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문제 정의
- 내염성의 발효유산균이 선택적으로 생장할 수 있도록 조절해 주는 역할을 하고 있다고 알려져 있다18). 따라서 본 연구는 소금 처리 및 발효에 따른 더덕의 기간별 화학적 특징과 미생물학적인 변화를 모니터링하고, 발효에 따른 활성 물질과 항지질, 항당뇨 효능을 검증하여 활성 성분을 높인 발효 한약을 개발하고자 시행되었다.
- 여러 결과를 종합해 봤을 때, 4주가 최적의 발효 조건이라 사료되며 소금을 처리하여 발효하였을 때, 그 효과가 극대화되는 것으로 사료된다. 본 연구는 처음으로 더덕의 자연 발효 및 소금 처리 자연 발효 특성을 분석했다는 점에서 의의가 있다. 하지만 소금 처리 시에 온도나 농도를 엄격히 통제하지 못했다는 점에서 그 한계가 있다.
제안 방법
- 6 well platedp 4×105 cells/well의 양으로 seeding한 후 37℃, CO2배양기에 24시간 배양했다. 1 mM free fatty acid (FFA) (Oleic acid:palmitic acid=2:1)와 30% 에탄올로 추출한 추출물을 100 mg/mL의 농도로 처리하여 24시간 배양 후 Oil red O 염색으로 간세포의 지방량을 측정하였다. Oil red O 염색은 배양된 세포를 phosphate buffer saline으로 3번 세척 후 4% formalin 용액에 5분간 배양하여 2시간 동안 세포를 고정하였다.
- 2차 PCR은 GC clamp가 부착된 GC338F (5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’)와 518R (5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)을 사용하여 수행하였다.
- 4시간 동안 반응시킨 후, 배지를 제거하고, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) (Welgene Inc., Gyeongsan, Korea)로 세척한 후 50 μL의 DPBS를 첨가한 후, 세포의 2-NBDG 흡수량을 microplate reader (Spectramax Plus, Molecular Devices Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
- Louis, MO, USA) 50 μL를 혼합 후 실온에서 10분간 반응시켰다. 720 nm에서 UV ELISA microplate reader (Spectramax Plus, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였고, gallic acid를 표준물질로 표준곡선을 작성하여 총 폴리페놀 함량을 환산했다.
- DGGE 분석을 통해 발효에 따른 미생물의 분포 변화를 확인하였다. 소금을 첨가하지 않은 더덕군에서는 Serratia species, Uncultured Klebsiella sp.
- , Carlsbad, CA, USA)를 사용, total DNA를 추출하였고, universal bacterial 16s rRNA gene primer인 27F (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)와 1492R (5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’)을 이용하여 nested-PCR을 수행하였다. PCR 산물은 1% agarose gel에 전기 영동하여 크기를 확인한 후 약 1,5 kb에서 증폭된 밴드만을 절단하여 Accuprep gel purification kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 정제하였다. 2차 PCR은 GC clamp가 부착된 GC338F (5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’)와 518R (5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)을 사용하여 수행하였다.
- PCR-DGGE를 통해 분리된 DNA 밴드의 염기서열을 분석하고 동정하기 위하여 각 위치의 밴드를 절단 후 tube에 옮겨 Gel & PCR Purification System (BioFACT Co. Ltd., Daejeon, Korea)의 protocol을 변형하여 실시하였다.
- 근육세포의 당 처리 정도를 평가하기 위해 C2C12 세포의 2-[N-(7-160 nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxyd-glucose (2-NBDG) 흡수량을 측정하였으며, 400 μg/mL의 농도에서는 양성대조군으로 metformin 처리 그룹을 함께 분석하였다.
- 더덕의 발효 기간에 따른 미생물 변화 과정을 비교하기 위하여 PCR–DGGE를 수행하였다.
- 더덕의 발효 동안의 생균수 변화를 알아보기 위해 총균수 및 유산균 수를 측정하였다. 더덕의 총균수 및 유산균은 발효가 진행됨에 따라 2주에서 가장 많이 측정되었고, 4주가 되어감에 따라 감소하는 것이 관찰되었다.
- 본 연구는 자연발효 더덕을 제조하여 발효 기간에 따른 더덕의 미생물 특성과 활성 물질 변화를 조사하였으며, 더불어 소금 처리에 따른 차이를 분석하였다. 더덕의 발효 진행 정도는 pH와 총 당 함량으로 알아보았다. 4주간의 발효 진행에 따라 더덕 및 소금 처리 더덕의 pH가 감소하여 산도가 증가하는 것이 확인되었다.
- 더덕의 발효 진행에 따른 활성 성분의 변화를 알아보기 위해 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 분석하였다. 폴리페놀과 플라보노이드는 이전 항산화 연구에서 지표로 사용된 바 있다14).
- 매 2일마다 배지를 교환하고 6일 후 분화가 약 90% 정도 완료 시에 glucose-free DMEM에 2-NBDG 75 μg/mL가 포함된 배지로 교환한 후, 더덕 추출물, 양성 대조군인 metformin (2.5 mM) 및 glucose uptake inhibitor인 apigenin (100 μM)을 각각 처리하였다.
- 발효 경과에 따른 미생물의 생균수를 측정하였다. 총균수와 유산균 수는 더덕군에서 2주에서 최고치를 보였으나 4주까지 발효가 진행됨에 따라 감소하는 양상이 관찰되었고, 소금 처리군에서는 발효가 진행됨에 따라 4주까지 증가하는 양상을 보였다.
- 발효 더덕의 간세포에서의 지방 억제능을 평가하기 위해 HepG2 세포에 유리지방산을 처리하여 지방축적 양을 관찰하였다. 400 μg/mL에서는 유리지방산 처리군과 더덕 및 소금 처리 더덕군과의 차이가 관찰되지 않았으나, 800 μg/mL에서 유리지방산 처리군에 비해 4주 동안 발효한 소금 처리 더덕군(90.
- . 발효 더덕의 당대사 관련 효과를 분석하기 위하기 위해 C2C12 cell의 2-NBDG uptake를 분석하였다. 800 μg/mL의 concentration에서 소금 처리 후 4주간 발효한 더덕에서 발효 전 더덕과 비교하여 유의미한 차이를 보여 소금 처리 더덕이 발효 진행에 따라 그 효과가 증가한다는 것을 확인할 수 있었다.
- 발효 더덕의 미생물 분석을 위해 PCR-DGGE를 수행하였다. 샘플은 매주 PowerFoodTM Microbial DNA isolation kit (MoBio Laboratories Inc.
- 발효 진행을 알아보기 위해 더덕의 pH와 총 당 함량을 측정하였다. 발효 진행 중 산도는 증가하였다.
- 본 연구는 자연발효 더덕을 제조하여 발효 기간에 따른 더덕의 미생물 특성과 활성 물질 변화를 조사하였으며, 더불어 소금 처리에 따른 차이를 분석하였다. 더덕의 발효 진행 정도는 pH와 총 당 함량으로 알아보았다.
- 샘플은 매주 PowerFoodTM Microbial DNA isolation kit (MoBio Laboratories Inc., Carlsbad, CA, USA)를 사용, total DNA를 추출하였고, universal bacterial 16s rRNA gene primer인 27F (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)와 1492R (5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’)을 이용하여 nested-PCR을 수행하였다.
- C2C12 세포의 glucose uptake 측정을 위해 세포는 96 well plate에 2×103 cells/well의 양으로 seeding한 후 37℃ 배양기에서 plate에 48 hrs 배양하였다. 세포의 confluence가 90% 정도 되면 분화를 위해 2% horse serum (HS)이 첨가된 DMEM 배지로 교체했다. 매 2일마다 배지를 교환하고 6일 후 분화가 약 90% 정도 완료 시에 glucose-free DMEM에 2-NBDG 75 μg/mL가 포함된 배지로 교환한 후, 더덕 추출물, 양성 대조군인 metformin (2.
- . 이번 연구에서는 지질대사와 관련된 더덕의 효과를 알아보기 위해 HepG2 cell 세포에 FFA를 처리하여 Oil red O 염색을 통해 지방축적 양을 관찰하였다. 800 μg/mL에서 소금 처리 후 4주간 발효한 더덕에서 FFA 처리군과 비교하여 지방축적 양의 감소를 보이며 간세포에서의 지방축적 억제에 효과가 있는 것으로 확인되었다.
- , Daejeon, Korea)의 protocol을 변형하여 실시하였다. 잘라진 gel 무게의 3배의 ubiquitination을 첨가한 다음 4℃에서 overnight로 배양 후 protocol과 같은 방법으로 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA의 염기서열 분석은 Macrogen Inc.
- 제작된 gel에 2차 PCR 산물을 로딩하여 1XTris-acetate-EDTA buffer (60℃)에서 20 V로 30분간 전기영동 후 60 V로 60 hrs 전기영동하였다. 전기영동이 종료된 gel은 ethidium bromide로 염색 후 UV illumination (LAS-3000;Fuji photo film, Tokyo, Japan)을 사용하여 밴드를 확인하였다.
- 잘라진 gel 무게의 3배의 ubiquitination을 첨가한 다음 4℃에서 overnight로 배양 후 protocol과 같은 방법으로 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA의 염기서열 분석은 Macrogen Inc. (Seoul, Korea)에 의뢰하였으며, 분석된 염기서열은 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information)에서 Basic Local Alignment Search Tool 분석하여 동정하였다.
- 총 폴리페놀 함량 측정을 위해 13,000 rpm에서 5분간 원심분리한 샘플에서 상등액을 얻어 2% Na2CO3 1 mL에 샘플 50 μL와 50% Folin-ciocalteu’s phenol reagent (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) 50 μL를 혼합 후 실온에서 10분간 반응시켰다.
- 총 플라보노이드 함량 측정을 위해 500 μL의 샘플에 300 μL의 5% NaNO2를 혼합하여 5분간 반응시켰다.
- 85% NaCl로 희석하였다. 총균수 및 유산균은 각각 Trypticase Soy agar (TSA)(Difco, Sparks, MD, USA), De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) agar (Difco, Sparks, MD, USA)를 이용해 분석했다. 희석한 샘플은 100 μL씩 TSA와 MRS agar 배지에 분주하여 도말 후 37℃에서 48시간 동안 배양했다.
- 활성 물질의 변화를 알아보기 위해 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 총 폴리페놀은 발효 전 후 및 소금 처리와 관련하여 유의미한 차이를 보이지 않았다.
대상 데이터
- C2C12 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)는 Dulbeco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin-streptomycin (P/S)가 첨가된 배지에서 계대 배양했다.
- HepG2 세포는 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 분양받았으며, 세포는 DMEM에 10% FBS와 1% P/S를 첨가한 배지에 배양했다. 6 well platedp 4×105 cells/well의 양으로 seeding한 후 37℃, CO2배양기에 24시간 배양했다.
- 본 실험에는 강원도 횡성에서 생산된 더덕(Hoengseong-SanMaruDeoDok, Hoengseong, Korea)이 사용되었다. 대조군으로 사용된 더덕은 물로 불순물을 제거한 후 분쇄하여 사용되었으며, 소금 첨가군은 대조군과 동일한 더덕에 2.5% 천일염 추가 후 옹기에 보관하여 서늘하고 공기가 잘 통하는 곳에서 4주 동안 저온의 환경(1.4~33.2℃)에서 발효했다. 발효 중 100 g씩 매주 시료를 채취하여 -80℃에 보관 후 사용하였다.
- 본 실험에는 강원도 횡성에서 생산된 더덕(Hoengseong-SanMaruDeoDok, Hoengseong, Korea)이 사용되었다. 대조군으로 사용된 더덕은 물로 불순물을 제거한 후 분쇄하여 사용되었으며, 소금 첨가군은 대조군과 동일한 더덕에 2.
데이터처리
- 실험값들은 평균값±표준오차로 나타냈으며, one-way analysis of variance (ANOVA) test 또는 Student t-test를 통해 실험군 간의 통계분석을 시행하였다.
이론/모형
- 2차 PCR은 GC clamp가 부착된 GC338F (5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’)와 518R (5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)을 사용하여 수행하였다. PCR- DGGE는 D Code universal mutation detection system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 분석하였다. Denaturing gradients는 30~60% 범위로 농도 구배가 연속적으로 형성된 gel을 제작하여 사용하였다.
- 페놀-황산법을 이용하여 발효 중의 더덕의 총 당 함량을 측정했다. 0.
성능/효과
- 소금을 첨가하지 않은 더덕군에서는 Serratia species, Uncultured Klebsiella sp., Gluconobacter nephelii가 발효 1주와 비교하여 발효 4주까지 지속적으로 감소하였고, Asaia bogorensis는 증가하는 것으로 관찰되었다. Leuconostoc mesenteroides는 계속적으로 밴드에서 진하게 관찰되었다.
- 400 μg/mL에서는 유리지방산 처리군과 더덕 및 소금 처리 더덕군과의 차이가 관찰되지 않았으나, 800 μg/mL에서 유리지방산 처리군에 비해 4주 동안 발효한 소금 처리 더덕군(90.38%)의 지방축적 양이 유의하게 감소한 것으로 나타났다(P<0.05).
- 더덕의 발효 진행 정도는 pH와 총 당 함량으로 알아보았다. 4주간의 발효 진행에 따라 더덕 및 소금 처리 더덕의 pH가 감소하여 산도가 증가하는 것이 확인되었다. 총 당 함량은 4주의 발효 기간 동안 더덕 및 소금 처리 더덕에서 발효 기간이 경과함에 따라 감소하는 것이 확인되었다.
- 800 μg/mL에서 소금 처리 후 4주간 발효한 더덕에서 FFA 처리군과 비교하여 지방축적 양의 감소를 보이며 간세포에서의 지방축적 억제에 효과가 있는 것으로 확인되었다.
- 800 μg/mL의 concentration에서 소금 처리 후 4주간 발효한 더덕에서 발효 전 더덕과 비교하여 유의미한 차이를 보여 소금 처리 더덕이 발효 진행에 따라 그 효과가 증가한다는 것을 확인할 수 있었다.
- 소금을 첨가한 더덕군에서는 상대적으로 더 많은 미생물이 관찰되었는데, Weissella cibaria, Weissella confusa의 경우 발효 1주 이후 급격히 감소하는 것이 관찰되었고, Lactococcus lactis는 발효 1주 이후 감소하다가 3주경부터 다시 증가하는 양상이 관찰되었으며, Weissella koreensis의 경우 발효 2주까지 비슷하게 유지되다가 3주 후부터 급격히 감소하는 것이 관찰되었다. DGGE에서 12번에 있는 균주는 동정되지는 않았지만 Rahnella aquatilis와 함께 발효 2주까지는 거의 나타나지 않다가, 발효 3주째 급격히 증가 후 4주째 감소하는 것이 관찰되었다. RAPD-PCR에서는 더덕의 발효 진행에 따라 Lactobacillus plantarum이, 소금 처리 더덕의 발효 진행에 따라 L.
- , Uncultured Klebsiella sp. Gluconobacter nephelii는 감소하는 반면, Asaia bogorensis는 증가하는 경향을 보였다. 발효 기간 동안 Leu.
- koreensis의 생장에 영향을 미쳤을 것으로 사료된다. Weissella종들은 김치, 젓갈 등 한국 발효 음식에서 자주 보이는 균주로 소금 처리 후 발효 진행 시에만 균주가 추출되는 것이 확인되었다.
- mesenteroides는 밴드에서 꾸준하게 유지되는 경향을 보여 기존 발효 더덕 연구에서도 사용되었던13,15,16) Leu. mesenteroides가 발효에 큰 영향을 미쳤을 것임을 유추할 수 있었다. 반면 소금 처리 더덕 발효 중에 W.
- plantarum과 Leu. mesenteroides가 증가함이 관찰되었다(Fig. 4, Table 1).
- confuse, Lactococcus lactis는 발효 1주까지 유지되다가 발효 2주부터 급격하게 감소하였다. 김치에서 발견되는 유산균인 W. koreensis는 발효 2주까지 유지되다가 발효 3주부터 급격하게 감소하는 한편, Uncultured bacterium 및 Rahnella aquatilis는 발효 2주까지는 유지되다가 발효 3주부터 급격하게 증가함이 확인되었다. 발효에 가장 큰 영향을 미쳤을 것으로 사료되는 균주가 발효 기간 동안 밴드에서 진하게 유지되었으나 동정이 되지 않았다.
- 더덕의 발효에 따른 TSA의 RAPD-PCR 분석에서 발효가 진행되어 감에 따라 대조군과 소금 처리군에서 모두 L. plantarum이 증가하는 것이 확인되었고 MRS 분석에서는 대조군에서는 L. plantarum이 증가하는 반면, 소금 처리 더덕에서는 L. plantarum과 함께 Leu. mesenteroides가 함께 관찰되었다.
- 더덕의 발효 동안의 생균수 변화를 알아보기 위해 총균수 및 유산균 수를 측정하였다. 더덕의 총균수 및 유산균은 발효가 진행됨에 따라 2주에서 가장 많이 측정되었고, 4주가 되어감에 따라 감소하는 것이 관찰되었다. 이는 W.
- 또한 이를 발효 전(94.47%)과 비교했을 때, 4주간 발효 시(90.38%) 지방 축적량이 유의하게 감소하여(P<0.01) 발효 후 지방 억제 효능이 증가했음을 알 수 있었다(Fig. 6).
- mesenteroides와 같은 유산균에 의해 진행되는 것으로 유추된다. 발효 기간에 따라 pH 및 총 당 함량이 변하였으며, 발효 후 폴리페놀과 플라보노이드 등 활성 물질이 증가하였다. 지질 대사 및 당 대사 관련 효과는 800 μg/mL에서 소금 처리하여 4주간 발효한 더덕에서 두드러지는 것으로 확인되었다.
- 발효 기간에 따른 glucose uptake의 차이는 타 군에서는 관찰되지 않았으나, 800 μg/mL에서 소금 처리 더덕의 발효 전(106.80%)과 비교하였을 때, 4주간 발효 시(120.37%) glucose uptake가 유의미하게 증가하여(P<0.01) 근육세포에서의 당처리능이 증가했음을 알 수 있었다(Fig. 5).
- 총 당 함량은 4주의 발효 기간 동안 더덕 및 소금 처리 더덕에서 발효 기간이 경과함에 따라 감소하는 것이 확인되었다. 발효균은 당을 주요 에너지원으로 하여 발효를 진행시키며, 그 과정에서 pH가 떨어진다는 사실로 미루어 보아 더덕에서 발효가 일어났음을 유추할 수 있었다.
- 분석 결과, 400 μg/mL에서는 더덕 및 소금 처리 더덕에서 glucose uptake의 차이가 관찰되지 않았다.
- Leuconostoc mesenteroides는 계속적으로 밴드에서 진하게 관찰되었다. 소금을 첨가한 더덕군에서는 상대적으로 더 많은 미생물이 관찰되었는데, Weissella cibaria, Weissella confusa의 경우 발효 1주 이후 급격히 감소하는 것이 관찰되었고, Lactococcus lactis는 발효 1주 이후 감소하다가 3주경부터 다시 증가하는 양상이 관찰되었으며, Weissella koreensis의 경우 발효 2주까지 비슷하게 유지되다가 3주 후부터 급격히 감소하는 것이 관찰되었다. DGGE에서 12번에 있는 균주는 동정되지는 않았지만 Rahnella aquatilis와 함께 발효 2주까지는 거의 나타나지 않다가, 발효 3주째 급격히 증가 후 4주째 감소하는 것이 관찰되었다.
- 실험값들은 평균값±표준오차로 나타냈으며, one-way analysis of variance (ANOVA) test 또는 Student t-test를 통해 실험군 간의 통계분석을 시행하였다. 실험 결과의 통계적 유의성은 P값이 0.05 이하인 경우 유의한 것으로 보았다.
- 지질 대사 및 당 대사 관련 효과는 800 μg/mL에서 소금 처리하여 4주간 발효한 더덕에서 두드러지는 것으로 확인되었다. 여러 결과를 종합해 봤을 때, 4주가 최적의 발효 조건이라 사료되며 소금을 처리하여 발효하였을 때, 그 효과가 극대화되는 것으로 사료된다. 본 연구는 처음으로 더덕의 자연 발효 및 소금 처리 자연 발효 특성을 분석했다는 점에서 의의가 있다.
- 지질 대사 및 당 대사 관련 효과는 800 μg/mL에서 소금 처리하여 4주간 발효한 더덕에서 두드러지는 것으로 확인되었다.
- 4주간의 발효 진행에 따라 더덕 및 소금 처리 더덕의 pH가 감소하여 산도가 증가하는 것이 확인되었다. 총 당 함량은 4주의 발효 기간 동안 더덕 및 소금 처리 더덕에서 발효 기간이 경과함에 따라 감소하는 것이 확인되었다. 발효균은 당을 주요 에너지원으로 하여 발효를 진행시키며, 그 과정에서 pH가 떨어진다는 사실로 미루어 보아 더덕에서 발효가 일어났음을 유추할 수 있었다.
- 폴리페놀과 플라보노이드는 이전 항산화 연구에서 지표로 사용된 바 있다14). 총 폴리페놀 및 플라보노이드는 더덕 및 소금 처리 더덕에서 발효 4주 동안 증가하였으며, 발효가 활성 성분의 증폭에 영향을 미침을 확인할 수 있었다.
- 총 플라보노이드의 경우 발효 전 더덕 및 소금 처리 더덕의 총 플라보노이드는 각각 0.97 mg/g, 1.21 mg/g로 P<0.01에서 통계적 유의성이 있었고, 발효 4주 경과 후 대조군 및 소금 처리 더덕의 총 폴리페놀은 각각 1.78 mg/g, 2.31 mg/g으로 0.53 mg/g의 차이를 보였으나 통계적 유의성을 보이지 않았다(Fig. 2B).
- 발효 경과에 따른 미생물의 생균수를 측정하였다. 총균수와 유산균 수는 더덕군에서 2주에서 최고치를 보였으나 4주까지 발효가 진행됨에 따라 감소하는 양상이 관찰되었고, 소금 처리군에서는 발효가 진행됨에 따라 4주까지 증가하는 양상을 보였다. 총균수에서 발효 전 더덕군과 소금 처리군은 각각 7.
후속연구
- plantarum이 추가적으로 발효에 관여했으며, 앞으로 Leu. mesenteroides 이외에도 L. plantarum과 같은 다양한 미생물을 이용한 발효 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.
- 하지만 소금 처리 시에 온도나 농도를 엄격히 통제하지 못했다는 점에서 그 한계가 있다. 추후 발효 더덕의 제조를 위한 유산균 연구와, 자연 발효 및 소금 처리 발효에 대한 구체적 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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