여드름균에 의해 염증 반응이 유도된 인간 단핵구 세포에서 알칼로이드 화합물 berberine의 항염증 효과 The protective effect of berberine on Propionibacterium acnes-induced inflammatory response in human monocytes원문보기
본 연구에서는 인간 단핵구 세포인 THP-1 세포를 이용하여 berberine의 항염증 활성을 조사 하였다. Propionibacterium acnes의 감염은 THP-1 세포에서 산화질소(NO)와 $TNF-{\alpha}$, IL-8 및 $IL-1{\beta}$와 같은 전 염증성 사이토카인의 생산을 유도했다. 그러나, P. acnes에 의해 유도된 THP-1 세포에 berberine을 처리했을 때, 전 염증성 사이토카인 및 NO의 생성이 유의하게 감소하였다. 또한 우리는 berberine의 항 염증 기능의 신호 전달 경로를 분석하여 berberine이 P. acnes 유도 세포에서 ERK1/2, JNK 및 p38의 인산화를 억제하고 $NF-{\kappa}B$ p65의 발현 및 핵이동을 억제한다는 것을 발견했다. 이러한 결과로부터 berberine은 인간 단핵구 세포에서 $NF-{\kappa}B$ 및 MAPK 신호 전달 경로를 억제함으로써 항 염증 활성을 효과적으로 발휘할 수 있다고 결론지었다. 또한, 이러한 결과는 P. acnes에 의해 유발된 염증성 질환의 치료를 위해 천연물 소재에서 유래한 알칼로이드 화합물인 berberine을 사용하여 천연 치료제를 개발할 수 있는 가능성을 제시하였다.
본 연구에서는 인간 단핵구 세포인 THP-1 세포를 이용하여 berberine의 항염증 활성을 조사 하였다. Propionibacterium acnes의 감염은 THP-1 세포에서 산화질소(NO)와 $TNF-{\alpha}$, IL-8 및 $IL-1{\beta}$와 같은 전 염증성 사이토카인의 생산을 유도했다. 그러나, P. acnes에 의해 유도된 THP-1 세포에 berberine을 처리했을 때, 전 염증성 사이토카인 및 NO의 생성이 유의하게 감소하였다. 또한 우리는 berberine의 항 염증 기능의 신호 전달 경로를 분석하여 berberine이 P. acnes 유도 세포에서 ERK1/2, JNK 및 p38의 인산화를 억제하고 $NF-{\kappa}B$ p65의 발현 및 핵이동을 억제한다는 것을 발견했다. 이러한 결과로부터 berberine은 인간 단핵구 세포에서 $NF-{\kappa}B$ 및 MAPK 신호 전달 경로를 억제함으로써 항 염증 활성을 효과적으로 발휘할 수 있다고 결론지었다. 또한, 이러한 결과는 P. acnes에 의해 유발된 염증성 질환의 치료를 위해 천연물 소재에서 유래한 알칼로이드 화합물인 berberine을 사용하여 천연 치료제를 개발할 수 있는 가능성을 제시하였다.
In this study, we investigated the anti-inflammatory activity of berberine using human monocytes. Infection of Propionibacterium acnes induced the production of nitric oxide (NO) and the pro-inflammatory cytokines such as, $TNF-{\alpha}$, IL-8 and $IL-1{\beta}$ in THP-1 monocyt...
In this study, we investigated the anti-inflammatory activity of berberine using human monocytes. Infection of Propionibacterium acnes induced the production of nitric oxide (NO) and the pro-inflammatory cytokines such as, $TNF-{\alpha}$, IL-8 and $IL-1{\beta}$ in THP-1 monocytic cells. However, when berberine was supplemented in these P. acnes-induced THP-1 cells, the production of pro-inflammatory cytokines and NO was significantly reduced. We also analyzed signaling pathways of the antiinflammatory function of berberine and found that berberine suppressed the phosphorylation of ERK1/2, JNK and p38 and the expression and nuclear translocation of $NF-{\kappa}B$ p65 in the P. acnes-induced cells. From these results, we concluded that berberine can effectively exert the anti-inflammatory activity via suppressing the $NF-{\kappa}B$ and mitogen-activated protein kinases signaling pathways in human monocytes. Moreover, these results suggest the feasibility of developing natural therapeutics using berberine for the treatment of P. acnes-induced inflammatory diseases.
In this study, we investigated the anti-inflammatory activity of berberine using human monocytes. Infection of Propionibacterium acnes induced the production of nitric oxide (NO) and the pro-inflammatory cytokines such as, $TNF-{\alpha}$, IL-8 and $IL-1{\beta}$ in THP-1 monocytic cells. However, when berberine was supplemented in these P. acnes-induced THP-1 cells, the production of pro-inflammatory cytokines and NO was significantly reduced. We also analyzed signaling pathways of the antiinflammatory function of berberine and found that berberine suppressed the phosphorylation of ERK1/2, JNK and p38 and the expression and nuclear translocation of $NF-{\kappa}B$ p65 in the P. acnes-induced cells. From these results, we concluded that berberine can effectively exert the anti-inflammatory activity via suppressing the $NF-{\kappa}B$ and mitogen-activated protein kinases signaling pathways in human monocytes. Moreover, these results suggest the feasibility of developing natural therapeutics using berberine for the treatment of P. acnes-induced inflammatory diseases.
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문제 정의
MAPK 신호경로는 염증반응의 조절에 중요한 역할을 하므로 본 연구에서도 P. acnes로 자극된 THP-1 세포에서 berberine에 의해서 MAPK 신호경로가 영향을 받는지 조사하였다[23] (Fig. 3). 열처리한 P.
acnes의 감염에 의해 유발되는 염증반응에 대한 berberine의 항염증 활성은 아직 포괄적으로 연구되지 못했다. 따라서 본 연구에서는 인간 단핵구 세포(human leukemia monocytic cell)인 THP-1 세포에 여드름균인 P. acnes를 처리하여 염증반응을 유도하고 여기에 berberine을 처리했을 때 염증 매개체 및 염증성 사이토카인의 생성 억제 효과를 조사하였다. 또한 P.
이러한 결과로부터 berberine은 인간 단핵구 세포에서 NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로를 억제함으로써 항 염증 활성을 효과적으로 발휘할 수 있다고 결론지었다. 또한, 이러한 결과는 P. acnes에 의해 유발된 염증성 질환의 치료를 위해 천연물 소재에서 유래한 알칼로이드 화합물인 berberine을 사용하여 천연 치료제를 개발할 수 있는 가능성을 제시하였다.
본 연구에서는 인간 단핵구 세포인 THP-1 세포를 이용하여 berberine의 항염증 활성을 조사 하였다. Propionibacterium acnes의 감염은 THP-1 세포에서 산화질소(NO)와 TNF-α, IL-8 및 IL-1β와 같은 전 염증성 사이토카인의 생산을 유도했다.
acnes에 의해 유도된 NO 및 염증성 사이토카인의 생산을 억제하여 강력한 항염증 활성을 나타냈다. 이러한 결과는 천연물 소재에서 유래한 알칼로이드 화합물인 berberine을 P. acnes와 같은 여드름균의 감염으로 인해 유발된 염증성 질환의 치료를 위해 활용할 수 있는 천연치료제를 개발할 수 있는 가능성을 제시하였다. Berberine은 현재 국내 유수 제약회사에서 시판하는 정장제에 장내 방부살균제 성분으로 사용되고 있으며 또한 berberine을 함유하는 추출물 형태의 건강보조식품으로 국내외의 시장에서 판매되고 있다.
제안 방법
Berberine was treated with the indicated concentrations (0, 1, 5, 10, 25, 50, 100 and 200 μM) for 24 h.
P. acnes균으로 자극된 THP-1 세포에 berberine을 처리한 후 4% paraformaldehyde로 15분간 고정하였다. 0.
Primary antibody(Cell Signaling Technology)를 4 ℃에서 overnight 동안 반응한 후 TBST로 10분간 3회 세척하고 HRP-conjugated secondary antibody (Cell Signaling Technology)로 1시간 동안 실온에서 반응하였다.
다양한 농도(1, 5, 10, 25, 50, 100, 200 μM)의 berberine을 THP-1 세포에 24시간 동안 처리한 후 MTT 분석을 통하여berberine의 세포독성을 테스트하였다(Figs. 1A, B).
Primary antibody(Cell Signaling Technology)를 4 ℃에서 overnight 동안 반응한 후 TBST로 10분간 3회 세척하고 HRP-conjugated secondary antibody (Cell Signaling Technology)로 1시간 동안 실온에서 반응하였다. 단백질 밴드는 ECL kit (Biosesang, Gyeonggi, Korea)로 발광시키고 ChemiDoc (Bio-rad, Hercules, CA, USA)을 이용해 확인하였다[14].
따라서 본 연구에서도 phospho-IκB 및 phospho-NF-κB p65의 발현 수준을 분석하였다(Fig. 3B).
생성된 NO는 과산화물 라디칼과 반응하여 과산화수소 이온을 생성하며, 그 결과 다양한 유해한 염증성 상태를 야기한다. 따라서, 우리는 P. acnes로 자극된 THP-1 세포에서 berberine의 처리를 통해 NO 생산이 억제되는지의 여부를 조사하였다(Fig. 1C). Fig.
acnes를 처리하여 염증반응을 유도하고 여기에 berberine을 처리했을 때 염증 매개체 및 염증성 사이토카인의 생성 억제 효과를 조사하였다. 또한 P. acnes의 자극에 의한 염증반응에서 berberine에 의한 염증 보호 메커니즘을 분석하였다.
acnes의 처리는 Western blot analysis와 같은 방법으로 수행하였다. 세포 배양 후 상층 액을 이용하여 ELISA 분석을 수행하였다. Capture antibody(TNF-α, IL-8, IL-1β)를 1×PBS에 1/200로 희석한 뒤 96-well plate에 각각 200 μL씩 분주하여 넣고 12시간 동안 4℃에서 반응하였다.
염증반응을 매개하는 전 염증성 사이토카인과 매개체들의 조절은 중요한 전사인자인 NF-κB와 연관되어 있으므로 berberine이 P. acnes로 자극된 THP-1 세포에서 NF-κB의 발현을 억제하는지 여부를 조사하였다(Fig. 3).
이러한 결과로부터 우리는 THP-1 단핵구 세포에서 P. acnes에 의한 염증반응을 억제하는 berberine의 항염증 활성을 측정할 때 비교적 낮은 세포독성을 나타내는 25 및 50 μM의 농도의 berberine을 사용하기로 결정하였다.
대상 데이터
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), Griess reagent 및 berberine chloride (PHR1502)는 SigmaAldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 항체는 Abcam(Cambridge, MA, USA) 및 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
P. acnes는 한국생물자원센터에서 분양받아 BBL Gas-Pak 시스템 (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA)을 이용하여 구축한 혐기성 조건 하에서 reinforced clostridial medium (Difco, Detroit, MI, USA)을 사용하여 배양하였다. 인간 THP-1 단핵구 세포는 미국생물자원센터(American Type Culture Collection, ATCC) (Manassas, VA, USA) 에서 구매하여 RPMI1640 배지에 10% inactivated fetal bovine serum (HyClone Laboratories, Logan, UT, USA)과 1% penicillin/streptomycin을 첨가하여 37 ℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
acnes는 한국생물자원센터에서 분양받아 BBL Gas-Pak 시스템 (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA)을 이용하여 구축한 혐기성 조건 하에서 reinforced clostridial medium (Difco, Detroit, MI, USA)을 사용하여 배양하였다. 인간 THP-1 단핵구 세포는 미국생물자원센터(American Type Culture Collection, ATCC) (Manassas, VA, USA) 에서 구매하여 RPMI1640 배지에 10% inactivated fetal bovine serum (HyClone Laboratories, Logan, UT, USA)과 1% penicillin/streptomycin을 첨가하여 37 ℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. Berberine chloride의 세포독성은 MTT assay 방법으로 측정하였다[14,15].
Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 항체는 Abcam(Cambridge, MA, USA) 및 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
각 군 간의 비교를 위해 one way analysis of variance를 실시하였으며, Tukey’s multiple comparison test를 이용하여 대조군과 실험군 사이의 유의성을 p <0.05 수준에서 분석하였다(*p <0.05; **p <0.01; ***p <0.001).
모든 실험은 3회 반복하여 실시하였고 평균±표준편차로 나타냈다.
모든 실험은 3회 반복하여 실시하였고 평균±표준편차로 나타냈다. 실험 결과 분석은 Graph pad Prism 5.0프로그램(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 통해 진행하였다. 각 군 간의 비교를 위해 one way analysis of variance를 실시하였으며, Tukey’s multiple comparison test를 이용하여 대조군과 실험군 사이의 유의성을 p <0.
이론/모형
인간 THP-1 단핵구 세포는 미국생물자원센터(American Type Culture Collection, ATCC) (Manassas, VA, USA) 에서 구매하여 RPMI1640 배지에 10% inactivated fetal bovine serum (HyClone Laboratories, Logan, UT, USA)과 1% penicillin/streptomycin을 첨가하여 37 ℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. Berberine chloride의 세포독성은 MTT assay 방법으로 측정하였다[14,15].
Berberine was treated with the indicated concentrations (0, 1, 5, 10, 25, 50, 100 and 200 μM) for 24 h. Cell viability was assayed using the tetrazolium MTT method. Data represent the mean ± SD of three independent experiments.
THP-1 세포의 배양 및 berberine과 P. acnes의 처리는 Western blot analysis와 같은 방법으로 수행하였다. 세포 배양 후 상층 액을 이용하여 ELISA 분석을 수행하였다.
반응 후 1% BSA를 포함하는 1×PBS 용액을 넣어준 후, 상온에서 1시간 동안 blocking 하였다. 이 후의 실험 방법은 ELISA kit (BioLegend, San Diego, CA, USA)에 제시되어있는 방법을 따라 수행하였다. 이 후 microplate reader (BioRad)를 이용하여 450 nm와 540 nm에서 흡광도를 측정하였다[16,17].
성능/효과
25 μM의 berberine을 처리했을 때는 p65 염색이 일부 여전히 핵에 남아있으므로 NF-κB의 핵 이동을 약간 억제하는 효과가 있음을 알 수 있으며 50 μM의 berberine을 처리했을 때는 핵에서의 p65 염색이 거의 나타나지 않았으므로 NF-κB p65의 핵 이동이 P. acnes만을 처리한 세포와 비교하여 극적으로 억제됨을 확인할 수 있었다(Figs. 4C, D).
1C). Fig. 1C에서 보듯이 P. acnes를 처리하여 THP-1 세포를 자극했을 때 자극하지 않은 정상 대조군에 비해 NO의 생성이 약 3배 정도 유의하게 증가하였으나 berberine을 처리했을 때 NO의 생성은 명백하게 저해되었다. 특히, berberine 50 μM을 처리했을 때 NO의 생성은 P.
P. acnes를 처리하여 THP-1 세포를 자극하였을 때 인산화된 형태인 phospho-IκB 및 phosphoNF-κB p65의 발현 수준은 P. acnes를 처리하지 않은 대조군과 비교했을 때 크게 증가되었다(Fig. 3B, lanes 2).
결론적으로, berberine은 THP-1 세포에서 NF-κB 및 MAPK 활성화 경로를 억제함으로써 P. acnes에 의해 유도된 NO 및 염증성 사이토카인의 생산을 억제하여 강력한 항염증 활성을 나타냈다.
그러나, 25 및 50 μM 농도의 berberine을 처리했을 때는 phospho-IκB 및phospho-NF-κB p65의 발현은 농도 의존적으로 현저하게 억제되었으며(Fig. 3, lanes 3과 4) 특히 50 μM의 berberine을 처리했을 때 IκB와 NF-κB p65의 인산화는 유의성 있게 억제되었다(Fig. 3, lanes 4).
Propionibacterium acnes의 감염은 THP-1 세포에서 산화질소(NO)와 TNF-α, IL-8 및 IL-1β와 같은 전 염증성 사이토카인의 생산을 유도했다. 그러나, P. acnes에 의해 유도된 THP-1 세포에 berberine을 처리 했을 때, 전 염증성 사이토카인 및 NO의 생성이 유의하게 감소하였다. 또한 우리는 berberine의 항 염증 기능의 신호 전달 경로를 분석하여 berberine이 P.
또한 우리는 berberine의 항 염증 기능의 신호 전달 경로를 분석하여 berberine이 P. acnes 유도 세포에서 ERK1/2, JNK 및 p38의 인산화를 억제하고 NF-κB p65의 발현 및 핵 이동을 억제한다는 것을 발견했다.
또한, berberine은 IκB의 인산화를 감소시켜 염증 매개체인 IL-8, TNF-α 및 IL-1β의 생성을 감소시키므로 berberine의 존재 하에서는 반대로 IκB 발현이 P. acnes를 처리하지 않은 정상 상태의 세포 수준으로 증가하고 있음을 알 수 있었다(Fig. 3B, IκB panel).
본 실험에서도 열처리한 P. acnes를 THP-1 세포에 처리했을 때 TNF-α, IL-1β 및 IL-8과 같은 전염증성 사이토카인의 발현 수준이 크게 증가함을 확인하였다(Figs. 2A-C).
본 연구에서도 P. acnes의 처리로 염증이 유도된 THP-1 세포에서 NF-κB p65의 변화를 면역 형광법으로 분석했을 때 NF-κBp65의 핵 이동 및 축적이 명확하게 일어남을 알 수 있었다(Figs. 4A, B).
3). 열처리한 P. acnes를 세포에 처리하였을 때 인산화 형태인 phospho-p38, phospho-ERK 및 phospho-JNK의 발현 수준은 유의하게 증가되었으나 berberine을 전 처리 한 후에는 phospho-p38, phospho-ERK 및 phospho-JNK의 발현 수준이 현저하게 감소하였다(Fig. 3A). 특히, ERK의 인산화는 50 μM berberine 처리에서 현저하게 억제되었으며, 또한 p38 및 JNK의 인산화는 berberine의 농도 의존적으로 억제되었다(Fig.
이러한 결과는 berberine이 P. acnes에 의해 유도된 NF-κB 관련 단백질의 발현 및 핵 전좌를 억제할 수 있으며 NF-κB 신호의 억제로 인해 전 염증성 사이토카인 및 염증성 매개체의 발현이 억제되며 궁극적으로 항염증 반응으로 이어질 수 있음을 제시하였다.
이러한 결과로부터 berberine은 인간 단핵구 세포에서 NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로를 억제함으로써 항 염증 활성을 효과적으로 발휘할 수 있다고 결론지었다.
특히, 25 및 50 μM 농도의 berberine 처리는 P. acnes로 자극된 THP-1 세포에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-8의 생성을 현저하게 억제시켰으며 이는 berberine이 전 염증성 사이토카인 및 케모카인의 생성을 조절함으로써 항염증 활성을 보인다는 것을 의미하고 있다.
특히, ERK의 인산화는 50 μM berberine 처리에서 현저하게 억제되었으며, 또한 p38 및 JNK의 인산화는 berberine의 농도 의존적으로 억제되었다(Fig. 3A).
특히, berberine 50 μM을 처리했을 때 NO의 생성은 P. acnes로 자극을 받은 세포에 비해 약 30% 정도까지 현저하게 감소되었으며 이러한 결과는 berberine이 강한 항염증 활성을 보유하고 있음을 의미한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
여드름(acne vulgaris)이란?
여드름(acne vulgaris)은 모공의 막힘이나 염증으로 인해 나타나는 매우 흔한 만성 피부 질환으로 전 세계의 6억6천만명 정도의 인구가 영향을 받는 세계에서 8번째로 가장 흔한 질병이며 심한 경우 환자의 삶의 질에 큰 영향을 미칠 수 있는 인체 질환 중 하나이다[1,2]. 여드름은 특히 호르몬의 불균형, 세균감염, 스트레스, 식품, 화장품 등 여러가지 요인에 의해 일어나며 과거에는 주로 사춘기 남녀에게 주로 발생하였으나, 환경오염, 약물남용 등으로 인하여 근래에는 나이와 상관없이 여드름이 나타나는 연령층이 넓어지고 있다[3].
염증성 피부질환과 관련된 TRL2 수용체의 주된 염증반응 경로는 무엇인가?
acnes의 상호작용에 의해 염증경로가 활성화되어 염증성 사이토카인 및 케모카인 등 다양한 염증중재자를 분비하고 피부자극을 유발하는 것으로 보고되었다[8,9]. TRL2 수용체를 통한 염증반응의 활성화는 주로 mitogen-activated protein kinases (MAPKs) 신호 경로와 nuclear factor (NF)-κB 신호 경로에 의해 수행되며 이 두 가지 경로를 통해 염증성 피부질환과 관련된 중요 염증관련 유전자의 발현이 조절되는 것으로 알려졌다[10].
Propionibacterium acnes가 주로 분포하는 곳은?
P. acnes는 그람 양성의 혐기성 세균으로 각질세포와 접촉되어 있는 모낭과 피지선 주위에 있는 세포에 주로 존재한다[6]. P.
참고문헌 (25)
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