals. The lysis buffers were developed to extract L. monocytogenes DNA quickly and efficiently under various lysis conditions. L. monocytogenes was most rapidly grown in LEB containing 0.1% pyruvate and 0.1% ferric citrate. A lysis buffer mixed with 0.5% or 1% N-lauroylasrcosine sodium salt, 0.5 N NaOH and 0.5 M EDTA for 30 min at room temperature was found to be the best in terms of DNA purity and yield. These results indicate that developed enrichment medium and lysis buffer can be used to detect L. monocytogenes in meat and processed meat products rapidly and efficiently.
따라서 본 연구에서는 증균배지를 개발하여 L. monocytogenes의 증균 효율을 높이며, 현장에서의 사용 용이성이 있고 저렴한 DNA 추출과 관련된 각종 buffer 및 이에 맞는 세포 용해 조건을 개발함으로써 L. monocytogenes의 검출기법을 개선하고자 하였다.
제안 방법
LEB에 성분과 농도를 달리 첨가하여 개발 증균배지를 제조하였다. 단일성분을 첨가한 개발 증균배지 15종과 혼합성분을 첨가한 개발 증균배지 5종을 제조하여 개발 증균배지 별 L. monocytogenes의 증균 효율을 분석하였다. 단일성분을 첨가한 개발 증균배지의 L.
증균배지 3종 중 증균 효율이 뛰어나고 사용빈도가 높은 증균배지(LEB)를 선택하여 배지의 성분을 개량함으로써 증균배지를 개발하였다. 증균배지 개발에 사용된 성분은 탄소원으로써 pyruvate, 질소원으로써 cysteine, 미량 무기질로써 ferric citrate, iron chloride (FeCl2), thiamine hydrochloride, buffer로써 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS), 항생제로써 polymyxin B가 일정 농도로 사용되었다(Table 1).
대상 데이터
3개의 L. monocytogenes 균주(L. monocytogenes ATCC13932, ATCC51174, ATCC BAA-839)의 단일집락을 10 mL의 tryptic soy broth에 0.6% yeast extract이 첨가된 배지(TSBYE; Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)에 접종하여 30°에서 24시간 배양하였다. 배양액 중 0.
증균배지 3종 중 증균 효율이 뛰어나고 사용빈도가 높은 증균배지(LEB)를 선택하여 배지의 성분을 개량함으로써 증균배지를 개발하였다. 증균배지 개발에 사용된 성분은 탄소원으로써 pyruvate, 질소원으로써 cysteine, 미량 무기질로써 ferric citrate, iron chloride (FeCl2), thiamine hydrochloride, buffer로써 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS), 항생제로써 polymyxin B가 일정 농도로 사용되었다(Table 1). L.
데이터처리
, Winooski, VT, USA)를 이용하여 측정하였다. 추출된 DNA 의 순도와 수율이 적합한지 확인하기 위해서 상용화된 DNA 분리 및 정제 키트 2종(KIT1, KIT2)을 이용하여 추출된 DNA의 순도 및 수율과 비교하였다. 이를 3회 반복하여 실험하였다.
1% buffered peptone water (Becton, Dickinson and Company)로 적절히 십진희석하고 TSAYE에 평판도말 하였다. 평판도말한 배지를 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 집락을 계수하고, 개발 증균배지와 LEB의 증균 효율을 비교하였다. 이를 3회 반복하여 실험하였다.
이론/모형
식품공전에 등재되어 있는 L. monocytogenes 증균배지 3종(Listeria Enrichment Broth (LEB; Becton, Dickinson and Company), UVM-modified Listeria Enrichment Broth (UVM-LEB; Becton, Dickinson and Company), PALCAM Broth (PB; MB cell; Log Angeles, CA, USA))을 배지 제조법에 따라 제조하였다. L.
성능/효과
결론적으로 LEB에 0.1% pyruvate과 0.1% ferric citrate를 첨가한 증균배지가 기존 LEB에 비하여 동일 시간 내에(12시간) L. monocytogenes를 더 증균시켜 증균 효율을 높이는 것으로 확인되었다. 또한 L.
최종적으로 DNA의 순도와 현장 적용 가능성, DNA 추출 방법의 신규성과 경제적 측면을 고려하여 용해버퍼 및 용해조건을 선정하였다. 그 결과, 0.5% NLS sodium salt + 0.5 N NaOH + 0.5 M EDTA 또는 1% NLS sodium salt + 0.5 N NaOH + 0.5 M EDTA를 용해버퍼로 이용하여 실온에서 30분 간 용해시키는 것이 DNA를 순도 높게 적절한 수율로 추출해내는 것으로 나타나 이를 DNA 추출 방법으로 선정하였다.
monocytogenes의 DNA 추출 시 개발된 용해버퍼 및 용해조건을 활용한다면 순도 높고 적절한 수율의 DNA를 단 시간에 저렴한 가격으로 추출해낼 수 있다. 따라서 본 연구에서 개발된 증균배지와 DNA 추출법을 결합한다면, 식육 및 식육가공품에 오염된 L. monocytogenes를 식품공전법을 사용하였을 때 보다 신속하게 검출할 수 있을 것으로 사료된다.
후속연구
monocytogenes의 성장 및 증식에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 본 연구결과를 활용하여 background flora는 억제시키고 L. monocytogenes만을 선택적으로 증균시킬 수 있는 증균배지 개발을 위한 추가 실험이 필요할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Listeria monocytogenes란 무엇인가?
Listeria monocytogenes는 치사율이 20-30%로 매우 높은 그람양성의 식중독 세균으로 식육 및 식육가공품, 치즈, 아이스크림 등을 포함한 다양한 축산식품에서 검출되는 세균이다1-5). L.
L. monocytogenes는 어떤 단계를 통해 검출되는가?
우리나라 식품공전에 따르면 증균배양, 분리배양 및 확인시험의 단계를 통해 L. monocytogenes를 검출하고 있다9).
L. monocytogenes를 확인하는데 소요되는 시간을 줄이기 위한 시험법은?
monocytogenes의 오염 여부를 확인할 때까지 제품의 유통을 보류한다면 상업적인 관점에서 3일은 판매 제품의 품질을 저하시킬 뿐만 아니라 시험 완료시까지의 저장고 공간 확보의 어려움, 유통 지연으로 인한 경제적 이익 감소 등의 문제가 발생할 가능성이 높다. 따라서 증균배양 시간을 줄이고, 적은 시간이 소요되는 빠른 확인시험법이 필요한데, 그것의 대안으로 증균배지의 개량과 conventional polymerase chain reaction (PCR)을 활용한 확인시험이 있다11,12). 증균배지는 일반적인 배지보다 특정 세균, 본 연구에서는 L.
참고문헌 (18)
Chen, Y., Chen, M., Wang, J., Wu, Q., Cheng, J., Zhang, J., Sun, Q., Xue, L., Zeng, H., Lei, T., Pang, R., Ye, Q., Wu, S., Zhang, S., Wu, H., Li, W., Kou, X., Heterogeneity, characteristics, and public health implications of Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods and pasteurized milk in China. Front. Microbiol., 11, 642 (2020).
Demaitre, N., Van Damme, I., De Zutter, L., Geeraerd, A.H., Rasschaert, G., De Reu, K., Occurrence, distribution and diversity of Listeria monocytogenes contamination on beef and pig carcasses after slaughter. Meat Sci., 108177 (2020).
Lee, J., Gwak, E., Lee, H., Ha, J., Lee, S., Kim, S., Oh, M.H., Park, B.Y., Choi, K.H., Yoon, Y., Effects of low $NaNO_2$ and NaCl concentrations on Listeria monocytogenes growth in emulsion-type sausage. Asian-Australasian J. Anim. Sci., 30, 432-438 (2017).
Liu, Y., Sun, W., Sun, T., Gorris, L.G., Wang, X., Liu, B., Dong, Q., The prevalence of Listeria monocytogenes in meat products in China: A systematic literature review and novel meta-analysis approach. Int. J. Food Microbiol., 312, 108358 (2020).
Tangwatcharin, P., Sorapukdee, S., Kongsrirat, K., Sousvided restructured goat steaks: process optimized by thermal inactivation of Listeria monocytogenes and their quality characteristics. Food Sci. Anim. Resour., 39, 863-876 (2019).
Thangavel, G., Subramaniyam, T., Antimicrobial efficacy of Leuconostoc spp. isolated from Indian meat against Escherichia coli and Listeria monocytogenes in Spinach leaves. Food Sci. Anim. Resour., 39, 677-685 (2019).
Ministry of Food and Drug Safety, (2020, July 14). Food standards. Retrieved from http://www.foodsafetykorea.go.kr/foodcode/index.jsp
Lee, Y., Yoon, Y., Seo, Y., Kim, S., Ha, J., Lee, J., Choi, Y., Oh, H., Kim, Y., Kang, J., Park, E., Kim, W.I., Lee, S., Combined enrichment and quantitative polymerase chain reaction to improve sensitivity and reduce time of detection of Listeria monocytogenes in mushrooms. Foodborne Pathog. Dis., 17, 276-283 (2020).
Delibato, E., Gattuso, A., Minucci, A., Auricchio, B., De Medici, D., Toti, L., Castangnola, M., Cpoluongo, E., Gianfranceschi, M.V., PCR experion automated electrophoresis system to detect Listeria monocytogenes in foods. J. Sep. Sci., 32, 3817-3821 (2009).
Furrer, B., Candrian, U., Hoefelein, C., Luethy, J., Detection and identification of Listeria monocytogenes in cooked sausage products and in milk by in vitro amplification of haemolysin gene fragments. J. Appl. Bacteriol., 70, 372-379 (1991).
McLaughlin, H.P., Hill, C., Gahan, C.G., The impact of iron on Listeria monocytogenes; inside and outside the host. Curr. Opin. Biotechnol., 22, 194-199 (2011).
Popa, O.P., Murariu, D.U.M.I.T.R.U., Popa, L.O., Comparison of four DNA extraction methods from invasive freshwater bivalve species (Mollusca: Bivalvia) in Romanian fauna. Trav. Mus. Natl. Hist. Nat. Grigore Antipa, 6, 527-536 (2007).
Poms, R., Glossl, J., Foissy, H., Increased sensitivity for detection of specific target DNA in milk by concentration in milk fat. Eur. Food Res. Technol., 213, 361-365 (2001).
Thermo Fisher Scientific, (2020, August 11). PCR setup-Six Critical Components to Consider. Retrieved from https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/cloning/cloninglearning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcr-reagents-enzymes/pcr-component-considerations.html
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