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문제 정의
- ABA는 밀 종자의 휴면과 발아에 영향을 주는 중요한 호르몬이지만, 발아 과정 중에 배아에서 ABA와 반응하여 어떤 단백질이 증가하거나 감소하는지에 대한 연구는 거의 없다. 따라서 본 연구는 ABA가 밀에서 발아와 발아 종자의 배아 내의 단백질체 발현에 미치는 영향을 조사하고 생리적 특성을 이해하고자 수행하였다.
제안 방법
- 2DGE 젤의 단백질 spot에 대한 양적 분석은 ImageMaster 2D platinum software (ver. 7.0, GE Healthcare)를 사용하여 실시하였다.
- 5 W/gel로 전기영동한 이후 5시간동안 10 W/gel로 유지하여 수행하였다. 2DGE가 완료된 젤의 단백질 spot은 coomassie brilliant blue (CBB) R-250을 사용하여 염색하였으며, 염색된 2DGE 젤을 스캐닝하여 TIFF 파일로 저장하였다. 2DGE 젤의 단백질 spot에 대한 양적 분석은 ImageMaster 2D platinum software (ver.
- 농축된 추출액은 10% 메탄 올 1 ml에 재현탁시켜 ABA 측정용 시료로 이용하였다. ABA 함량은 Phytodetek ABA Test Kit (Agdia)를 이용하여 405 nm에서 측정된 흡광도를 이용하여 조사하였다(Walker-Simmons, 1987).
- 0% IPG buffer)으로 재수화시켰다. IPG strip gel에 부하된 단백질의 IEF는 IPGphor unit (GE-Healthcare)을 이용하여 수행하였으며 최종 70,000 Vh가 되도록 설정하였다.
- Table 3. Identification of the differentially expressed protein spots on 2DGE gel by using MALDI TOF/TOF mass spectrometer and LC/ESI ion trap mass spectrometer. Fold difference information of the protein spots at 50 μM ABA was displayed relative to that at 0 μM ABA.
- 각각의 시료는 trichloroacetic acid (TCA)/acetone extraction buffer[10% TCA, 0.07% 2-mercaptoethanol]를 이용하여 –20℃에서 1시간동안 배양하면서 단백질 이외의 불순물을 제거하였다.
- 단백질 spot에 대한 양적 분석결과, 0 μM ABA와 비교하여 50 μM ABA 처리에서 단백질 발현양이 0.8배 이하로 감소하거나 1.2배 이상으로 증가한 단백질 spot을 선정하여 질량분석 및 동정을 수행하였다.
- 0, GE Healthcare)를 사용하여 실시하였다. 단백질 spot의 상대값 (% volume)은 전체 단백질 spot의 발현양에 대한 개별 단백질 spot의 발현양으로 계산하였으며, 독립적으로 작성된 젤 이미지를 1반복으로 하여 3회 반복 수행하였다. 단백질 spot에 대한 양적 분석결과, 0 μM ABA와 비교하여 50 μM ABA 처리에서 단백질 발현양이 0.
- , 2008). 단백질을 1차원적으로 분리시키는 등전점 전기영동(isoelectric focusing, IEF)은 IPG (immobilized pH gradient, pH 4-7, 24 ㎝) strip gel을 이용하여 실시하였다. IPG strip gel은 상온에서 15시간 동안 단백질 추출액이 포함된 용액(2.
- 20℃의 암조건에서 0 μM 또는 50 μM ABA로 7일 동안 배양하여 발아한 종자를 채취하여 –80℃에서 보관하였다. 발아한 종자는 동결건조 시키고 유근과 유아를 제거하여 배아를 적출하였다. 적출된 배아는 즉시 액체질소를 이용하여 마쇄하고 –80℃에 보관하였다.
- 선발된 밀 품종 종자의 ABA 농도에 따른 발아지수와 발아율은 반복당 종자 30립씩 6반복으로 조사하였다. 일회용 발아접시(직경 100 mm × 높이 15 mm)에 여과지 1장을 깔고 종구를 아래로 향하도록 종자를 치상한 다음, 0, 10, 30 및 50 μM의 ABA (s-(+)-abscisic acid, Tokyo Chemical) 용액을 5 ml씩 첨가하여 뚜껑이 열리지 않도록 점착 테이프로 밀봉하였다.
- 성숙한 밀 종자와 배아는 ABA 민감성에 따라 50 μM ABA에서 발아율이 각각 약 30%와 약 90%로 큰 차이를 보이므로(Walker-Simmons, 1987), 본 시험은 0, 10, 30 및 50 μM ABA에서 발아와 관련된 특성을 조사하였다.
- 2% Triton X-100, EDTA-free proteinase inhibitor, 50 mM dithiothreitol (DTT)]로 용해시켰으며, 원심분리하여 얻은 상징액을 2DGE용 단백질 시료로 사용하였다. 시료는 ProteoExtractTM Protein Precipitation Kit (Calbiochem)을 이용하여 다시 정제하였고, 2-D Quant Kit (GE Healthcare)로 단백질 농도를 측정하였다(Kim et al., 2012).
- , 2012). 유아 및 유근 길이는 20℃에서 암조건으로 7일 동안 발아한 균일한 유묘를 선별하여 조사하였다.
- 일회용 발아접시(직경 100 mm × 높이 15 mm)에 여과지 1장을 깔고 종구를 아래로 향하도록 종자를 치상한 다음, 0, 10, 30 및 50 μM의 ABA (s-(+)-abscisic acid, Tokyo Chemical) 용액을 5 ml씩 첨가하여 뚜껑이 열리지 않도록 점착 테이프로 밀봉하였다.
- 질량분석은 한국기초과학지원연구원의 MALDI TOF/TOF mass spectrometer와 LC/ESI ion Trap mass spectrometer로 수행하였고, 단백질 spot별 MS spectrum 정보는 MASCOT 소프트웨어(Matrix Science, London, U.K.)를 이용하여 NCBInr과 SwissProt의 식물 단백질 database에서 검색하였다.
- 젤은 50 mM NH4HCO3에서 100 ng/μL 트립신을 이용하여 재수화시켰고, 37℃에서 약 16시간 분해시켰다. 트립신 펩티드는 50 mM NH4HCO3와 0.1% trifluoroacetic acid (TFA)를 함유한 50% acetonitrile에서 추출하여 질량을 분석하였다.
- 한국의 밀 품종 중에서 발아지수가 각각 0.94, 0.61, 및 0.07로서 종자 휴면성의 차이가 큰 백중밀, 금강밀 및 우리밀을 시험재료로 이용하여 후숙한 종자의 발아와 발아 종자 중의 단백질체 발현에 미치는 abscisic acid (ABA)의 영향을 조사하였다. 시험 재료로 이용된 3품종의 밀은 전라북도 완주군 소재 농촌진흥청 국립식량과학원 밭작물 시험포장에서 농촌진흥청의 맥류 표준재배법에 준하여 재배하였다.
대상 데이터
- 07로서 종자 휴면성의 차이가 큰 백중밀, 금강밀 및 우리밀을 시험재료로 이용하여 후숙한 종자의 발아와 발아 종자 중의 단백질체 발현에 미치는 abscisic acid (ABA)의 영향을 조사하였다. 시험 재료로 이용된 3품종의 밀은 전라북도 완주군 소재 농촌진흥청 국립식량과학원 밭작물 시험포장에서 농촌진흥청의 맥류 표준재배법에 준하여 재배하였다. 종자는 2015년 10월 중순에 파종하였고, 성숙한 종자는 2016년 6월에 수확하였다.
- 시험 재료로 이용된 3품종의 밀은 전라북도 완주군 소재 농촌진흥청 국립식량과학원 밭작물 시험포장에서 농촌진흥청의 맥류 표준재배법에 준하여 재배하였다. 종자는 2015년 10월 중순에 파종하였고, 성숙한 종자는 2016년 6월에 수확하였다. 수확한 종자는 상온의 실험실에서 보관하여 후숙시켰고 당해 연도 11월에 시험에 사용하였다.
- 밀 종자를 20℃의 암조건에서 0 μM 또는 50 μM ABA로 4일 동안 발아시킨 후 생장이 균일한 유묘를 채취하여 -80℃에 보관하였다. 채취된 발아 종자를 동결건조하고 유아와 유근을 제거한 다음 배아를 적출하고 액체질소로 마쇄하여 약 100 mg의 분말시료를 준비하여 단백질 추출용 시료로 이용하였다. 각각의 시료는 trichloroacetic acid (TCA)/acetone extraction buffer[10% TCA, 0.
- 07% 2-mercaptoethanol, 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), EDTA-free proteinase inhibitor]를 이용하여 정제하였고, 펠렛을 상온에서 30분 이내로 건조시켰다. 펠렛 상태의 단백질을 lysis buffer[LBTT: 7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 18 mM Tris-HCl (pH 8.0), 14 mM Tris, 0.2% Triton X-100, EDTA-free proteinase inhibitor, 50 mM dithiothreitol (DTT)]로 용해시켰으며, 원심분리하여 얻은 상징액을 2DGE용 단백질 시료로 사용하였다. 시료는 ProteoExtractTM Protein Precipitation Kit (Calbiochem)을 이용하여 다시 정제하였고, 2-D Quant Kit (GE Healthcare)로 단백질 농도를 측정하였다(Kim et al.
데이터처리
- 처리평균간 유의성은 Duncan’s multiple range test로 검정하였다.
- 통계분석은 R (3.4.1) 프로그램을 이용하여 성적의 분산 분석(ANOVA)과 T-검정(T-test)을 실시하고 처리평균간 유의성을 검정하였다. 처리평균간 유의성은 Duncan’s multiple range test로 검정하였다.
이론/모형
- 추출된 단백질체는 2DGE 방법을 이용하여 젤 내에서 공간적으로 분리시켰다(Westermeier et al., 2008). 단백질을 1차원적으로 분리시키는 등전점 전기영동(isoelectric focusing, IEF)은 IPG (immobilized pH gradient, pH 4-7, 24 ㎝) strip gel을 이용하여 실시하였다.
성능/효과
- 1. 백중밀, 금강밀, 우리밀 등 3품종의 0, 10, 30 및 50 μM ABA에서의 평균 발아지수와 발아율은 각각 0.95와 98% 이상으로 통계적으로 유의한 차이가 없었다.
- 2. 3품종 배아의 평균 ABA 함량은 0 μM ABA와 50 μM ABA에서 각각 0.78 ng/mg과 269.04 ng/mg으로서 농도에 따른 ABA 함량의 차이가 컸다.
- 3. 0 μM ABA 처리구에 비하여 50 μM ABA 처리구에서 발현양이 증가한 단백질 spot (S1, S3, S4, S6, S15, S16, S17)은 7개였으며, 감소한 단백질 spot (S2, S5, S9, S10, S11, S12, S13, S14, S18)은 8개였고, 증가와 감소가 동시에 이루어진 단백질 spot (S2)은 1개였다.
- 3품종의 밀 배아에서 검출된 spot들의 분포 양상은 품종 및 0 μM ABA와 50 μM ABA 처리 간에 명확한 차이를 보였다.
- 3품종의 평균 발아지수와 발아율은 0, 10, 30 및 50 μM ABA에서 각각 0.95 이상과 98% 이상이었으며, 발아지수와 발아율 모두 처리 농도 간에 통계적으로 유의한 차이가 없었다.
- 4. 각 단백질 spot의 0 μM ABA 처리구 양에 대한 50 μM ABA 처리구 양의 평균 배수 값(fold 값)이 1.5배 이상으로 증가한 단백질 spot은 S1 (globulin-3A), S6 (globulin-1 S allele), S16 (globulin-1 S allele), S17 (globulin-1 S allele) 등으로 모두 globulin류 단백질이었다.
- 5. 각 단백질 spot의 0 μM ABA 처리구 양에 대한 50 μM ABA 처리구 양의 평균 배수 값(fold 값)이 0.7 이하로 감소한 단백질 spot은 S10 (glutamine sysnthetase cytosolic isozyme), S12 (S-adenosylmethionine synthetase 2), S14 (isocitrate dehydrogenase NADP)이었다.
- 따라서 50 μM ABA 처리구에서 SAMS의 발현이 감소되어 메틸기 전이활성이 저하되고, 이에 따라 폴리아민 생합성이 감소되어 유아와 유근의 생장이 현저히 억제된 것으로 생각된다.
- 배아의 ABA 함량은 0 μM ABA에서는 백중밀, 금강밀 및 우리밀이 각각 0.76, 0.74 및 0.83 ng/mg이었고, 50 μM ABA에서는 백중밀, 금강밀 및 우리밀이 각각 287.41, 222.77 및 296.94 ng/mg으로 처리농도 및 품종 간에 통계적으로 유의한 차이를 보였는데, 금강밀이 다른 품종보다 다소 낮았다.
- 유아와 유근의 생장은 0 μM ABA보다 10, 30 및 50 μM ABA에서 생장이 크게 억제되었는데, ABA 농도가 높을수록 생장이 더 억제되었다.
- 이상의 결과는 ABA에 의한 밀 유묘의 유아와 유근의 생장억제는 배아에서의 ABA 농도 증가, 그리고 이에 따른 배아의 glutamine 합성에 관여하는 다양한 효소의 발현 감소 및 메틸기공여물질의 감소와 이에 따른 메틸기 전이활성의 감소 등이 관여하고 있음을 의미한다. 한편 배아에서의 ABA에 의한 globulin 단백질의 증가는 배아 특이적 globulin의 일시적 합성 증가와 globulin 분해 효소의 활성 억제 등이 복합적으로 관여한 결과로 생각된다.
- 각 단백질 spot은 0 μM ABA 처리구와 비교하여 50 μM ABA 처리구에서 변화된 양을 평균 배수 값(fold 값)으로 표시하였다. 평균 fold 값이 1.5 이상으로 증가한 단백질 spot은 S1 (globulin-3A), S6 (globulin-1 S allele), S16 (golbulin-1 S allele) 및 S17 (globulin-1 S allele)이었고, 이들은 모두 globulin에 속하는 단백질이었다. 또한 ABA 처리구에서만 확인된 단백질 spot인 S7 (globulin 3)과 S8 (globulin-1 S allele)도 globulin 단백질이었다.
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